Les enzymes lipolytiques à travers le monde vivant

Les enzymes lipolytiques à travers le monde vivant

Les enzymes lipolytiques sont très largement répandues dans le monde vivant. Le rôle de ces enzymes est très varié d’un règne à l’autre, d’une espèce à l’autre voire d’un tissu à l’autre (Pahoja and Sethar, 2002). A ce jour, ce sont les enzymes lipolytiques de micro-organismes qui ont été les plus étudiées de part leur important intérêt industriel. D’autres sources d’enzymes lipolytiques existent dans le règne animal et végétal. Elles peuvent présenter des applications intéressantes et être exploitées (Casas-Godoy et al., 2012). Les enzymes lipolytiques ont des caractéristiques variables selon les règnes. Par exemple, la zone de pH optimum de l’activité, varie entre 4 et 9 pour les enzymes lipolytiques de plantes alors qu’elle est comprise entre 5,5 et 8,5 chez les animaux et entre 6 et 10 chez les micro organismes.

Les enzymes lipolytiques végétales

Les principales enzymes lipolytiques de plantes se classent en trois catégories en fonction de leur origine. Elles peuvent être issues de plantes oléagineuses, de plantes céréalières et de plantes laticifères (produisant du latex). Ces enzymes se regroupent alors en quatre groupes principaux : les lipases, les phospholipases A, les phospholipases C et D, et les carboxylestérases.

Certaines enzymes ne sont pas spécifiques vis-à-vis d’un tissu et interviennent de manière générale dans le métabolisme. La plus grande concentration d’enzymes lipolytiques demeure au niveau des graines où les triglycérides sont stockés. Les enzymes lipolytiques présentes dans ces structures vont hydrolyser les triglycérides et libérer des acides gras. Ces acides gras seront la source d’énergie principale lors des étapes de germination et des premiers stades de croissance de la plante. Les premières enzymes lipolytiques de plantes ont été étudiées au début du XXe siècle, mais il faut attendre les années soixante pour que des études plus poussées apparaissent. Elles sont réalisées sur la lipase acide du ricin, Ricinus communis, en 1962. La plupart des lipases connues dans les graines sont des lipases alcalines, tandis que celle du ricin a la particularité d’agir à un pH optimum de 4,5. La seconde propriété importante de cette enzyme est le déclenchement particulier de son activité. En effet, celle-ci est détectée lors des deux premiers jours de croissance alors que la sénescence n’a pas encore commencé. L’activité de la plupart des autres lipases retrouvées dans les graines est observée au moins au troisième jour de croissance. Chez le ricin, la lipase acide semble à son maximum d’activité avant l’hydrolyse des triglycérides. Une autre lipase dont le pH optimum est neutre est présente chez cette espèce. Son activité est similaire aux lipases habituellement rencontrées dans les graines des autres plantes. Cette lipase semble intervenir pour l’hydrolyse des triglycérides au moment de la croissance de la plante (Ory and Altschul, 1962; Ory et al., 1969; Muto and Beevers, 1974). Le ricin possède également une protéine végétale ayant une activité lipolytique et le motif GXSXG sans être une lipase, la ricine. C’est une glycoprotéine parmi les plus toxiques au monde. Elle intervient notamment dans les mécanismes de défense des plantes dans leur environnement (Helmy et al., 1999; Lombard et al., 2001). Dans les années 1995-2000, l’abondance des séquençages de transcrits et le séquençage du génome d’Arabidopsis thaliana ont mis en évidence un grand nombre de lipases putatives. Ces annotations ont été uniquement basées sur le motif GXSXG. Or de nombreuses protéines présentant ce motif n’ont pas nécessairement une activité lipolytique (cas des ester hydrolases non lipolytiques). Le motif consensus GXSXG des lipases peut en effet être présent chez d’autres enzymes. Il apparait, par exemple, dans la chlorophyllase de la plante Chenopodium album, enzyme responsable de la dégradation de la chlorophylle (Tsuchiya et al., 1999). De plus, ce critère est insuffisant pour d’autres enzymes n’incluant pas ce motif mais possédant une activité lipolytique. L’analyse in silico nécessite donc en complément une recherche biochimique de l’activité lipolytique (Li-Beisson et al., 2010).

Pour caractériser les enzymes lipolytiques de plantes il est nécessaire de bien connaître les compartiments de stockage des lipides. Les triglycérides des feuilles sont stockés dans les plastoglobules. Les plastoglobules sont des corps lipidiques présents au niveau des chloroplastes, incorporant des lipoprotéines et permettant la mobilisation des triglycérides (Brehelin et al., 2007; Lin and Oliver, 2008). Padham et al. (2007) ont montré chez Arabidopsis thaliana la présence à ce niveau d’une lipase. D’autres études se focalisent sur les lipases des graines des oléagineux et particulièrement sur les lipases impliquées dans l’hydrolyse des triglycérides dans les tissus de réserve (oléosomes) du colza et du maïs (Yatsu and Jacks, 1972). La caractérisation de lipases de plantes a montré l’existence de plusieurs types de lipases. Les variations concernent le pH optimum et la localisation subcellulaire. Ces lipases sont présentes au niveau des corps lipidiques, des glyoxysomes ou encore des microsomes. Chez le colza, Brassica napus, c’est une lipase insoluble qui a été isolée, dans une fraction moins dense que les microsomes (Weselake et al., 1989).

Les phospholipases de plantes sont regroupées selon leurs rôles physiologiques et cellulaires tels que la régulation cellulaire, le changement de composition des lipides membranaires et la dégradation des lipides. Les phospholipases D sont particulièrement impliquées dans le catabolisme des phospholipides au moment de la croissance de la plante et en réponse à un stress de l’environnement. Ces phospholipases sont variées d’un point de vue moléculaire et leur présence peut être modulée notamment par du calcium (Wang, 2000). Les phospholipases C (PLC) sont séparées en deux grandes catégories, les PLC spécifiques des phosphoinositides et les PLC sans spécificité. Les premières sont majoritairement impliquées dans la production d’inositol triphosphate et leur activité est le plus souvent une réponse à un stimulus environnemental. Les secondes participent à des mécanismes plus classiques de dégradation de phospholipides (Wang, 2001; Wang et al., 2012). Les phospholipases A catalysent l’hydrolyse des phospholipides de la membrane cellulaire. Chez Arabidopsis thaliana elles se retrouvent en trois catégories, les protéines « patatin like », les enzymes « DAD like » et les phospholipases A2 sécrétées. Les protéines du type « patatin like » disposent d’une diade catalytique Ser-Asp à la place de la triade catalytique classique permettant une hydrolyse des positions sn-1et sn-2 des phospholipides et galactolipides. Les enzymes de déacylation « DAD-like » présentent notamment des activités de lipases (Canonne et al., 2011).

De nombreuses carboxylestérases ont été identifiées. Elles représentent une grande famille d’enzymes impliquées dans de nombreux processus, notamment au niveau du métabolisme secondaire chez les végétaux supérieurs. Cette famille identifiée CXE a été principalement décrite au sein d’Arabidopsis thaliana et d’Oryza sativa (Yu et al., 2002). Cette famille conserve un motif peptidique et une structure secondaire correspondant aux enzymes de la famille des α/β hydrolases. La caractérisation d’une majorité des carboxylestérases de plantes n’est pas aussi avancée que leurs homologues d’origine animale. Néanmoins, un certain nombre d’informations a été déterminé, notamment la localisation dans les graines, fruits et feuilles. L’isolement et la caractérisation des gènes de carboxylestérases chez la plante modèle Arabidopsis thaliana demeurent récents. Ils ont permis d’identifier un certain nombre de rôles physiologiques des carboxylestérases au sein de cette plante. Aucune enzyme n’a été clairement identifiée pour l’hydrolyse de lipides mais elles interviennent dans l’initiation de signalisations cellulaires. Les carboxylestérases apparaissent également dans des processus de dégradation de certains composés comme les xénobiotiques et les esters (Marshall et al., 2003). Plus récemment, le gène d’une carboxylestérase d’Actinidia eriantha a été isolé et cloné dans une bacterie. La protéine obtenue a été utilisée pour obtenir la première structure de carboxylestérase de plante. L’analyse de cette structure a conforté l’identification de l’enzyme dans la famille des α/β hydrolases et a également permis l’identification des acides aminés impliqués dans le site catalytique.

En complément de l’étude structurale, une caractérisation fonctionnelle a été réalisée confirmant la spécificité pour les faibles longueurs de chaînes (Ileperuma et al., 2007). Les thioestérases de plantes jouent un rôle important dans la composition des triglycérides des tissus de stockage. De ce fait, leurs caractéristiques sont largement étudiées. Elles sont considérées comme une famille d’enzymes à part dans les familles de thioestérases. En effet, peu de similarités de séquences existent avec les thioestérases des procaryotes et des animaux. La seconde différence majeure est le manque de sensibilité aux inhibiteurs connus des thioestérases bactériennes et animales. Ces inhibiteurs ciblent les protéases à sérine. L’analyse d’une séquence de thioestérase d’Arabidopsis thaliana montre que les trois acides aminés impliqués dans le site catalytique sont la cystéine 264, l’histidine 229 et l’asparagine 227. Une cystéine remplace donc la sérine dans la triade catalytique. Cette modification est confirmée par une diminution de l’activité de la thioestérase lors de l’utilisation d’inhibiteurs de protéases à cystéine. De plus, la substitution de la cystéine par une sérine a permis de retrouver une sensibilité aux inhibiteurs à sérine et une diminution de l’activité (Yuan et al., 1995). La conformation particulière de la thioestérase chez Arabidopsis thaliana a permis de définir les thioestérases à triade catalytique « papain like » (Turk et al., 1997; Cantu et al., 2010).

Les enzymes lipolytiques animales

Le domaine des enzymes lipolytiques animales étant vaste, ce sous-chapitre développera les études les plus importantes. Dans un premier temps, les lipases seront présentées. Les phospholipases, carboxylestérases et thioestérases seront traitées dans un second temps.

Lipases

Les graisses représentent chez les animaux une source énergétique importante. Les voies métaboliques utilisant cette source énergétique sont donc essentielles pour l’équilibre physiologique des organismes. Le modèle enzymatique de référence pour le règne animal est la lipase pancréatique (Hofmann and Borgstrom, 1963). Cependant, d’autres enzymes ont été largement étudiées comme la lipase gastrique et la lipase hépatique. La structure des gènes codant pour ces enzymes laisse supposer un ancêtre commun (Warden et al., 1993; Oku et al., 2006). L’idée d’une identification et d’un classement des gènes de lipase selon leur composition a alors été émise (Wong and Schotz, 2002). Si au départ, cette famille de gènes ne comporte que trois lipases : lipoprotéine-lipase, lipase pancréatique et lipase hépatique, l’outil de comparaison de séquences a rapidement permis d’en découvrir d’autres par homologie de leur séquence protéique. De nouvelles enzymes ont trouvé leur place dans la famille des lipases comme, par exemple, la lipase endothéliale et la phosphatydilsérine phospholipase A1. La plupart des membres de la famille des lipases ont été étudiés d’un point de vue physiologique ou pour établir leur distribution à travers les tissus. Un type de lipase, la lipase hormono-sensible (HSL) a au début été décrite comme une lipase spécifique des triglycérides et intracellulaire aux adipocytes. Actuellement, elle a été identifiée dans la plupart des tissus comme les lipoprotéines lipases. La principale caractéristique de la lipase hormono-sensible (HSL) reste la variété de ses régulations notamment par phosphorylation/déphosphorylation ou par interaction avec d’autres protéines (Yeaman, 2004).

Phospholipases, carboxylestérases et thioestérases 

Les phospholipases au sein du règne animal forment une très vaste famille divisée comme vu précédemment en fonction de leur site d’action . Pour chaque sous-famille de phospholipases (A, C et D), des caractéristiques physiologiques et spécifiques ont été mises en évidence par rapport aux tissus. La phospholipase A1 compte de nombreux isozymes comme la lipase hépatique et la lipase pancréatique capables d’hydrolyser des triglycérides mais également des phospholipides. Les phospholipases A possèdent le pentapeptide GXSXG (elles appartiennent donc à la famille génétique des lipases). Elles sont classées en fonction de leur localisation de part et d’autre de la paroi cellulaire. Les phospholipases A2 se répartissent en cinq groupes : les PLA2 sécrétées, les PLA2 calcium dépendantes, les PLA2 calcium indépendantes, les PLA2 lysosomales et enfin les PLA2 acetylhydrolases (PAF-AH). Ces phospholipases A2 sont très largement distribuées à travers les tissus et leurs structures tridimensionnelles sontbien distinctes en fonction des groupes de PLA2. Les phospholipases C représentent au sein du règne animal 13 isozymes classés en six groupes (β, γ, δ,ε, ζ et η). Les phospholipases β et ε sont activées par des récepteurs couplés à des protéines G. La distribution au sein des tissus est variable mais la représentation des phospholipases C au sein des tissus du cerveau est conservée pour 5 des 6 groupes. L’activité phospholipase C au niveau de cescellules conditionne la bonne modulation des réseaux neuronaux. Comme pour les phospholipases A2, chacun des six groupes adopte une conformation structurale propre. La figure 13 présente la schématisation des domaines constitutifs pour chacun des groupes, certains domaines sont conservés comme les domaines catalytiques « X » et « Y » ou bien le domaine de liaison au calcium « C2 » (Bamji-Mirza and Yao, 2011).

Les enzymes lipolytiques animales d’origine marine 

Les organes de poissons sont connus pour contenir nombre de molécules d’intérêt, notamment des acides gras de la série ω3. La présence de ces acides gras laisse supposer la présence d’enzymes lipolytiques (lipases et phospholipases) pouvant se révéler indispensables pour l’enrichissement d’aliments en acides gras polyinsaturés issus de sous-produits de la pêche (Shahidi and Janak Kamil, 2001). Ces acides gras sont en effet plus difficiles à libérer par hydrolyse avec les lipases actuellement utilisées (Lie and Lambertsen, 1986). Les lipases d’organismes marins se sont à l’inverse montrées plus efficace pour ces acides gras à longue chaîne (Iijima et al., 1998). Il faut donc approfondir les connaissances sur ces possibles activités lipolytiques présentes dans les différents tissus de produits de la mer (Smichi et al., 2012).

Table des matières

Introduction
Chapitre I : Synthèse bibliographique
1. Les enzymes lipolytiques
1.1. Définitions
1.2. Structure et mécanisme
1.2.1. Le système α/β hydrolase
1.2.1. Cinétique enzymatique des enzymes lipolytiques
1.2.2. Spécificités de substrat des enzymes lipolytiques
1.3. Les enzymes lipolytiques à travers le monde vivant
1.3.1. Les enzymes lipolytiques végétales
1.3.2. Les enzymes lipolytiques animales
1.3.3. Les enzymes lipolytiques de micro-organismes
1.4. Les enzymes lipolytiques de microalgues
1.5. Les applications industrielles des enzymes lipolytiques
1.5.1. Méthodes de production des lipases
1.5.2. Applications dans les détergents
1.5.3. Applications dans l’industrie textile et papier
1.5.4. Applications dans l’industrie agroalimentaire et laitière
1.5.5. Autres applications
1.5.6. La production des monoglycérides
1.5.7. Enzymes de microalgues et applications énergétiques
2. Caractériser une activité lipolytique par biochimie et biologie moléculaire
2.1. Préambule
2.2. L’approche biochimique
2.2.1. Méthodes en milieu de culture solide
2.2.2. Méthodes par titration
2.2.3. Méthodes colorimétriques, turbidimétrique et fluorimétrique
2.2.4. Méthodes chromatographiques
2.2.5. Méthodes immunologiques et radioactives
2.2.6. Autres méthodes
2.3. L’approche bioinformatique : gènes, domaines, motifs et séquences consensus des enzymes lipolytiques
2.3.1. Les bases de données
2.3.2. Identification d’enzymes lipolytiques par homologie de séquences
2.4. Identification et caractérisation d’une fonction lipolytique chez Isochrysis galbana
2.4.1. Indices biochimiques
2.4.2. Les gènes d’Isochrysis galbana appartenant au métabolisme lipidique
3. Systèmes hétérologues et expression d’enzymes lipolytiques recombinantes
3.1. Préambule
3.2. La production hétérologue de protéines
3.2.1. Hôte procaryote : Escherichia coli
3.2.2. Hôte procaryote : Bacillus sp
3.2.3. Hôtes eucaryotes : les levures et les champignons
3.2.4. Hôtes eucaryotes supérieurs
3.3. Les principaux vecteurs d’expression
3.4. Bilan
3.5. L’expression hétérologue d’enzymes lipolytiques
Chapitre II : Matériel et méthodes
1. Matériels biologiques
1.1. Saccharomyces cerevisiae
1.2. Escherichia coli
1.3. Plasmides de clonage et vecteurs d’expression
1.3.1. Saccharomyces cerevisiae
1.3.2. Escherichia coli
1.4. Milieux de culture
1.4.1. Milieu de culture pour Saccharomyces cerevisiae
1.4.2. Milieu de culture pour Escherichia coli
1.5. Conditions de culture et de conservation
1.5.1. Suivi de croissance
1.5.2. Méthodes de conservation
1.5.3. Méthodes de culture de Saccharomyces cerevisiae
1.5.4. Méthodes de culture d’Escherichia coli
2. Etude de l’expression chez Saccharomyces cerevisiae
2.1. Préambule
2.2. Extraction du vecteur pYES2.1 contenant les gènes présents dans Saccharomyces cerevisiae
2.3. Amplification par PCR
2.4. Détermination de la présence d’un insert dans le vecteur pYES2.1
2.5. Electrophorèse et purification des produits amplifiés
2.6. Quantification des acides nucléiques
2.7. Expression d’IgTeCe et IgEst3
3. Etude de l’expression chez Escherichia coli
3.1. Préambule
3.2. Extraction des gènes IgTeCe et IgEst3 depuis le plasmide pYES2.1 : protocole “ K7-extract ”
3.3. Clonage et ligation
3.4. Préparation de cellules d’Escherichia coli et transformation avec le plasmide de clonage
3.5. Extraction de plasmides à partir d’Escherichia coli
3.5.1. Mini préparation de plasmides pour la sélection de clones positifs
3.5.2. Midi préparation de plasmides pour sous-clonage et séquençage
3.6. Validation d’un clone
3.6.1. Validation par digestion enzymatique
3.6.2. Validation par séquençage
3.7. Clonage dans les vecteurs d’expression
3.7.1. Amplification et ajout de sites de restriction
3.7.2. Digestion enzymatique pour l’insertion dans un plasmide d’expression
3.7.3. Ligation et transformation
3.8. Validation de l’insertion dans les plasmides d’expression
3.8.1. Validation par séquençage
3.9. Préparation de cellules d’Escherichia coli BL21 et transformation avec les plasmides d’expression
3.9.1. Préparation de cellules électrocompétentes
3.9.2. La culture d’Escherichia coli – tests d’expression
4. Recherche de transcrits (RT-PCR)
4.1. Préparation d’ARN totaux
4.2. Obtention de la matrice ADN complémentaire
4.3. Evaluation de la RT-PCR
5. Techniques de biochimie
5.1. Extraction des protéines de Saccharomyces cerevisiae
5.2. Extraction des protéines d’Escherichia coli
5.3. Dosage de protéines
5.4. Séparation électrophorétique
5.4.1. SDS-PAGE
5.4.2. Coloration des protéines
5.5. Détection immunologique
5.5.1. Dot blot
5.5.2. Western blot
5.6. Chromatographie et purification
5.6.1. Préambule
5.6.2. Tampons utilisés
5.6.3. Procédure de purification
6. Caractérisation des enzymes
6.1. Concentration et dialyse
6.2. Recherche d’activité
6.2.1. Test d’hydrolyse de substrat gélosé
6.2.2. Test d’hydrolyse de substrat chromophore
6.3. Composition des lipides
6.3.1. Extraction des lipides totaux
6.3.2. Saponification et méthylation
6.3.3. Analyse par chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques
7. Méthodes bioinformatiques
7.1. Manipulations et outils de comparaison de séquences
7.2. Profils physico-chimiques des protéines et prédictions de structures
7.3. Analyses et optimisation de prises de vue expérimentales
Chapitre III : Résultats et discussion
Conclusion

Lire le rapport complet