Les différentes étapes de la réalisation des coupes histologiques

Fixation

La fixation permet de préserver les tissus de l’autolyse et du dessèchement qui se mettent en place très rapidement après le prélèvement. Plusieurs liquides de fixation peuvent être utilisés ; ils présentent tous la propriété d’inactiver les enzymes autolytiques contenues dans les lysosomes cellulaires. Il existe de nombreux fixateurs, les principaux seront présentés ici. Le fixateur le plus commun, notamment à l’ENVA, est le formol à 10%. Il est employé pour l’histologie de routine et permet de fixer les grosses pièces. Malgré ses propriétés irritantes pour les muqueuses nasales et oculaires et un effet cancérigène démontré nécessitant de grandes précautions d’emploi, le formol est actuellement le fixateur le plus couramment utilisé. Il présente les avantages d’être bon marché, incolore, il permet l’utilisation de techniques de marquage in situ comme l’immunohistologie. Il pénètre très bien dans les tissus, ce qui est un avantage pour les grosses pièces. En revanche la fixation est relativement lente, sa durée est généralement au minimum de 24 heures. En dessous de cette durée, on risque d’observer une importante hétérogénéité de la fixation au sein d’un même prélèvement.

L’autre grand groupe de fixateur est constitué par les mélanges contenant de l’acide picrique et du formol. Un des plus utilisé est le liquide de Bouin. Il est bien pénétrant et fixe les tissus très rapidement. Il possède également un léger pouvoir de décalcification. Sont également rencontrés le liquide de Hollande, de Halmi et bien d’autres encore. Cependant l’importante toxicité de ces produits ainsi que les inconvénients qu’ils possèdent (altération de la conformation macromoléculaire du prélèvement et incompatibilité avec les automates à inclusion sous vide) en font des fixateurs moins utilisés que le formol aujourd’hui.

Un autre mélange est fréquemment utilisé : le mélange « AFA » (Alcool-Formol-Acide acétique). Il fixe tous types de tissus, agit très rapidement et provoque peu d’altérations morphologiques. En revanche il possède une pénétrance tissulaire moyenne ; de ce fait il est utilisé pour les biopsies plutôt que pour les grosses pièces5,8,20,21,22. La majorité des fixateurs comporte du formol. De ce fait, la manipulation des prélèvements lors de l’étape de macroscopie doit se faire dans les règles de sécurité et avec de grandes précautions3,5,8. Des substituts au formol sont proposés par différents fabricants mais n’ont pas encore été validés pour l’immunohistochimie ou l’hybridation in situ. La fixation doit répondre à plusieurs exigences : elle doit être rapide, le volume de fixateur doit être égal au moins à 10 fois le volume du prélèvement, et la durée de fixation doit être suffisante. Cette dernière dépend de la diffusion du fixateur, de sa concentration et de la densité du tissu. Généralement 24 heures suffisent pour une fixation au formol5,8,18 sur les prélèvements de faible épaisseur (quelques millimètres).

Description macroscopique et recoupe des prélèvements

Cette étape est fondamentale dans l’analyse histologique puisque la lecture et l’interprétation microscopique des lames en dépendent. Elle permet souvent d’ores et déjà d’orienter le diagnostic et la qualité de la réalisation de cette étape permettra le bon déroulement de la suite de l’analyse. L’analyse macroscopique est une observation soigneuse, à l’oeil nu, des altérations tissulaires. Elle permet de vérifier les indications données par le clinicien et de décrire la ou les lésions observées. Cet examen nécessite une bonne connaissance de l’anatomie et une mise en relation avec les données transmises par le clinicien. La recoupe consiste à faire un échantillonnage des lésions de telle sorte que les coupes finales qui sont observées au microscope soient représentatives des lésions. Ainsi, la technique de recoupe doit assurer la conservation des règles de qualité de fixation, de traçabilité, et la qualité de réalisation des échantillons2,3,10,11,14,15,22,23. Il est important de noter que « recoupe » est un terme purement vétérinaire. En médecine humaine, la terminologie est différente, on parle de « macroscopie » et de « section ».

Inclusion

Cette étape permet d’imprégner les tissus par un matériau inerte qui durcit pour obtenir des blocs homogènes, renfermant des organes ou fragments d’organes. La machine utilisée est un automate à inclusion. Il en existe de différents types mais tous suivent la même démarche : renforcement de la fixation, déshydratation, solvant, imprégnation. L’automate de l’ENVA est un appareil autorisant l’emploi de 14 solutions différentes sur 24 heures. La fixation est renforcée à l’aide de 2 bains de formol à 4%. Puis les cassettes sont immergées dans des solvants alcooliques. Cela permet d’effectuer une déshydratation. Plusieurs solvants peuvent être employés : éthanol, butanol. Dans la plupart des cas, sont utilisés 5 bains d’éthanol successifs, le premier à 70°, le deuxième à 95° puis trois à 100°. Les cassettes sont ensuite plongées dans des bains contenant du xylène ou du toluène. L’objectif est de remplacer l’alcool contenu dans les organes par un agent miscible à la paraffine et de rendre les organes plus transparents. Les deux composés cités précédemment sont miscibles à la fois au déshydratant et à l’agent d’inclusion, on parle d’agents « éclaircissants ». Trois solutions de toluène successives sont utilisées à l’école dans l’automate à inclusion. La dernière partie du processus est l’inclusion en paraffine qui permet d’imprégner les tissus. Cette étape se fait à chaud, environ 56°C, étant donnée la température de fusion de la paraffine et compte plusieurs bains. Le temps de séjour dans la paraffine peut évoluer suivant les prélèvements.

Représentativité L’idéal serait que la recoupe soit réalisée par le pathologiste lui-même et que ce soit lui qui lise les lames par la suite car c’est une étape clé. Les coupes doivent représenter de façon la plus fiable possible les lésions. Cela permet d’avoir un diagnostic plus précis. Pour cela la macroscopie se veut être rigoureuse, les prélèvements orientés dans la mesure du possible et les coupes précises et fines. Pour que la représentativité des échantillons soit la meilleure possible, c’est-à-die que ces échantillons doivent posséder les mêmes caractéristiques que l’ensemble de la lésion, plusieurs éléments doivent nécessairement être réunis. D’une part, la rigueur des prélèvements est là encore une qualité indéniable. Le prélèvement chirurgical doit contenir toute la lésion, si celle-ci n’est pas trop grosse, et les marges doivent être orientées. Le prélèvement doit être pertinent si la taille de la lésion est importante. Il est en effet inutile des prélever des zones de nécrose. En revanche le prélèvement de tissus profonds ou de noeuds lymphatiques peut s’avérer intéressant pour le diagnostic et surtout le pronostic. De plus, la taille des prélèvements est importante à considérer. Les biopsies à l’aiguille doivent être multiples pour faciliter le diagnostic et les gros prélèvements ne devraient pas dépasser 2cm (diamètre d’un flacon standard en histologie) afin de permettre une bonne fixation.

D’autre part, les commémoratifs ainsi que les hypothèses diagnostiques doivent être renseignés précisément sur la fiche de demande d’analyse. Cela peut influencer les différentes coupes qui seront réalisées par la suite. Ces deux éléments dont peut dépendre la qualité de l’échantillonnage sont des étapes qui se déroulent bien sûr en amont de l’étape de recoupe et qui, par conséquent, ne dépendent pas du pathologiste. De ce fait il est très important de bien réaliser les prélèvements chirurgicaux qui sont moins bien standardisés en pathologie animale qu’en pathologie humaine.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE: ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I) Du prélèvement à la lame : les différentes étapes de la réalisation des coupes histologiques
1- Les prélèvements
1.1- Biopsies
1.2- Les pièces opératoires
1.3- La nécropsie
2- Fixation
3- Description macroscopique et recoupe des prélèvements
3.1- Principe
3.2- Déroulement pratique
4- Inclusion
5- Enrobage
6- Coupes et coloration
II) La recoupe : objectifs, exigences et contraintes
1- Objectifs
2- Exigences et contraintes
2.1- Représentativité
2.2- Traçabilité
2.3- Standardisation
III) La recoupe en pathologie humaine
1- Données générales, règlementation
2- La recoupe : une activité considérée comme « à risque
2.1- Les risques
2.2- Mesures préventives pour les risques biologiques
3- L’assurance qualité
4- Recoupe et codage
III) Conclusion de la partie bibliographique
DEUXIEME PARTIE: MISE EN PLACE D’UN PROTOCOLE DE RECOUPE STANDARDISE ET CODIFIE
I) Objectifs et intérêts
II) La recoupe à l’ENVA au démarrage de ce travail
1- Méthodologie de la recoupe
2- Documents de la recoupe
3- Compte rendu de la recoupe
III) Données actuelles dans d’autres laboratoires
1- Elaboration d’un questionnaire
2- Résultats
IV) Mise en place du codage
1- Etude préalablement effectuée
2- Problématiques
2.1-Assurance qualité
2.2- Forme
2.3-Difficultés liées au codage
3- Présentation du protocole
3.1- Feuille de recoupe
3.2- Feuille de codage (annexe 4)
4- Précisions concernant la description macroscopique des prélèvements
5- Evaluation du codage
5.1- Evaluation à court terme
5.2- Evaluation à long terme
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES
INDEX

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