Les différents systèmes d’expression utilisés pour des protéines membranaires d’Eucaryotes supérieurs

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Les ATPases H/K

Les ATPases H/K sont des ATPases de type IIC. Tout comme les ATPase Na/K, elles sont donc composées d’une sous unité α catalytique et d’une sous unité β dont la fonction reste mal connue. Chez l’humain, 2 gènes sont connus coder pour ces ATPases.
Le gène ATP4A code pour l’ATPase H/K dite gastrique qui, en excrétant deux protons en échange de deux ions potassium, intervient dans l’acidification de la poche stomacale (Møller et al., 1996). Elle a également été identifiée dans les cellules rénales (Kraut et al., 2001).
Le gène ATP12A code pour l’ATPase H/K dite non gastrique. Cette ATPase est sensible à la ouabaïne et il a été suggéré qu’elle transporte parfois un ion Na+, fonctionnant alors comme pompe Na/K (Grishin et Caplan, 1998).

Les ATPases Cu

Deux ATPases Cu sont connues dans les cellules humaines. Ces ATPases de type IB sont codées par les gènes ATP7A et ATP7B. Ces protéines sont respectivement appelées protéine de Menkes (MNKP) et protéine de Wilson (WNKP), en référence aux maladies engendrées par des mutations dans chacun de ces gènes. Dans certains tissus, les deux ATPase Cu sont présentes mais dans ce cas le rôle précis de chaque protéine reste mal compris. La maladie de Menkes est caractérisée par des symptômes neurologiques, notamment des retards de développement et un retard mental. Cette maladie est due à un défaut d’assimilation du cuivre alimentaire, qui reste piégé au niveau des cellules intestinales. La maladie de Wilson est due à une accumulation de cuivre dans certains tissus, notamment le foie ou le cerveau, ce qui engendre entre autre une cirrhose du foie et des désordres neurologiques (Portmann et Solioz, 2005 ; Lutsenko et al., 2005a; Lutsenko et al., 2005b).

Les ATPases Ca2+ :

Actuellement, trois types d’ATPases Ca2+ ont été identifiées dans les cellules de mammifères : les ATPases Ca2+ du réticulum ou SERCA, les ATPases Ca2+ trouvées au niveau de la membrane plasmique ou PMCAs (Plasma Membrane Ca2+ ATPases), et les ATPases Ca2+ trouvés dans les membranes golgiennes ou SPCA (Secretory Pathway Ca2+ ATPases). Ces trois familles d’ATPases sont toutes multi-géniques.
Les PMCAs sont codées par 4 gènes différents et les ARN messagers de plus de 20 isoformes résultant de l’épissage alternatif de ces gènes ont été détectés chez l’humain (Guerini, 1998). Les ATPase de cette famille assurent le pompage du calcium hors de la cellule et sont régulées par des phosphorylations et la calmoduline (Møller et al., 1996 ; Guerini, 1998). L’invalidation des gènes correspondant chez la souris montre que PMCA2 joue un rôle important dans les phénomènes d’audition et dans l’équilibre. Des perturbations de ces deux fonctions sont également observées comme conséquence de mutation de ce gène (Shull, 2000).
Les ATPases SPCA sont codées chez l’humain par les gènes ATP2C1 et ATP2C Elles peuvent pomper à la fois les ions Ca2+ et les ions Mn2+. La levure S. cerevisiae possède une protéine homologue, Pmr1p. Une invalidation de ce gène chez la levure entraîne de nombreuses perturbations dans les fonctions du Golgi, entre autres des glycosylations incomplètes ou de mauvais adressages. De nombreuses études laissent supposer que ces pompes jouent également un rôle dans la signalisation calcique cellulaire (pour revue, voir Van Baelen et al., 2004). Des mutations inactivant au moins un des allèles du gène ATP2C1 provoquent la maladie de Hailey- Hailey, maladie de la peau caractérisée par des érosions et des lésions de la peau au niveau des articulations. Ces symptômes sont dus à une perte d’adhérence des kératinocytes ( pour revue , voir Missiaen et al., 2004).
La description des SERCAs fait l’objet du paragraphe suivant.

Présentation des différentes isoformes de la famille SERCA

Les protéines de la famille SERCA sont codées par 3 gènes différents : ATP2A1, ATP2A2 et ATP2A3. Comme nous allons le voir ci-dessous, chacun de ces gènes peut lui-même être à l’origine de différents variants d’épissage.

Les isoformes SERCA1

La structure primaire de SERCA1a a été déterminée en 1985 par clonage de son ADNc (MacLennan et al., 1985). Il s’agit d’une protéine de 994 acides aminés et d’une masse molaire de 110 kDa. Les deux isoformes a et b de l’ATPase SERCA1 ne diffèrent que par leur extrémité C-terminale. L’isoforme SERCA1b est néonatale alors que l’isoforme SERCA1a est retrouvée chez le sujet adulte (Brandl et al., 1986; Brandl et al., 1987). L’expression fonctionnelle des deux protéines dans les cellules COS n’a pas permis de révéler des différences fonctionnelles et la raison pour laquelle ces 2 isoformes existent reste obscure (Maruyama et MacLennan, 1988).
Chez l’adulte, l’ATPase SERCA1a est très abondante dans le réticulum sarcoplasmique puisqu’elle représente 70 à 80 % des protéines membranaires. De ce fait, on peut la purifier relativement facilement et cela a grandement contribué à l’étude de son fonctionnement. En outre, à ce jour, c’est la seule ATPase de type P pour laquelle la structure tridimensionnelle à haute résolution est connue. Ses propriétés fonctionnelles et structurales seront détaillées dans les parties I.2.3 et I.2.4.
Un gène ATP2A1 défectueux peut être à l’origine d’une maladie héréditaire, la maladie de Brody. Les symptômes qui caractérisent cette pathologie sont une altération de la relaxation musculaire (induite par l’exercice), une rigidité corporelle et des crampes musculaires durant l’effort (Odermatt et al., 1996).

Les isoformes SERCA2

En 1986, Brandl et ses collaborateurs ont montré l’existence d’un deuxième gène codant pour une ATPase Ca2+ du réticulum (Brandl et al., 1986). Il est actuellement connu que le gène ATP2A2 code pour 3 isoformes SERCA2, distinctes par leur partie C-terminale (cf. Figure I.2-2 ).
L’isoforme SERCA2a est principalement exprimée dans les fibres musculaires cardiaques où elle représente l’isoforme SERCA majoritaire. Son expression est également détectée dans d’autres tissus, comme dans les cellules musculaires lisses ou dans les cellules pancréatiques épithéliales (Gelebart et al., 2003).
L’isoforme SERCA2b a été détectée dans toutes les cellules testées à ce jour. La séquence C-terminale de cette isoforme contient un domaine transmembranaire additionnel, ce qui fait que l’extrémité C-terminale de SERCA2b se trouve dans le réticulum. Il a été proposé que la calréticuline interagirait avec ce domaine et par là même, modulerait l’activité de SERCA2b (Shull, 2000).
L’ARN messager SERCA2c a été trouvé dans des lignées cellulaires épithéliales, mésenchymateuses ou hématopoïétiques. L’ARNm et la protéine SERCA2c ont été détectés dans les monocytes, avec une régulation de leur niveau d’expression au cours des phases de différenciation (Gelebart et al., 2003).
Des études d’invalidation du gène codant pour les isoformes SERCA2 chez la souris ont montré qu’il était impossible d’obtenir des souris homozygotes SERCA2 -/-, démontrant que ce gène joue un rôle vital, probablement du fait du caractère ubiquitaire de l’isoforme SERCA2b (Shull, 2000). Au moins 120 mutations du gène ATP2A2 ont été référencées comme entraînant une maladie génétique de la peau, la maladie de Darier, caractérisée par une hyperkératose (Hovnanian, 2004).

Les isoformes SERCA3

Un troisième gène codant pour l’ATPase Ca2+ du réticulum a été découvert chez le rat en 1989 par Burk et ses collaborateurs (Burk et al., 1989). L’équipe de Enouf a mis en évidence l’existence d’une troisième pompe dans les cellules humaines dès 1991 (Papp et al., 1991; Papp et al., 1992), mais c’est en 1996 que le gène ATP2A3 humain a été identifié et clôné (Dode et al., 1996). Depuis, il a été montré qu’il existait chez l’homme 6 variants d’épissage différents (cf. Figure I.2-3). Pour chaque ARNm différent, la protéine correspondante a pu être détectée dans au moins un type cellulaire (Kovacs et al., 2001; Martin et al., 2002; Bobe et al., 2004).

Différences dans la modulation de l’activité par des facteurs extrinsèques.

Il est connu que deux protéines à 1 segment transmembranaire régulent des protéines SERCA : le phospholamban et la sarcolipine. Le phospholamban non phosphorylé est capable de modifier le cycle catalytique de SERCA1 et SERCA2 en se liant réversiblement à ces deux isoformes. Une des séquences impliquées dans cette interaction avec le phospholamban est absente chez les isoformes SERCA3. L’absence d’expression de phospholamban dans les fibres rapides du muscle squelettique exclut toute interaction avec l’isoforme SERCA1 dans des conditions physiologiques. Par contre, son abondance dans les cellules du muscle cardiaque lui permettent de jouer le rôle de modulateur de SERCA2a et par conséquent, indirectement, de la contraction dans le muscle cardiaque (Wuytack et al., 2002). La sarcolipine (SLN) a une extrémité C-terminale plus courte que le phospholamban mais la séquence en acides aminés du domaine transmembranaire est bien conservée entre les deux peptides, suggérant un rôle important de ces résidus dans l’interaction avec les SERCAs. La SLN est fortement exprimée dans les fibres rapides du muscle squelettique, fibres au sein desquelles l’ATPase SERCA1a est elle aussi fortement exprimée. La SLN est également exprimée dans le muscle cardiaque et les fibres lentes du muscle squelettique bien qu’à un niveau beaucoup faible que dans le muscle squelettique rapide (pour revue voir MacLennan et al., 2003)
Les isoformes SERCA2 peuvent être phosphorylées par la calmoduline kinase au niveau de leur résidu sérine 38. Certaines équipes ont montré que cette phosphorylation augmente la vitesse de transport du calcium. Les isoformes SERCA1 et SERCA3 ne possèdent pas cette sérine 38 (East, 2000).
Les protéines SERCAs peuvent également être différentiellement régulées par le stress oxydant. Différentes études ont notamment montré que les isoformes pouvaient être différemment modulées par le NO. L’équipe de Grover a démontré en 2003 que l’isoforme SERCA3a était moins inhibée que l’isoforme SERCA2b par le péroxynitrite, agent donneur de NO (cf. Figure I.2-9A)(Grover et al., 2003). Ces résultats sont à relier aux travaux publiés par la même équipe quelques mois plus tard (cf. Figure I.2-9B). Les auteurs montrent que le transport de Ca2+ dans les microsomes de cellules endothéliales des artères coronariennes de porc (où SERCA3 est abondante) était moins inhibé que dans les microsomes des cellules des muscles lisses des mêmes artères (dans lesquelles SERCA2b est l’isoforme majoritaire) (Schmidt et al., 2004).

Les différents systèmes d’expression utilisés pour des protéines membranaires d’Eucaryotes supérieurs.

Utilisation d’un système procaryote, E. coli

La bactérie Escherichia coli a été abondamment utilisée pour l’expression hétérologue de protéines solubles (pour revue, voir Hockney, 1994) et présente à première vue de nombreux avantages. Le principal est que cet organisme a un temps de génération faible (20 min), ce qui permet d’obtenir rapidement de grandes quantités de biomasse et ce, à faible coût. De plus, la biologie moléculaire de cet organisme est bien connue : il existe de nombreuses souches modifiées, de nombreux vecteurs d’expression sont disponibles, il est simple et rapide de tester différentes constructions. L’utilisation d’E. coli comme système hétérologue pour l’expression de protéines membranaires d’Eucaryotes a donné lieu à quelques résultats positifs. C’est le cas par exemple d’un récepteur couplé aux protéines G, le récepteur de la neurotensine du rat (Tucker et Grisshammer, 1996), du transporteur d’oxoglutarate bovin ou de l’ADP/ATP translocase bovine (Miroux et Walker, 1996). Toutefois les exemples de réussite restent rares et l’attractivité de ce système est compensée par la difficulté à y surexprimer des protéines membranaires, d’autant plus si la conservation de l’activité biologique est souhaitée. Le plus souvent, il est tout simplement impossible d’obtenir une surexpression, l’expression de la protéine étant toxique pour la bactérie. Miroux et Walker (Miroux et Walker, 1996) ont proposé une méthode de criblage qui leur a permis de sélectionner des souches d’E. coli mutantes, dans lesquelles il leur a été possible de produire de grandes quantités de différentes protéines membranaires, d’origine eucaryote ou procaryote.
En cas de taux d’expression correct, le principal problème rencontré est l’accumulation des protéines membranaires surexprimées dans des corps d’inclusions. Dans ces structures, les protéines sont en général inactives et retrouver une conformation active après purification n’est pas chose aisée (Mus-Veteau, 2002; Sarramegna et al., 2003), même si quelques succès sont à noter (voir par exemple le transporteur d’oxaloglutarate (Fiermonte et al., 1993)). Il faut noter que le problème rencontré avec les corps d’inclusions n’est pas l’apanage des protéines membranaires et a également été rencontré pour les protéines solubles (Hockney, 1994). L’équipe de de Gier (Drew et al., 2001) a proposé une méthode de criblage de l’expression des protéines membranaires dans E. coli en fusionnant la GFP en C-terminal de la protéine membranaire en question. Si la GFP se retrouve dans les corps d’inclusion, elle n’est pas correctement repliée et ne fluoresce pas. Par contre, si la protéine de fusion est exprimée à la membrane, la GFP peut adopter une conformation correcte et une fluorescence pourra être observée. Ce système permet de détecter les protéines membranaires qui pourraient être surexprimées facilement dans E. coli mais n’apporte aucune solution en cas de taux d’expression trop faible.
En conclusion, le succès de la surexpression d’une protéine membranaire d’Eucaryotes fonctionnelle dans le système E. coli est loin d’être garanti. Toutefois, les méthodes proposées par l’équipe de Miroux et de Gier proposent des solutions très intéressantes qui peuvent éviter de négliger trop rapidement ce système.

Utilisation d’un système eucaryote simple : les levures

Différents types de levures sont utilisés pour l’expression hétérologue de protéines membranaires : la plus courante est Saccharomyces cerevisiae mais on trouve également des exemples d’expression hétérologue de protéines membranaires chez Schizosaccharomyces pombe ou Pichia pastoris. Les levures sont des organismes unicellulaires eucaryotes simples. Le génome des espèces citées précédemment est au moins partiellement connu et est modifiable grâce aux techniques de biologie moléculaire actuelle. Les levures présentent un temps de génération qui reste faible (autour de 2h), elles se cultivent dans des milieux simples et peu chers et cette culture peut se faire à grande échelle dans des fermenteurs. Par ailleurs, les levures sont capables de réaliser des transformations post-traductionnelles comme les phosphorylations, des additions d’acides gras (isoprénylations, myrostiylations) ou encore des glycosylations, même si les sucres ajoutés sont majoritairement des mannoses ce qui n’est pas le cas dans les cellules d’Eucaryotes supérieurs (cf. Cereghino et Cregg, 2000; Macauley-Patrick et al., 2005). Elle apparaît donc comme un intermédiaire entre les systèmes procaryotes et les systèmes eucaryotes plus complexes.
Le succès de S. cerevisiae est indéniable : c’est un organisme dont la biologie moléculaire est connue, dont le génome est séquencé entièrement depuis 1997, dont de nombreuses souches mutantes sont disponibles et qui est couramment utilisée en laboratoire, que ce soit pour l’expression de protéines ou pour d’autres études, comme l’étude en système double hybride. P. pastoris peut présenter des avantages. C’est une levure méthylotrophe, c’est-à-dire pouvant croître avec comme unique source de carbone du méthanol. Les milieux de culture pour cette levure sont extrêmement simples (glycérol ou méthanol, biotine, sels et oligoéléments). Par ailleurs, cette levure peut atteindre des densités cellulaires très importantes en fermenteur (pour revue voir Cereghino et Cregg, 2000 ou Macauley-Patrick et al., 2005). A l’inverse des deux levures citées précédemment qui sont des levures dites bourgeonnantes, S. pombe est une levure fissipare. Sa biologie moléculaire présente de nombreuses caractéristiques qui la rapprochent davantage des Eucaryotes supérieurs par rapport à ses deux consoeurs. Parmi ces avantages, ceux qui pourraient avoir une importance pour l’expression de certaines protéines sont la possibilité d’intégrer des galactoses dans les chaînes glycosylées et la possibilité d’isoprénylation (pour revue voir Giga-Hama et Kumagai, 1999).
Il existe de nombreux vecteurs d’expression commercialisés pour ces trois souches de levures. Ce sont des vecteurs navettes permettant de réaliser les constructions chez E. coli. Chez P. pastoris , les vecteurs d’expression s’intégrent dans l’ADN génomique. Obtenir une souche présentant plusieurs copies du gène d’intérêt est donc plus difficile qu’avec les vecteurs de type épisomal utilisés chez S. cerevisiae ou S. pombe. Pour ces trois souches de levures, il existe des promoteurs inductibles, permettant de retarder la production de la protéine hétérologue. Les promoteurs des gènes GAL chez S. cerevisiae ou AOX1 chez P. pastoris sont inductibles par la présence respectivement de galactose et de méthanol (cf. chapitre « Techniques utilisées » paragraphe II.1.3.1 et Cereghino et Cregg, 2000). Chez S. pombe, les promoteurs qualifiés d’inductibles tels que celui du gène NMT1, sont des promoteurs induits par l’absence d’une substance, ici la thiamine, ce qui est plus difficile à contrôler (Giga-Hama et Kumagai, 1999).
Ces systèmes ont permis l’expression de différentes ATPases de type P d’origine mammalienne: SERCA1a (Centeno et al., 1994, Lenoir et al., 2002), l’ATPase Na/K (Pedersen et al., 1996), l’ATPase Cu (Portmann et Solioz, 2005) et l’ ATPase Ca/Mn (Ton et al., 2002) ont été exprimées chez S. cerevisiae. P. pastoris a également été utilisée pour exprimer l’ATPase Na/K (Strugatsky et al., 2003; Cohen et al., 2005). A ma connaissance, aucune littérature ne met en avant l’utilisation de S. pombe comme système d’expression pour une ATPase de type P mammalienne. Cette levure a toutefois été utilisée avec succès pour d’autres protéines membranaires (Giga-Hama et Kumagai, 1999).
Les levures semblent donc être des hôtes intéressants pour l’expression de protéines membranaires. Des problèmes liés à l’utilisation des levures comme système hôte peuvent toutefois être notés : un taux d’expression trop fort de protéines étrangères peut être létal mais l’utilisation des promoteurs inductibles a permis de contourner ce problème (Schultz et al., 1987, Pedersen et al., 1996). La composition en lipides des membranes de levures diffèrent également par rapport aux cellules eucaryotes supérieures, notamment par la présence d’ergostérol plutôt que de cholestérol, or, la composition en lipides de l’environnement membranaire d’une protéine peut modifier sa fonctionnalité (Cohen et al., 2005). Par ailleurs, pour les protéines glycosylées, la différence de système de glycosylation peut altérer la fonction de la protéine.

Utilisation de cellules d’insectes

Les cellules d’insectes possèdent les équipements enzymatiques leur permettant d’effectuer les modifications post-traductionnelles semblables à celles des Vertébrés, même si une analyse détaillée des glycoprotéines exprimées dans des cellules d’insectes a montré des différences dans la taille et la structure des oligosaccharides par rapport à celle des glycoprotéines de mammifères. Ainsi, les glycoprotéines de mammifères exprimées dans les cellules de lépidoptères Sf9, sont incomplètes car les chaînes oligosaccharidiques sont plus courtes (Devauchelle, http://www.univ-montp1.fr / biotech/ Baculovirus/BaculoContenu.htm , version du 30/11/2000 ). Le temps de doublement des populations de cellules est de 16 à 24 heures. La plupart des lignées de cellules d’insectes peuvent croître en tapis cellulaire ou en suspension: la densité cellulaire varie de 2×106 à 5×106 cellules/ml et cette densité peut être augmentée dans des bioréacteurs sous réserve de l’ajout d’agent protégeant du cisaillement lié à l’agitation (Devauchelle et Cérutti, ).
Les cellules d’insectes les plus couramment utilisées pour l’expression hétérologue de protéines membranaires sont les cellules Sf9. L’expression hétérologue en cellules Sf9 nécessitent leur infection par des virus. Les Baculovirus sont des virus à ADN double brin encapsulés infectant spécifiquement les cellules d’insectes. La taille de la nucléocapside de ces virus est flexible, autorisant l’introduction de fragments d’ADN de grande taille dans le génome du baculovirus. La technologie visant à la production de baculovirus recombinant est connue (voir par exemple Pharmagingen, 1999) ce qui permet d’infecter des cellules d’insectes avec un virus recombinant ayant intégré le gène d’intérêt dans son génome. Le gène d’intérêt, intégré au génome du baculovirus est généralement sous contrôle d’un promoteur fort, généralement celui de la polyhédrine, composant de la nucléocapside. Sous contrôle de ce promoteur, le gène va s’exprimer tardivement, ce qui est un avantage quand le produit est toxique pour la cellule.
Ce système d’expression a été utilisé avec un certain succès pour plusieurs ATPases de type P : pour SERCA (Skerjanc et al., 1993; Miras et al., 2001), pour différentes isoformes de PMCA (Preiano et al., 1996; Guerini et al., 2003), pour l’ATPase Na/K (Hu et al., 2000), pour l’ATPase Cu (Tsivkovskii et al., 2002) ainsi que pour l’ATPase H/K (Klaassen et al., 1993).
Le système baculovirus/cellules d’insectes semble avoir fait ses preuves pour l’expression de nombreuses protéines. Il peut permettre d’obtenir un fort pourcentage de protéines membranaires exprimées, mais cette quantité apparente peut se faire au détriment de l’activité (voir l’expression de SERCA1a décrite dans Miras et al., 2001 et discutée plus loin, paragraphe I.3.1.7). Ses faiblesses sont un temps de génération de 24h, et une culture en milieu complexe et cher. Par ailleurs, pour l’instant, il n’y a pas de lignée stable : à la fin de son cycle, le baculovirus tue les cellules. Des études sont en cours pour intégrer d’un fragment d’ADN du baculovirus dans le génome cellulaire, ce qui conduirait à un système d’expression permanent et stable et dont les taux de production seraient aussi élevés qu’avec le baculovirus (Devauchelle et Cérutti, )
Un autre type de cellules d’Insectes, les cellules Schneider 2 issues de la drosophile, a été également été utilisé pour la production de récepteurs couplés aux protéines G (Tota et al., 1995; Perret et al., 2003). Ces lignées cellulaires peuvent être transfectées de manière stable par le gène d’intérêt, celui ci pouvant placé sous un promoteur inductible par le sulfate de cuivre (CuSO4). L’équipe de Pattus a comparé pour l’expression hétérologue du récepteur humain aux opioïdes mu, l’utilisation des cellules Sf9 infectées par le baculovirus et les cellules Sf9 ou Schneider 2 transfectées de manières stable (Kempf et al., 2002; Perret et al., 2003). Les auteurs montrent que le taux d’expression de ce récepteur dans les lignées Schneider 2 sont plus élevés que dans les lignées Sf9 stables, mais restent 3-4 fois moins élevées que lors de l’utilisation de cellules Sf9 infectées. Toutefois, il faut noter que les auteurs n’avaient pas essayé d’optimiser le système Schneider 2.

L’ovocyte de xénope

L’ovocyte de xénope présente l’avantage d’être une grande cellule (~1 mm de diamètre) facilement manipulable. Il est possible d’injecter dans cette cellule des ADNc ou des ARNm du gène d’intérêt, qui sera alors exprimé.
Cette technique nécessite une injection séparée ovocyte par ovocyte et ne se prête donc pas à l’expression de protéines à grande échelle. Toutefois, ce système peut être utile pour étudier la fonction d’une protéine membranaire, notamment pour les protéines adressées à la membrane plasmique qui pourront être étudiées par la technique de patch clamp.
L’ATPase H/K a été étudié dans ce système, l’ovocyte servant alors de « vésicules géantes » permettant l’accumulation de l’ion transporté, le Rb, analogue de l’ion K (Codina et al., 1996). Des mutants de la sous unité α de l’ATPase Na/K ont également été étudié grâce à ce système (Crambert et al., 2004).

Table des matières

ABREVIATIONS
Chapitre I : Introduction
I.1 Introduction générale
I.2 Les SERCAs
I.2.1 Les SERCAs, des protéines de la famille des ATPases dites de type P
I.2.1.1 Généralités sur la famille des ATPases de type P
I.2.1.2 Présentation des quelques membres de la famille des ATPases de type P rencontrés dans les cellules de Mammifères
I.2.2 Présentation des différentes isoformes de la famille SERCA
I.2.2.1 Les isoformes SERCA1
I.2.2.2 Les isoformes SERCA2
I.2.2.3 Les isoformes SERCA3
I.2.3 Les caractéristiques fonctionnelles des SERCAs
I.2.3.1 Présentation du cycle catalytique
I.2.3.2 Différences fonctionnelles entre les différentes isoformes SERCAs
I.2.4 Les caractéristiques structurales des SERCAs et les relations structure/fonction
I.2.4.1 Caractéristiques structurales générales
I.2.4.2 Les relations structure/fonction
I.3 Expression et purification de protéines membranaires d’Eucaryotes supérieurs
I.3.1 Les différents systèmes d’expression utilisés pour des protéines membranaires d’Eucaryotes supérieurs
I.3.1.1 Utilisation d’un système procaryote, E. coli
I.3.1.2 Utilisation d’un système eucaryote simple : les levures
I.3.1.3 Utilisation de cellules d’insectes
I.3.1.4 L’ovocyte de xénope
I.3.1.5 Les cellules de Mammifères
I.3.1.6 Les systèmes d’expression in vitro
I.3.1.7 Comparaison de ces systèmes pour l’expression hétérologue de SERCA1a
I.3.2 Une étape supplémentaire par rapport aux protéines solubles : la solubilisation
I.3.3 Les systèmes de purification
I.3.3.1 Affinité de la protéine d’intérêt pour un anticorps ou pour un ligand
I.3.3.2 Chromatographie d’affinité de métal immobilisé (IMAC : ImmobilizedMetal Affinity Chromatography)
I.3.3.3 Le système avidine-biotine
I.3.3.4 Quelques variations possibles lors de la purification d’une protéine membranaire
I.4 Objectifs de mon travail de thèse
Chapitre II : Techniques utilisées : principes et protocoles
II.1 Clonage des gènes d’intérêt dans un vecteur navette et transformation de ce vecteur chez la levure Saccharomyces cerevisiae
II.1.1 Description du vecteur navette utilisé
II.1.2 Préparation des constructions chez E. coli
II.1.2.1 Stratégies choisies pour le clonage des différentes SERCA étudiées :95
II.1.2.2 Réalisation, amplification et séquençage des constructions plasmidiques :
II.1.3 Transformation de S. cerevisiae par le vecteur navette
II.1.3.1 Présentation de la souche de levure utilisée :
II.1.3.2 Transformation des levures :
II.2 Expression et purification des SERCAs
II.2.1 Mini expression :
II.2.2 Maxi expression :
II.2.3 Fractionnement
II.2.4 Solubilisation et Cinétique de solubilisation
II.2.5 Purification par le système « avidine » :
II.2.6 Purification par gel filtration en HPLC
II.3 Analyses biochimiques
II.3.1 Analyses par SDS-PAGE et western blots
II.3.2 Dosage des protéines totales :
II.3.3 Mesures de la quantité de détergent présent dans un échantillon
II.3.3.1 Utilisation du comptage en liquide de scintillation
II.3.3.2 Suivi du devenir d’un détergent au cours d’un passage sur colonne de gel filtration en HPLC ou dans les étapes expérimentales suivantes
II.3.4 Reconstitution de l’ATPase en liposomes
II.3.4.1 Ajout de lipides EYPC/EYPA
II.3.4.2 Reconstitution en liposomes de DOPC
II.3.5 Mesure d’activité ATPasique :
II.3.6 Mesure du transport de calcium
II.4 Biologie cellulaire et microscopie
II.4.1 Culture des cellules HEK
II.4.2 Observation de la localisation de SERCA en immunohistochimie
II.4.2.1 Préparation des cellules ou du tissu
II.4.2.2 Observations au microscope à fluorescence ou au microscope confocal.
II.5 Cristallographie :
II.5.1 Principe de la détermination de la structure 3D de protéines par cristallographie aux rayons X.
II.5.2 Préparation en vue de l’obtention de cristaux de SERCA
Chapitre III : Résultats et Discussions
III.1 Mise au point d’une nouvelle technique de purification de SERCA1a
III.1.1 Insertion d’un domaine accepteur de biotine
III.1.2 Expression dans la levure S. cerevisiae
III.1.3 Traitement des membranes avant passage sur colonne de chromatographie
III.1.3.1 Addition d’une étape de décapage
III.1.3.2 Solubilisation
III.1.4 Purification grâce à une chromatographie d’affinité
III.1.4.1 Fixation sur la résine
III.1.4.2 Elution
III.1.4.3 Propriétés de l’ATPase purifiée
III.1.5 Optimisation de la purification grâce à l’ajout d’une étape de chromatographie d’exclusion par la taille en HPLC
III.1.6 Comparaison par rapport à la purification « histidine »
III.1.7 Discussion:
III.2 Essais de cristallisation sur l’ATPase sauvage purifiée et sur le mutant E309Q
III.2.1 Echange de détergent au cours de l’étape de purification par HPLC
III.2.2 Préparation de l’échantillon pour les essais de cristallisation
III.2.3 Obtention de cristaux de l’ATPase sauvage
III.2.4 Essais de cristallisation du mutant E309Q
III.2.4.1 Purification du mutant E309Q
III.2.4.2 Essais de cristallisation du mutant E309Q
III.2.5 Discussion
III.2.5.1 Cristallisation de l’ATPase sauvage
III.2.5.2 Essais de cristallisation du mutant
III.3 Etude de l’isoforme SERCA3
III.3.1 Essais d’expression et de purification de SERCA3a de rat.
III.3.1.1 Expression de SERCA3a de rat dans S. cerevisiae
III.3.1.2 Essai de purification de SERCA3a de rat
III.3.1.3 Tentatives d’amélioration de l’expression de SERCA3a de rat.
III.4 Localisation cellulaire
III.4.1 Analyses de cellules HEK transfectées par un vecteur d’expression contenant ou non SERCA3
III.4.2 Analyses de cellules humaines non transfectées et d’un tissu, la peau
III.4.2.1 Utilisation de lignées cellulaires
III.4.2.2 Analyse d’un tissu humain: la peau
III.4.3 Discussion
III.4.3.1 Essais d’expression et de purification
III.4.3.2 Localisation cellulaire de SERCA3
Chapitre IV : Conclusions et Perspectives
Chapitre V : Bibliographie
Annexes

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