Soutenance mémoire
INTERACTIONS ENTRE LES ORGANISMES VIVANTS
L’interaction est au centre de l’écologie : il paraît impossible d’identifier un système biologique dans son habitat naturel qui ne participe pas dans une forme d’interaction. Elle joue un rôle prépondérant au cours de l’évolution des organismes qui interagissent. Au cours du temps, elle devient de plus en plus nombreuse et étroite, et est à l’origine de la diversification des plantes, mais également des microorganismes et des animaux participants aux interactions. De plus, elle conduit à l’apparition de nombreuses adaptations morphologiques, biochimiques et comportementales des organismes impliqués [38]. Les relations entre organismes vivants au sein des populations et des biocénoses peuvent être :
• des relations symbiotiques qui incluent entre autres [38] :
– le commensalisme : relation dans laquelle un organisme, le commensal, tire un avantage alors que l’autre, l’hôte, n’est affecté. Souvent les deux organismes mangent « à la même table » ;
– le parasitisme : mode de vie des organismes qui en parasite d’autres;
– le mutualisme : relation avantageuse entre deux organismes ;
– la pathogénicité : condition de vie des organismes provoquant une maladie ;
Par ailleurs, la relation pourrait renfermer de nombreuses imbrications de liens étroites, intimes d’éléments divers.
• des relations non symbiotiques qui s’expriment, en général, par la compétition. C’est une interaction entre membres d’une même population ou des populations qui tentent de se procurer une même ressource essentielle, disponible qu’en quantité limitée. Pour cela, une espèce peut aller jusqu’à empêcher à une autre l’accès à cette ressource.
LES ENDOPHYTES
Il existe trois types d’endophytes :
• les endophytes asymptomatiques : ce sont des microorganismes qui ne provoquent pas de maladie à la plante hôte durant presque toute la durée de leur cycle de vie à l’intérieur de la plante hôte (Bacillus spp., Cladosporium sp.) [45],
• les endophytes symbiotiques : ils sont asymptomatiques mais qui forment des associations bénéfique et mutuelle avec la plante hôte. Cas des bactéries fixatrices d’azote (Acetobacter diazotrophicus), ou le champignon Rhizoctonia dans les graines des orchidées [45],
• les endophytes pathogènes latents : ce sont de véritables phytopathogènes (Colletotrichum sp., Alternaria alternata, etc.) mais qui ne s’expriment que si la plante se trouve dans des conditions défavorables ou de stress tel que la sècheresse, l’attaque par les insectes [45].
Les champignons Appelé aussi « mycète », un champignon est un organisme : eucaryote, uni- ou pluricellulaire, comprenant de nombreuses cellules assemblées en un réseau de filaments : le mycélium ou thalle. L’hyphe est l’élément structural. Ce sont surtout les champignons microscopiques ou micromycètes qui criblent souvent par leurs hyphes fongiques les tissus des plantes. Le champignon est un organisme hétérotrophe et quand il se nourrit, le champignon fonctionne soit comme saprophyte, parasite ou symbiote.
Les bactéries Une bactérie est un organisme procaryote, unicellulaire, microscopique (de l’ordre de quelques microns à 1 millimètre). Les bactéries présentent une diversité dans leur morphologie, leur biologie qui évoque leurs caractéristiques structurales et fonctionnelles. Il existe principalement 3 catégories de formes de bactéries : coque ou cocci – bâtonnet ou bacille – spiralée ou spirochète. Les bactéries sont classiquement représentées dans 12 ordres bien distincts et dont chacun constitue un groupe hétérogène d’organismes [25, 26]:
PSEUDOMONALES – CHALMYDOBACTERIALES – HYPHOMICROBIALES – EUBACTERIALES – CARYOPHANALES – ACTINOMYCETALES – CYTOPHAGALES – MYXOBACTERIALES – SPIROCHETALES – RICKETTSIALES – CHLAMYDIALES – MYCOPLASMATALES (qui constituent une classe isolée, celle des MOLLICUTES).
Toutefois, les bactéries peuvent être groupées en GRAM NEGATIF (G+) et GRAM POSITIF (G-) selon la capacité de leur paroi à fixer le colorant cristal violet (coloration de Gram).
ACTIVITES DES ENDOPHYTES DANS LA PLANTE HOTE
Facilité d’accès aux nutriments
• Au cours de la germination des graines, les endophytes jouent, chez les plantes telles que les orchidées, un rôle nourricier. De nombreuses orchidées contiennent des champignons endophytes du genre Rhizoctonia. [23, 50]. Les graines d’orchidées étant si petites et non chlorophylliennes, manquent de nutriments pour alimenter la croissance des graines. Rhizoctonia, après la dispersion des graines, émet ses mycéliums hors de la graine et puisent à l’extérieur les nutriments qui lui sont nécessaires. Corrélativement l’embryon sera alimenté.
• Au niveau du système racinaire, des microorganismes endosymbiotes qualifiés d’endomycorhizes augmentent l’absorption de l’eau et des nutriments du sol dans la rhizosphère. [19, 23]. Par exemple, les glomales, avec le genre Glomus, qui forme des mycorhizes à arbuscule font bénéficier la plante hôte du phosphore qu’ils absorbent. Il existe aussi ceux qui sont capable de fixer l’azote atmosphérique, qui après transformation, sera utilisé par la plante : cas de Rhizobium et Frankia.
Influence sur la biologie de la plante hôte
• Des endophytes (Alternaria et Cladosporium) semblent induire une abscission prématurée et la sénescence des feuilles (chez le blé et les haricots) [21].
• En revanche, d’autres microorganismes comme Rhodococcus, une bactérie qui peut être un endophyte, retarde la sénescence de la plante hôte après son infection [13].
• Il existe des microorganismes qui entraînent un phénomène de gigantisme chez la plante, c’est le cas de Gibberella fujikuroï, un champignon endophyte rencontré chez le riz. Ce champignon produit de la gibbérelline, un facteur de croissance végétale favorisant la germination et la croissance des plantes. [38, 59]
• En outre, d’autres microorganismes comme Agrobacterium provoquent des tumeurs, qui sont des amas de cellules indifférenciées, chez la plante hôte. Ces excroissances peuvent être utilisées comme explant de la multiplication végétative [13].
Protection de la plante hôte contre leurs ennemis naturels Les endophytes peuvent être des candidats potentiels comme contrôleurs biologiques en protégeant la plante hôte des aléas de l’environnement et de leurs ennemis naturels tels que les herbivores et les microorganismes pathogènes. Lorsque l’aptitude de la plante hôte à vivre est réduite par les différents stress de l’environnement, la vie des endophytes sera aussi affectée. Dans cette optique, il s’avère capital pour les endophytes de protéger leur hôte. Pour cela, ils stimulent la plante à produire des substances allélochimiques comme les phytoalexines, les phénols, les flavonoïdes et les alcaloïdes qui sont généralement des métabolites secondaires toxiques qui paraissent protéger les plantes [58]. Par ailleurs, les endophytes peuvent construire et porter des gènes antibiotiques et insecticides contre les pathogènes, les insectes et les herbivores respectivement [29]. Les rôles bénéfiques des endophytes peuvent être classés en 2 catégories bien distinctes en se basant sur leur activité potentielle [21] :
• Endophytes : Promoteurs de croissance
• Endophytes : Agents de contrôle biologique
Induction de synthèse de métabolites secondaires chez les bactéries
Les bactéries sont cultivées dans des conditions difficiles mais maîtrisées, afin d’obtenir des concentrations beaucoup plus élevées en métabolites secondaires. Les bactéries sélectionnées sont régénérées et cultivées dans des conditions de stress de façon à les pousser à produire des métabolites secondaires. Pour cela, les souches pures de bactéries sont multipliées dans un milieu nutritif liquide (Bouillon de peptone de soja 5 g/l), un milieu pauvre non renouvelé, pendant quelques jours. La concentration de la population bactérienne est mesurée journalièrement au densitomètre (Il mesure la densité optique d’une suspension bactérienne réalisée dans un tube de milieu liquide) jusqu’à ce que la croissance bactérienne reste stationnaire. Lorsque la phase stationnaire est atteinte, le bouillon est centrifugé 30 minutes à une vitesse de 36000 t/min. puis filtré. Le filtrat obtenu constitue un extrait de cellules et de milieu de culture qui est par la suite utilisé pour le test biologique.
Le protocole de désinfection
La concentration et la durée de contact avec les explants devraient être préalablement mises au point. Elles dépendent généralement de l’espèce, de l’âge de la plante, des différentes parties de la plante (tige, feuilles, racines, etc.). Les désinfectants les plus souvent employés sont l’hypochlorite de sodium (eau de javel commercial), l’hypochlorite de calcium et l’éthanol 70 % [4, 17, 22, 27]. Après différents essais dans la mise au point du protocole, nous avons choisi d’utiliser comme désinfectants :
⇒ l’hypochlorite de calcium (CaOCl2) au lieu de l’eau de javel car CaOCl2, ramené à concentration identique à celle de l’eau de javel, est plus efficace (l’efficacité est quantifiée sur la présence ou non des microorganismes qualifiés de contaminants dans la dernière eau de rinçage). Quant à la concentration, nous avons employé 3 % de CaOCl2. De plus, l’avantage d’utiliser CaOCl2 est qu’il a la propriété de ne pas pénétrer dans les tissus, ce qui nous permettrait de préserver la population microbienne existant dans les tissus végétaux ;
⇒ l’éthanol : il est surtout efficace lorsque sa teneur alcoolique est ramené à 70 %V d’alcool. A cette teneur, elle renforce l’action des autres désinfectants ;
⇒ en outre, pour les graines, nous avons opté pour le flambage après rinçage dans l’éthanol 70 % étant donné que la graine possède une enveloppe souple protégeant l’amande, qui après sera enlevée.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I GENERALITES
I-1 Interactions entre les organismes vivants
I-2 Interaction plante – microorganisme
I-3 Introduction à l’endophytisme
I-3-1 Historique
I-3-2 Terminologie
I-3-3 Définition
II BIOLOGIE DES ENDOPHYTES
II-1 Les endophytes
II-1-1 Les champignons
II-1-2 Les bactéries
II-2 Notion d’écologie des endophytes
II-2-1 Localisation
II-2-2 Distribution
II-2-3 Source des endophytes
II-3 Action des facteurs du milieu
II-3-1 La plante hôte
III-3-2 L’environnement
II-3-2-1 Les facteurs biotiques
II-3-2-2 Les facteurs abiotiques
III- IMPORTANCE DES ENDOPHYTES
III-1 Activités des endophytes dans la plante hôte
III-1-1 Facilité d’accès aux nutriments
III-1-2 Influence sur la biologie de la plante hôte
III-1-3 Protection de la plante hôte contre leurs ennemis naturels
III-2 Endophytes : source de métabolites bioactifs
IV- LES METABOLITES SECONDAIRES
IV-1 Les métabolites secondaires des plantes
IV-2 Les métabolites secondaires de microorganismes
IV-3 Les métabolites secondaires du système symbiotique
DEUXIEME PARTIE : PARTIE EXPERIMENTALE
I- MATERIELS
I-1 Le matériel végétal
I-1-1 Systématique
I-1-2 Description
I-1-3 Distribution
I-1-4 Biologie
I-1-5 Phytochimie
I-1-6 Utilisation
I-2 Les parties végétales utilisées
I-3 Les souches bactériennes
I-4 Les milieux d’étude
I-5 Les désinfectants
II- METHODOLOGIE
II-1 Technique d’isolement des souches pures
II-1-1 Choix des échantillons à étudier
II-1-2 Traitement des échantillons
II-1-2-1 La stérilisation en surface
II-1-2-2 Préparation des échantillons stériles pour la culture
II-1-3 Culture
II-1-3-1 Inoculation du milieu
II-1-3-2 Incubation
II-1-3-3 Lecture des boîtes et transfert
II-1-4 Purification des souches
II-1-5 Conservation des souches
II-2 Technique d’identification
II-2-1 L’étude des caractères culturaux
II-2-2 L’étude des caractères morphologiques et structuraux
II-2-2-1 Examen microscopique
II-2-2-2 Les critères morphologiques et structuraux
II-2-3 L’étude des caractères physiologiques
II-2-4 L’étude des caractères biochimiques
II-3 Recherche d’activité antimicrobienne
II-3-1 Induction de synthèse de métabolites secondaires chez les bactéries
II-3-2 Etude de l’activité antimicrobienne
II-3-2-1 Méthode de diffusion sur gélose ou méthode des disques
II-3-2-2 Mode opératoire : Antibiogramme
TROISIEME PARTIE : RESULTATS – INTERPRETATIONS – DISCUSSIONS
I- LES MICROORGANISMES ENDOPHYTES ISOLES
Interprétations des résultats
Discussion
II- IDENTIFICATION DES MICROORGANISMES ENDOPHYTES
II-1 Les champignons endophytes de Eugenia jambolana
Interprétations des résultats
II-2 Les bactéries endophytes de Eugenia jambolana
II-2-1 Etude des caractères culturaux
II-2-2 Etude des caractères morphologiques et structuraux
II-2-3 Etude des caractères physiologiques et biochimiques
Interprétations des résultats
Discussion
III- ETUDE DE L’ACTIVITE ANTIMICROBIIENNE
Interprétations des résultats et discussions
CONCLUSION GENERALE
PERSPECTIVES
ANNEXES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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