Les différents modes d’association des protéines aux membranes

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La membrane

Mouvements des lipides au sein de la membrane

La phase Lα décrite sur des systèmes modèles (Fig. 22) est la phase la plus représentative des membranes biologiques. Au niveau moléculaire, bien que les différents composants des membranes soient confinés dans des espaces bidimensionnels, leurs mouvements n’en restent pas moins divers. Et les mouvements à petite ou plus grande échelle donnent à la membrane sa fluidité. Cette caractéristique est décrite dans le modèle de Singer et Nicholson (Singer & Nicholson, 1972). Tous les éléments constitutifs de la membrane composent une mosaïque fluide dont la mobilité des éléments leur permet d’interagir de manière plus ou moins transitoire.
La viscosité, unité inverse de la fluidité, représente la résistance au déplacement. Dans une membrane, la viscosité moyenne est de l’ordre de 10-1N.s-1.m-2, soit cent fois la viscosité de l’eau pure. Cependant, les membranes sont des milieux anisotropes dans lesquels la résistance aux mouvements n’est pas la même dans toutes les directions et régions de la membrane.
Les mouvements locaux conférant aux bicouches lipidiques leur fluidité sont illustrés dans la Figure 23.
Ainsi, les lipides se déplacent perpétuellement dans le plan de la membrane et tournent sur leur axe (Fig. 23). Les chaînes aliphatiques sont aussi animées d’un mouvement de balancier. Tous ces mouvements sont très rapides. La mesure du coefficient de diffusion latérale (DL) donne des renseignements précis sur cette dynamique. La mesure de DL est effectuée par FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) sur des systèmes modèles ou sur cellule entière possédant une lipide ou une protéine greffée d’un marqueur fluorescent. Les coefficients de diffusion sont de l’ordre de 10-12m2.s-1 pour un lipide, ce qui correspond à un balayage d’une zone d’environ 1µm2 en une seconde pour la molécule. Toute la dynamique lipidique favorise la mobilité des protéines membranaires malgré une constante de diffusion de translation latérale 1000 fois inférieure à celle des lipides (Lenaz, 1987). Cependant, ce coefficient est dépendant de la taille des molécules, il en découle une mobilité presque inexistante pour les gros complexes protéiques. La diffusion transversale (Fig. 23) des lipides (flip-flop) est beaucoup plus lente que la diffusion latérale. La translocation spontanée d’une face à l’autre d’un lipide nécessite un temps de demi-réaction (t1/2) de 5h pour une molécule de phosphatidylcholine (Bai & Pagano, 1997). Le passage à travers la membrane plasmique est fortement dépendant de la taille et de la charge de la tête polaire qui doit traverser le cœur hydrophobe de la bicouche lipidique. Le flip-flop est assisté par des enzymes : les flippases qui catalysent la diffusion facilitée des lipides et jouent le rôle de transporteurs membranaires. Ainsi, la vitesse de transport est beaucoup plus rapide avec un t1/2 de l’ordre de quelques minutes pour la phosphatidylcholine (van den Basselaar et al., 1978). Il existe également un transport de certains lipides contre un gradient de concentration (aminophospholipide translocase). L’activité de translocation est aussi très active dans le réticulum endoplasmique pour les N-glycosylations et la formation de glycosylphosphatidylinositols. Les précurseurs lipidiques sont synthétisés sur la face cytosolique et sont transportés sur la face luminale pour la synthèse finale (Helenius & Aebi, 2001) (Maeda et al., 2001).

Les domaines lipidiques

La fluidité et la diffusion des lipides membranaires ne sont pas homogènes. Ainsi, existe-t-il des domaines lipidiques composées de lipides saturés tels que des sphingolipides et de cholestérol. Ces derniers peuvent se rassembler étroitement grâce à des interactions non covalentes et former de véritables domaines lipidiques appelés radeaux lipidiques ou rafts. Ils forment un ensemble membranaire dans une phase liquide-ordonnée. Cet état possède un empilement des chaînes acyles tout comme en phase gel, bien que les mouvements de diffusion latérale restent rapides. Cet ensemble est insoluble aux détergents et « flotte » littéralement à la surface membranaire. Le rassemblement des sphingolipides à longues chaînes affecte l’épaisseur de la membrane : la monocouche grossit localement de 6 Å sur une section membranaire pouvant aller jusqu’à 1 µm. (Sprong et al., 2001). Cette modification locale de l’épaisseur membranaire permet le recrutement de certaines protéines membranaires. La ségrégation lipidique et protéique au sein de ces domaines lipidiques serait impliquée dans la transduction du signal et le trafic membranaire. (Anderson & Jacobson, 2002) (Lucero & Robbins, 2004).

Polymorphisme lipidique au sein de la membrane

Bien que les membranes biologiques soient organisées en bicouches planes, certains de leurs composants lipidiques sont capables de former spontanément des assemblages non lamellaires. Ces structures intermédiaires sont observées transitoirement.
Ainsi, la structure de l’assemblage dépend essentiellement de la forme moléculaire des lipides qui la composent. La notion de forme de la molécule lipidique repose sur l’importance relative du volume occupé par la partie hydrophobe par rapport à la partie hydrophile et permet de prévoir quel type d’organisation un lipide adoptera dans l’eau (Cullis & de Kruijff, 1979). Le volume de la tête polaire dépend des atomes qui la composent, de son hydratation ainsi que de sa mobilité. Le volume de la partie hydrophobe d’un lipide est dépendant du nombre d’insaturations en conformation cis : plus elles sont nombreuses et proches de la tête polaire du lipide et plus le volume de la partie hydrophobe de celui-ci sera important. Ainsi, la lysophosphatidylcholine (LPC) qui ne possède qu’une seule chaîne acyle saturée s’organisera en micelle en solvant aqueux, alors que la phosphatidylcholine (PC) s’organisera en bicouche (Fig. 24).
De manière générale, un lipide en forme de cône induit une courbure positive (type micelle) et un lipide en forme de cône inversé (comme la phosphatidyléthanolamine) induit une courbure négative (micelle inversée) (de Kruijff, 1997). Ces différentes organisations peuvent avoir un intérêt physiologique transitoire ou durable (Zimmerberg, 2000). Ainsi, chaque organite possède sa propre courbure de membrane régulée par la composition lipidique. Les organisations non lamellaires sont impliquées dans différents processus biologiques fondamentaux, tels que la synthèse membranaire, le trafic intracellulaire, la division cellulaire, l’infection des cellules par des virus à enveloppe ou encore les phénomènes d’exocytose et d’endocytose.
La Figure 25 illustre l’adaptation locale de la composition lipidique lors d’un phénomène de formation ou de fusion de vésicules. Dans ce cas, la présence de phosphatidyléthanolamine sur le feuillet interne de la membrane permet de créer une invagination. Cependant, les phénomènes de fusion membranaire sont étroitement contrôlés in vivo par les protéines fusogènes. Ainsi, les protéines SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) sont les acteurs majeurs de la reconnaissance et de la fusion de diverses vésicules de transport (Hong, 2005). Elles sont aussi la cible des neurotoxines clostridiales dont l’effet est d’inhiber la libération de neurotransmetteur grâce au clivage spécifique de certaines SNAREs (cf. Introduction Chap.I §4.3) individuelles des lipides jouent un rôle localement sur la stabilisation des protéines insérées dans la bicouche. La présence d’un lipide dans une membrane possédant une courbure différente de la sienne engendrera un stress de courbure. Ce stress va exercer une influence sur la stabilité du système et les interactions avec les protéines membranaires. Mais il est important de noter que les peptides et protéines insérés dans les membranes sont eux aussi responsables de l’organisation membranaire locale.

Potentiel de membrane, constante diélectrique

La membrane constitue un environnement amphiphile : hydrophile au niveau des têtes polaires des lipides et hydrophobe dans la région composée par les chaînes aliphatiques. Elle peut être divisée en trois compartiments de constantes diélectriques différentes. Ainsi, La région des têtes polaires a une constante diélectrique comprise entre 20 et 50 ; la constante diélectrique du cœur hydrophobe est généralement comprise entre 2 et 4. La constante diélectrique de l’eau est 78,5. Ainsi, ces différentes valeurs indiquent-elles un changement des propriétés électriques dans l’environnement de la membrane. Cela indique une diminution de la polarité du milieu comparativement à l’eau.

Influence des propriétés physiques de la bicouche lipidique sur l’activité et la structure des protéines

L’influence des lipides sur la stabilité des protéines insérées est généralement basée sur l’étude des protéines membranaires constitutives. Cependant nous considérons que les protéines amphitropiques sont affectées de manière identique par le milieu membranaire. Ainsi donc, une protéine membranaire transitoire ou constitutive sera considérée de la même façon.
La bicouche lipidique induit des contraintes physiques sur les protéines membranaires, il en résulte une limitation dans l’exploration de l’espace conformationnel de celles-ci. Lorsque elles sont insérées dans les membranes, les protéines sont confinées dans un espace à deux dimensions. Cet espace oriente et structure la chaîne polypeptidique en fonction des interactions établies avec les lipides membranaires.

Influence des têtes polaires

La région de l’interface membranaire contient les têtes polaires, parties chargées des lipides. C’est une région importante de la membrane dont le rôle est de moduler un grand nombre de réactions. La diversité chimique de l’interface membranaire offre de nombreuses possibilités d’interactions avec les polypeptides. Ces interactions sont dépendantes de la taille et de la charge des groupements chimiques présents.
Les têtes polaires créent un réseau bidimensionnel de liaisons hydrogène entre elles et les molécules d’eau. D’autre part, les membranes biologiques contiennent entre 10% et 20% de lipides anioniques. Cela contribue à la création d’un potentiel de surface. Ainsi, les têtes polaires anioniques établissent des interactions électrostatiques répulsives entre elles. Enfin, la faible constante diélectrique (~30) renforce les interactions électrostatiques et les liaisons hydrogène entre les lipides anioniques et les protéines.
Le potentiel de membrane créé par les têtes polaires anioniques conduit au recrutement de contre-ions positifs. Cela a pour conséquence l’augmentation de la force ionique à proximité de la surface de la membrane. On retrouve des protons parmi ces cations. Il en résulte une augmentation locale de leur concentration et donc une acidification du pH local de 1 à 2 unités pouvant s’étendre sur une distance de 5 à 15 Å de la surface (Bychkova et al., 1996) (Prats et al., 1989).
La stabilité des protéines est aussi sensible à d’autres facteurs environnementaux que sont la force ionique et l’interface de la membrane. Ainsi, pour certaines protéines comme la toxine diphtérique, l’augmentation de l’acidité déstabilise la structure de la protéine et favorise ainsi son insertion dans la bicouche lipidique.

L’épaisseur de la bicouche

L’épaisseur de la membrane est en moyenne de 5 nm. Le cœur hydrophobe de la bicouche doit recouvrir les segments transmembranaires de protéines membranaires. Son épaisseur est d’environ 2,5-3 nm. L’épaisseur du cœur hydrophobe de la bicouche lipidique est dépendante de sa composition. Elle dépend de la longueur des chaînes aliphatiques des lipides composant la membrane. L’activité de protéines membranaires reconstituées a montré une dépendance en fonction de la longueur des chaînes acyles (Lee, 2003). Ainsi, un mauvais ajustement entre l’épaisseur du cœur hydrophobe de la membrane et celle du segment transmembranaire conduit à une adaptation de l’épaisseur de la bicouche lipidique à proximité de la membrane (Fattal & Ben-Shaul, 1993). Ce phénomène est illustré dans la Figure 26.

Les systèmes modèles lipidiques

Les membranes artificielles sont des systèmes modèles essentiellement composées de phospholipides. Elles sont utilisées (i) pour étudier les caractéristiques structurales et physico-chimiques d’une membrane lipidique (ii) mais elles sont aussi très largement utilisées dans le cadre de l’étude d’interactions protéine-membrane ou de l’activité de transporteurs protéiques.
Les vésicules lipidiques sont les modèles les plus couramment utilisés. Leurs champs d’applications sont très diversifiés, allant de la biochimie à la cosmétologie en passant par la biophysique et la pharmacologie. Ces vésicules sont constituées d’une bicouche (Fig. 30A) dont la composition lipidique et la taille sont contrôlées. Elles isolent le milieu interne du milieu externe.
De toutes les méthodes de préparation des vésicules lipidiques, la plus simple consiste en l’évaporation du solvant organique dans lequel les lipides sont dissous. Le film lipidique ainsi obtenu est resuspendu dans un solvant aqueux par agitation. Les lipides s’organisent alors en vésicules multilaméllaires (MLVs pour MultiLamellar Vesicles) (Fig. 30B). Les MLVs sont des vésicules lipidiques comprenant plusieurs bicouches lipidiques concentriques et de tailles hétérogènes. Ces propriétés font des MLVs des objets très peu utilisés pour les études biophysiques. En effet, elles diffusent fortement la lumière, ce qui rend difficile les études par spectroscopie optique. D’autre part, leur hétérogénéité en taille dans une même préparation et d’une préparation à l’autre, influe grandement sur la reproductibilité des résultats. C’est pourquoi les vésicules unilamellaires sont plus utilisées.
Les vésicules unilamellaires de petite taille (SUVs pour Small Unilamellar Vesicles) (Fig. 30C) sont obtenues par un traitement physique des MLVs (ultrasons). Ce type de vésicule a un diamètre compris entre 15 et 50 nm et ont un faible volume interne. La forte courbure imposée à la membrane impose que le feuillet externe ait une surface significativement supérieure à celle du feuillet interne, donc un nombre de lipides supérieur. La petite taille des SUVs en fait des objets facilement utilisés en spectroscopie optique.
Les vésicules unilamellaires de grande taille (LUVs pour Large Unilamellar Vesicles) (Fig. 30D) sont aussi très largement utilisées pour l’étude d’interactions protéines-membranes. La technique la plus simple de préparation des LUVs est celle que nous avons utilisée : l’évaporation par inversion de phase (Rigaud et al., 1983). Cette méthode consiste à forcer par sonication l’émulsion d’une phase éther, dans laquelle les lipides sont solubles, avec une phase aqueuse. L’éther est ensuite lentement éliminé par évaporation sous pression réduite. Au fur et à mesure de l’évaporation de l’éther, les lipides se réorganisent de façon à favoriser les interactions entre leurs chaînes hydrocarbonées et l’éther. La structure prend une allure de gel qui se liquéfie lors de l’élimination totale de l’éther. Lorsque l’éther est totalement éliminé des MLVs sont formées et leur taille est comprise entre 0,2 µm et 1 µm. Des passages consécutifs sur un extrudeur équipé d’un filtre dont les pores ont un diamètre défini, vont casser les vésicules multilamellaires et permettre la formation de vésicules unilamellaires dont la taille est centrée autour de 170 nm de diamètre pour des pores de 200 nm de diamètre, 100 nm de diamètre pour des pores de 100 nm de diamètre, 280 nm de diamètre pour des pores de 400 nm de diamètre. La taille et la monodispersité des préparations de vésicules lipidiques sont vérifiées par diffusion dynamique de la lumière. La courbure des LUVs est plus proche de la réalité physiologique que ne l’est celle des SUVs. Les LUVs sont cependant des objets beaucoup plus diffusants ce qui peut poser des problèmes lors de l’utilisation des techniques de spectroscopies (dichroïsme circulaire, fluorescence). En effet, la diffusion due à ces objets peut dans certaines conditions être plus forte que le signal obtenu pour la protéine étudiée.
Des vésicules de très grande taille (GUV pour Giant Unilamellar Vesicle) sont utilisées pour étudier des mécanismes membranaires à l’échelle de la cellule. Leur taille varie de 10 à 100 µm de diamètre.
Le choix du système modèle et principalement celui de la taille des vésicules lipidiques joue un rôle prépondérant dans l’étude des interactions protéine-membrane. Ainsi, le rayon de courbure peut-il influer sur ces interactions. (cf. Chap.II de l’introduction §VI)

Table des matières

INTRODUCTION
PREAMBULE
A – LA TOXINE BOTULIQUE
I – Historique du botulisme
II – Les Clostridium
III – Modes de contamination du botulisme et formes cliniques
III.1 – Modes de contamination
III.2 – Le botulisme humain
III.3 – Le botulisme chez l’animal
IV – Les complexes botuliques
IV.1 – Composition
IV.2 – Passage de la barrière intestinale
V – La toxine botulique
VI – Mode d’action de la toxine botulique
VI.1 – Liaison de la toxine botulique à son récepteur
VI.2 – Internalisation et trafic intracellulaire de la toxine botulique
VI.3 – Activité enzymatique de la chaîne légère
VI.4 – Le domaine de translocation de la toxine botulique
B – LES MEMBRANES BIOLOGIQUES
I – Le modèle de la mosaïque fluide
II – Les interactions protéines-lipides
II.1 – Les différents modes d’association des protéines aux membranes
II.2 – Les protéines intrinsèques
II.3 – Les protéines membranaires transitoires : Amphitropisme
III – Les lipides
III.1 – Les acides gras
III.2 – Les phospholipides
III.3 – Les diacylphosphoglycérides
III.4 – Les sphingolipides
III.5 – Les stéroïdes
IV – Polymorphisme physique des lipides dans l’eau
IV.1 – Diagramme de phase lipide-eau
IV.2 – Concentration micellaire critique (cmc)
IV.3 – Cas des lipides bicaténaires
V – La membrane
V.1 – Mouvements des lipides au sein de la membrane
V.2 – Les domaines lipidiques
V.3 – Polymorphisme lipidique au sein de la membrane
V.4 – Potentiel de membrane, constante diélectrique
VI – Influence des propriétés physiques de la bicouche lipidique sur l’activité et la structure des protéines
VI.1 – Influence des têtes polaires
VI.2 – L’épaisseur de la bicouche
VI.3 – La viscosité membranaire
VI.4 – Effets de la courbure membranaire.
VII – Les systèmes modèles lipidiques
MATERIEL ET METHODES
A – PRODUCTION DE PROTEINES RECOMBINANTES
I – Clonage du domaine de translocation
II – Clonage de Tm et Ts (C454-S877 et K547-S877 respectivement dans la BoNT/A entière)
III – Séquençage
B – EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA PROTEINE
I – Extraction des protéines à partir des culots bactériens
II – Purification par chromatographie d’affinité et repliement
II.1 – Purification sur colonne d’affinité au Nickel
II.2 – Repliement de la protéine recombinante Tm
III – Purification par chromatographie d’exclusion de taille
IV – Dessalage des protéines et lyophilisation
C – OBTENTION DES VESICULES LIPIDIQUES
I – Rappels sur les mécanismes de formations des vésicules lipidiques
II – Préparation des vésicules lipidiques
II.1 – Obtention de petites vésicules unilamellaires (SUVs)
II.2 – Obtention de grandes vésicules unilamellaires (LUVs)
II.3 – Préparation de vésicules lipidiques chargées en sulforhodamine B
II.4 – Caractérisation des vésicules par diffusion de lumière
D – ANALYSES SPECTROSCOPIQUES
I – Dichroïsme Circulaire
II – Fluorescence
II.1 – Fluorescence du Tryptophane
II.2 – Quenching de fluorescence par les lipides bromés
II.3 – Expériences de perméabilisation de vésicules lipidiques
II.4 – Expériences de FRET Tryptophane/Dansyl-DHPE
II.5 -Expériences de partition suivies par centrifugation
II.6 -Expériences de diffusion de la lumière
E – EXPERIENCES DE PONTAGE AU GLUTARALDEHYDE
F – EXPERIENCES D’ECHANGE HYDROGENE/DEUTERIUM
I – Principe général de l’expérience
II – Deutération de l’apomyoglobine
III – Incubation
IV – Cinétiques d’échange D/H
V – Digestion enzymatique
VI – Séparation des peptides par HPLC
VII – Analyses par spectrométrie de masse
VII.1 Principe
VII.2 Analyse par MALDI-TOF
VII.3 Analyse par Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)
RESULTATS
A – BIOLOGIE MOLECULAIRE
I – Stratégie initiale
II – Clonage de la séquence codant pour les domaines de translocation et catalytique de la toxine botulique
II.1 – Mutations
II.2 – Test de production de la protéine recombinante C+T
III – Recours à l’utilisation d’un gène de synthèse
IV – Production et purification
IV.1 – Production et extraction des protéines
IV.2 – Purification des protéines recombinantes
B – CARACTERISATION DE TM EN SOLUTION ET EN PRESENCE DE SURFACTANT FLUORE (C8FTAC)
I – Structure et solubilité
I.1 – Structure en solution à pH7
I.2 – Solubilité en fonction du pH
I.3 – Structure en fonction du pH en présence C8FTAC
C – CARACTERISATION DU COMPORTEMENT DE TM EN PRESENCE DE VESICULES LIPIDIQUES
I – Caractérisation de l’interaction de Tm avec la bicouche lipidique
II – Caractérisation structurale
II.1 – Dichroïsme circulaire
II.2 – Fluorescence intrinsèque du tryptophane
II.3 – Perméabilisation de vésicules lipidiques
II.4 –RESULTATS PRELIMINAIRES : Expériences de pontage au glutaraldéhyde
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
A DISCUSSION
B PESPECTIVES
MECANISME D’INTERACTION DE L’APOMYOGLOBINE AVEC LES MEMBRANES
A – INTRODUCTION
B – RESULTATS
I – Effet du pH
II – Caractérisation de l’interaction de l’aMb avec les membranes
III – Effet de l’aMb sur les vésicules lipidiques lors de son interaction
IV – Changements structuraux
C – CONCLUSIONS
EXPERIENCES D’ECHANGES HYDROGENE/DEUTERIUM SUIVIES PAR SPECTROMETRIE DE MASSE
A – INTRODUCTION
B – PRINCIPES DES ECHANGES H/D
I – Les protons échangeables
II – Facteurs influençant la vitesse d’échange isotopique
III – Mécanismes des échanges H/D
D – RESULTATS
I – Cartographie de l’apomyoglobine
II – Cinétiques globales d’échange H/D
III – Cinétiques locales d’échange H/D
III.1 – Détails de profils isotopiques pour des ions doublement chargés : exemple du peptide 8-15
III.2 – Evolution de la masse moyenne de peptides après digestion enzymatique de l’aMB
D – CONCLUSIONS
CONCLUSION GENERALE
ANNEXES
ANNEXE 1
ANNEXE 2
ANNEXE 3
PUBLICATIONS
BIBLIOGRAPHIE

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