LES DISQUES POUR LE TEST D’ANTIBIOGRAMME

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Préparation et conservation du matériel égétalv

Les feuilles fraîchement récoltées sont séchées ausoleil pendant une à deux semaines. Elles sont broyées au moyen d’un broyeur de marque Blender (Robot coupe GT 550) et la poudre fine ainsi obtenue est conservée dans des bocaux hermétiques, à la température ambiante. Cette poudre représente notre matériel dedépart.

LES PRODUITS CHIMIQUES

Les produits chimiques et les solvants utilisés dans cette étude sont de qualité pour analyse et de marque MERCK ou PROLABO. Le support chromatographique utilisé pour la chromatographie sur couche mince est le gel de silice 6OF254, étalé sur des feuilles en plastique de dimensions 20 x 20 cm. L’épaisseur du gel est de 0,2 mm.

METHODES

METHODES D’EXTRACTION

Extraction à froid

La poudre végétale est délayée dans le solvant d’extraction (eau distillée ou mélange hydroéthanolique 75%) suivant le rapport 1/10 (p/v) c’est-à-dire 1g de poudre dans 10ml de solvant. Le mélange est soumis à une agitation magnétique pendant 3h à la température ambiante, puis il est laissé macérer pendant une nuit à +4°C.
Le macérat est de nouveau agité pendant 1h, puis filtré sur quatre épaisseurs de gaze pour éliminer le marc. Le filtrat obtenu est centrifugé à 12000 trs/min pendant 15min, au moyen d’une centrifugeuse (BREMSE, modèle T52).
Le culot est éliminé. Le volume du surnageant est amenér à 1ml pour chaque gramme de poudre de départ, c’est-à-dire suivant le rapport 1/1 (p/v), par évaporation du solvant d’extraction au moyen d’un évaporateur rotatif (voir méthode de concentration, § II.2.3, p 13). La solution obtenue constitue l’extrait brut

Extraction à chaud

La poudre végétale est mise en suspension dans le olvants d’extraction (eau distillée ou mélange hydroéthanolique 75%) dans unrapport 1/10 (p/v). Le mélange est chauffé à reflux pendant 3 h sur une plaque chauffante et sous agitation magnétique, à la température d’ébullition du solvant d’extraction, c’est-à-dire 100°C pour l’eau et 65°C pour mélange hydroéthanolique. Après refroidissement à la température ambiante, il est laissé macérer pendant une nuit à +4°C.
La suite de la manipulation est la même que pour l’extraction à froid.

METHODES DE PURIFICATION (MAHUZIER et HAMON, 1990 ; KAMOUN, 1991, AUDIGIE et coll., 1992)

Traitement par la chaleur

Principe

Cette méthode est utilisée pour éliminer certainesmacromolécules telles que les protéines ou les acides nucléiques, qui coagulent ous l’effet de la chaleur.
Etude chimique 9

Mode opératoire

L’extrait à traiter est chauffé au bain-marie bouillant à 96°C pendant 15 min. Le précipité formé est éliminé par centrifugation (centrifugeuse BREMSE, modèle T52) à 10000 tours/min pendant 15 min.

Dialyse

Principe

La dialyse est une technique de séparation des substances, utilisant leur capacité respective à franchir les pores d’une membrane appe lée membrane de dialyse. Celle-ci est constituée de cellophane en forme de cylindre allongé appelé boudin ou sac à dialyse. Grâce à la perméabilité sélective de la membrane, esl grosses molécules peuvent être séparées des petites molécules par les phénomènes’osmosed et de diffusion. La membrane sépare ainsi deux solutions de concentrations différentes : le liquide à dialyser et le liquide contre lequel s’effectue la dialyse. Les solutés diffusent de la solution la plus concentrée vers la plus diluée. Les grosses molécules ne diffusent pas.
La vitesse de dialyse est influencée par la température, le rapport entre la surface de la membrane et le volume de la solution à dialys er, le diamètre des pores de la membrane, le temps de contact, et la différence deconcentration entre les deux milieux.

Mode opératoire

La membrane de dialyse ou boudin à dialyse utilisée a 3,3 cm de large (réf. 27/32). Elle laisse passer toutes les substances ayant un poids moléculaire inférieur à 6000-8000 Da

Préparation de la membrane de dialyse

La membrane de dialyse est bouillie 3fois pendant 15min dans de l’eau distillée, en renouvelant à chaque fois l’eau distillée. Ceci est nécessaire afin d’éliminer la glycérine, les composés sulfurés et les métaux lourds qui la rotègentp. Après refroidissement, la membrane est conservée à + 4°C dans la dernière eau bouillie pendant quelques jours. Avant utilisation, elle est toujours rincée à l’eau distillée.

Mise en route de la dialyse

Le boudin à dialyse rempli au 1/3 de son volume d’e xtrait à traiter est fermé à ses deux extrémités par un nœud. Il est ensuite immergédans le liquide de contre-dialyse dont le volume est égal à 100 fois celui de l’extrait à traiter. Le tout est soumis à une agitation magnétique afin d’éviter la formation du gradient de concentration au voisinage du boudin. Ce liquide est renouvelé 4 fois pour accélérer la dialyse. L’opération est conduite pendant 24h.
A la fin de l’expérience, tous les dialysats (liquides à l’extérieur d’un boudin) sont rassemblés. Le dialysat et l’adialysat (liquide à l’intérieur du boudin) sont concentrés jusqu’au volume de l’extrait de départ.

Chromatographie par perméation de gel (GIDDINGS, 1966 ; SQUIRE, 1964)

Principe

La perméation de gel utilise les différences de taille et de poids moléculaire. Le gel Sephadex qui lui sert de support est préparé par réticulation d’un polymère anhydroglucosé : le dextrane. Il se présente sous ormef de grains poreux qui gonflent beaucoup dans l’eau. Chaque type de gel est caractérisé par un domaine de fractionnement, lui même défini par la taille des oresp des graines. Celui du gel Sephadex G25 utilisé est compris entre 1000 et 5000, en poids moléculaire.
Les molécules dont la taille est supérieure à la limite d’exclusion, c’est-à-dire au diamètre des pores, ne peuvent pénétrer dans le gel.Elles migrent dans la phase aqueuse externe aux grains de gel et quittent les premières le lit du gel. Par contre, les molécules plus petites pénètrent dans le gel et leur migration est retardée. Les molécules quittent ainsi la colonne de Sephadex par ordre décroissantdes masses moléculaires.
La colonne peut être réutilisée lorsque les molécules de petite taille ont toutes quitté le gel. Elle est lavée avec un grand volumed’eau distillée.
Le gel Sephadex présente les avantages suivants :
– c’est un outil de la séparation chromatographique, il permet également de dessaler ou de faire une approximation du poids moléculaire ;
– il est utilisé en milieu aqueux, ce qui rend la méthode plus rapide et plus économique.

Mode opératoire

– Le gel est mis à gonfler dans l’eau distillée à l a température ambiante pendant 3 heures ;
– Il est dégazé sous vide et coulé dans une colonnen plastique de dimensions voulues ;
– La surface supérieure du gel est stabilisée par neu rondelle de papier filtre ;
– Le gel est équilibré par passage de trois fois son volume total d’eau distillée ;
– L’échantillon est déposé avec précaution à la surface du gel. Les différentes substances sont éluées par lavage à l’eau distilléeet par gravité. Les fractions sont récoltées au moyen d’un collecteur de fractions LKB.
Un entretien particulier du Sephadex n’est pas nécessaire après son utilisation. La colonne est lavée avec un grand volume d’eau distillée.

Fractionnement par le n-butanol

Principe

Cette technique permet le fractionnement des substances selon leur solubilité vis-à-vis de deux solvants non miscibles et de polaritésdifférentes tels que le n-butanol et l’eau.

Mode opératoire

L’extrait à tester et le n-butanol sont mélangés volume à volume dans une ampoule à décanter. Après une forte agitation manuelle, l’ensemble est laissé décanter jusqu’à séparation nette de deux phases : une phase supérieure organique et une phase inférieure aqueuse.
La phase butanolique est recueillie, alors que la phase aqueuse est soumise à deux autres traitements identiques au premier. Les trois phases organiques rassemblées, ainsi que la phase aqueuse, sont filtrées séparément surpapier filtre pour éliminer les éléments insolubles. Le butanol est évaporé de la phase organique. Il est nécessaire d’ajouter un grand volume d’eau pour éliminer totalement le solvant.
Dans la phase aqueuse, le n-butanol résiduel est évaporé après addition d’eau distillée. La solution finale est ramenée à son volume initial par évaporation.

Fractionnement par l’acétate d’éthyle

Principe

Le principe est le même que pour le fractionnement par le n-butanol, mais le solvant utilisé est l’acétate d’éthyle.

Mode opératoire

Dans une ampoule à décanter sont introduits l’extrait à traiter et l’acétate d’éthyle de même volume. Après agitation énergique, le mélangeest laissé au repos jusqu’à décantation totale donnant deux phases bien distinctes : d’une part la phase supérieure organique et d’autre part la phase inférieure aqueuse.
La suite de l’opération est la même que pour le fractionnement par n-butanol.

Précipitation par l’acétate neutre de plomb

Principe

L’acétate neutre de plomb (ANP), comme la plupart des sels de métaux lourds, permet la défécation d’extraits biologiques en précipitantles grosses molécules telles que les protéines, les acides nucléiques, les polysaccharides ainsi que d’autre substances, comme les acides organiques.

Mode opératoire

La solution d’ANP 20% (p/v) de volume défini, est versée goutte à goutte dans l’extrait à traiter sous agitation magnétique. Le précipité formé est éliminé par centrifugation (centrifugeuse JOUAN, modèle TH12) à 12000 tours/min pendant 15min.
L’ajout d’une solution aqueuse de phosphate disodiq ue à 10% (p/v) dans le surnageantest nécessaire pour éliminer l’excès de plomb sousforme de précipité. Le précipité est écarté par centrifugation pendant 10 min. Le surnageant est ramené au volume initial par
évaporation.

METHODE DE CONCENTRATION

Toutes les opérations d’évaporation de solvant et de réduction de volume des extraits sont réalisées à 50-55°C à l’aide d’un évaporateur rotatif (HEIDOLPH, modèle VV60). La pression est réduite au moyen d’une pompe à vide.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
PREMIERE PARTIE : ETUDE CHIMIQUE
I INTRODUCTION
II MATERIELS ET METHODES
II. 1. MATERIEL
II.1.1 MATERIEL VEGETAL
II.1.1.1 Classification de la plante
II.1.1.2 Identification de la plante
II.1.1.3 Description botanique
II.1.1.4 Distribution géographique
II1.1.5 Date et lieu de récolte
II.1.1.6 Préparation et conservation du matériel végétal
II.1.2 LES PRODUITS CHIMIQUES
II. 2 METHODES
II.2.1 METHODES D’EXTRACTION
II.2.1.1 Extraction à froid
II.2.1.2 Extraction à chaud
II.2.2 METHODES DE PURIFICATION
II.2.2.1 Traitement par la chaleur
II.2.2.2.1.1 Principe
II.2.2.1.2 Mode opératoire
II.2.2.2 Dialyse
II.2.2.2.1 Principe
II.2.2.2.2 Mode opératoire
II.2.2.2.2.1 Préparation de la membrane de dialyse
II.2.2.2.2.2 Mise en route de la dialyse
II.2.2.3 Chromatographie par perméation de gel Sephadex G
II.2.2.3.1 Principe
II.2.2.3.2 Mode opératoire
II.2.2.4 Fractionnement par le n-butanol
II.2.2.4.1 Principe
II.2.2.4.2 Mode opératoire
II.2.2.5 Précipitation par l’acétate d’éthyle
II.2.2.5.1 Principe
II.2.2.5.2 Mode opératoire
II.2.2.6 Précipitation par l’acétate neutre de plomb
II.2.2.6.1 Principe
I.I2.2.6.2 Mode opératoire
II.2.3 METHODE DE CONCENTRATION
II.2.4 METHODES D’ANALYSE
II.2.4. 1 Chromatographie sur couche mince (CCM)
II.2.4.1.1 Principe
II.2.4.1.2 Mode opératoire
II.2.4.1.2.1 Dépôt de l’échantillon
II.2.4.1.2.2 Développement de la plaque
II.2.4.1.2.3 Révélation du chromatogramme
II.2.4.2 Méthodes de détection des familles chimiques
II.2.4.2.1 Les alcaloïdes
II.2.4.2.1.1 Test de MAYER
II.2.4.2.1.2 Test de WAGNER
II.2.4.2.1.3 Test de DRAGENDORFF
II.2.4.2.2 Les polyphénols
II.2.2.4.2.1 Test à la gélatine
II.2.2.4.2.2 Test à la gélatine salée
II.2.4.2.1.3 Test au chlorure ferrique
II.2.4.2.3 Les flavonoïdes et les leucoanthocyanes
II.2.4.2.3.1 Les flavonoïdes : Test de WILSTATER
II.2.4.2.3.2 Les leucoanthocyanes : Test de BATE-SMITH
II.2.4.2.4 Les stéroïdes, les triterpènes et les stérols insaturés
II.2.4.2.4. 1 Test de LIEBERMANN BURCHARD
II.2.4.2.4.2 Test de SALKOWSKI
II.2.4.2.5 Les anthraquinones : Test de BORNSTRÄGER
II.2.4.2.6 Les désoxyoses : Test de KELLER-KILIANI
II.2.4.2.7 Les iridoïdes
II.2.4.2.8 Les saponines (test de mousse)
III RESULTATS
III. 1 EXTRACTION
III.1.1 EXTRACTION A FROID
III.1.1.1 Extraction aqueuse
III.1.1.2 Extraction hydroéthanolique
III.1.2 EXTRACTION A CHAUD
III.1.2.1 Extraction aqueuse
III.1.1.2 Extraction hydroéthanolique 75%
III. 2 PURIFICATION
III.2.1LES METHODES RETENUES DANS LE PROCEDE DE PURIFICATION
III.2.1.1 Traitement par la chaleur
III2.1.2 Dialyse
III.2.1.3 Chromatographie sur colonne de gel Sephadex G
III.2.2 LES METHODES NON RETENUES DANS LE PROCEDE DE PURIFICATION
III.2.2.1 Fractionnement par le n-butanol
III.2.2.2 Fractionnement par l’acétate d’éthyle
III.2.2.3 Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP)
III 3 RENDEMENT
III 4 DEGRE D’HOMOGENEITE DES EXTRAITS
III 5 CARACTERISATION CHIMIQUE
III.5.1 PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES
III.5.2 NATURE CHIMIQUE
IV. DISCUSSION ET CONCLUSION
DEUXIEME PARTIE : ETUDE TOXICOLOGIQUE
I. INTRODUCTION
II. MATERIELS ET METHODES
II.1. MATERIELS
II.1.1 LES ANIMAUX D’EXPERIMENTATION
II.1.1.1 Les animaux à sang chaud : les souris
II.1.1.2 Les animaux à sang froid
II.1.1.2.1 Les poissons
II.1.1.2.2 Les têtards de grenouille
II.1.1.2.3 Les larves de moustique
II.1.2 LES PLANTES D’EXPERIMENTATION
II.1.3 LES MICROORGANISMES
II.1.3.1 Les souches
II.1.3.2 Les milieux de culture
II.1.4 LES DISQUES POUR LE TEST D’ANTIBIOGRAMME
II.1.5 STERILISATION
II.2 METHODES
II.2.1 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX
II.1.2.1 Méthodes d’étude des effets sur les animaux à sang chaud
II.2.1.1.1 Etude de la toxicité sur souris
II.2.1.1.1.1 Estimation de la toxicité
II.2.1.1.1.2 Détermination de la DL50 (24h)
II.21.2 Méthodes d’étude des effets sur les animaux à sang froid
II.2.1.2.1 Principe
II.2.1.2.2 Mode opératoire
II.2.1.2.3 Détermination de la CL50
II.2.1.2.3.1 Test sur les alevins de baraoa
II.2.1.2.3.2 Test sur les têtards de grenouille
II.2.1.2.3.3 Test sur les larves de moustique
II.2.2 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES VEGETAUX
II.2.2.1 Effets sur le pouvoir germinatif des graines
II.2.2.2 Effets sur la croissance des jeunes plantules
II.2.2.2.1 Principe
II.2.2.2.2 Mode opératoire
II.2.2.3 Effets sur le développement de bourgeons axillaires
II.2.3 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES MICROORGANISMES
II.2.3.1 Test de sensibilité des microorganismes aux extraits
II.2.3.11 Test d’antibiogramme ou test de diffusion en milieu solide
II.2.3.1.1.1 Principe
II.2.3.1.1.2 Mode opératoire
II.2.3.1.2 Détermination de la concentration minimale inhibitrice.
III RESULTATS
III.1 EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD
III.1.1 Effet de l’extrait brut sur les souris
II.1.1.1 Toxicité sur souris
III.1.1.1.1 Description des symptômes
III.1.1.1.2 Détermination de la DL50 (24h)
III.2 EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG FROID
III.2.1 Effets de l’extrait brut sur les alevins de baraoa
III.2.2 Effets de l’extrait brut sur les têtards de grenouille
III.2.3 Effets de l’extrait brut sur les larves de moustique
III.3 EFFETS SUR LES VEGETAUX
III.3.1 Effets de l’extrait brut sur le pouvoir germinatif de graines
III.3.2 Effets de l’extrait brut sur la croissance de jeunes plantules
III.3.3 Effets des extraits sur la croissance des bourgeons axillaires
III.4 EFFETS SUR LES MICROORGANISMES
III.4.1 Spectre d’activité antimicrobienne de l’extrait brut
IV DISCUSSION ET CONCLUSION
V CONCLUSION GENERALE ET PERSECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE

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