Les cytokines et les médiateurs pro inflammatoires

TLRs et Paludisme

Les cytokines et les médiateurs pro inflammatoires sont importants pour l’élimination du parasite mais aussi contribuent à la pathologie. Les TLRs des cellules mononucléaires jouent un rôle important dans la reconnaissance des structures antigéniques conservées et initient les mécanismes de l’immunité innée de l’hôte. Le GPI par exemple, un antigène de surface des parasites protozoaires a été identifié comme activant la réponse immune innée via le TLR2 de l’hôte. Les résultats de l’analyse de l’expression génétique menée sur des modèles de rongeurs et humains ont permis de corréler les voies de signalisation des TLRs avec le paludisme (Krishnegowda et al., 2004).

Des études récentes ont également identifié l’hémozoïne comme pouvant provoquer une activation robuste de la réponse immune innée par la production de cytokines pro inflammatoires. Ceci par l’intermédiaire des TLRs (Cevayir et al., 2005). Dans le modèle murin les auteurs démontrent que cet antigène purifié active les cellules immunitaires par l’intermédiaire du TLR9 et dépendant de la MyD88.D’autres études récentes (Sathit et al., 2004) ont montré que les stades sanguins de P. falciparum activaient les cellules dendritiques plasmacytoides humaines aussi bien que les cellules dendritiques murines à travers des mécanismes dépendants de la MyD88 et TLR9.

Immunogénétique de la réponse de l’hôte face au paludisme

Plusieurs mutations délétères quand elles sont homozygotes, ont été identifiées comme résultant du paludisme. La fréquence élevée de ces mutations dans les zones où le paludisme est endémique est probablement dûe à leur effet protecteur contre le paludisme sévère. Quelques exemples de ces mutations comme la drépanocytose, la déficience en glucose-6- phosphate déshydrogénase, ovalocytose mélanésienne et les thalassémies sont évocateurs. Chacune de ces mutations interfère avec la survie du parasite ou sa capacité à ré infecter des globules rouges. Malheureusement la découverte de ces mutations n’a pas mené au développement de nouveaux traitements ou prophylaxie contre le paludisme. La plupart de ces mutations présentent de sérieuses complications pour l’hôte quand il est homozygote et n’offre aucune application thérapeutique pratique. (R.A burt, 1999) .

Le polymorphisme de cinq de ces molécules a été exploré à ce jour : ICAM-1, TNF-α, IL-1b, iNOS2 (NOS inductible) et CR-1 (récepteur du complément-1). À l’étude de ces cinq gènes candidats, il faut rajouter celles concernant la mannose binding protein (MBP), protéine jouant un rôle dans l’immunité innée, et l’HLA-B53, antigène leucocytaire de classe I. Le seul résultat clair concerne le TNF-α. Pour les autres polymorphismes, soit aucune association n’est retrouvée (IL-1RA, CR-1, MBP), soit les résultats sont géographiquement hétérogènes (ICAM-1, HLAB53) ou contradictoires (iNOS2).

TNF-α (Tumor necrosis factor alpha)

Dont le gène est localisé dans le locus HLA est un très bon candidat pour l’étude du contrôle génétique du paludisme. Plusieurs auteurs ont en effet détecté une association entre les fortes productions de TNF-α et le neuropaludisme tant chez l’homme que chez les modèles animaux (Grau, et al .,1987 .; Grau et al., 1989 .; Kwiatkowski et al., 1990), et une étude familiale a mis en évidence un contrôle génétique de la production de TNF-α (Westendorp et al., 1997). Trois polymorphismes ont été identifiés en position –376, -308 et –238 dans la région promotrice du gène de TNF-α et certains de ces polymorphismes sont fonctionnels.

Le TNF-α sécrété par les monocytes activés lors de l’infection par Plasmodium agit sur un grand nombre de cellules, et exerce différents rôles dans la réponse immunitaire anti-plasmodiale. Le TNF-α a une action antiparasitaire directe sur les stades érythrocytaires en inhibant leur croissance in vitro et in vivo (Orago et al., 1993; Taverne et al., 1987). De plus, le TNF-α favorise l’élimination des mérozoïtes et des stades sanguins par les cellules effectrices en stimulant la phagocytose et la production de radicaux oxygénés (Kumaratilake et al., 1992b; Kumaratilake et al., 1991; Kumaratilake et al., 1990; Kumaratilake et al., 1995; Ockenhouse et al., 1984b; Rockett et al., 1992). De part ses propriétés pyrogènes, le TNF-α peut aussi être impliqué dans l’inhibition de la croissance du parasite provoquée in vivo par l’augmentation de la température corporelle (Kwiatkowski, 1989). Le TNF-α stimule en effet l’expression à la surface des cellules endothéliales de molécules d’adhésion comme ICAM-1, VCAM-1 et la E-selectine qui interviennent dans les phénomènes de cytoadhérence du neuropaludisme (Berendt et al., 1989; Grau et al., 1987; Grau et al., 1991; Ockenhouse et al., 1992; Turner et al., 1994). D’autre part, le TNF-α stimule la production de NO par les cellules endothéliales au niveau des microvaisseaux.

Interféron gamma

L’IFN-γ est cytotoxique in vitro pour les stades hépatiques (Ferreira et al., 1986; Mellouk et al., 1987) et érythrocytaires (Jacobs et al., 1996). L’action de l’ l’IFN-γ n’est cependant pas toujours directe, mais souvent associée à l’activation de cellules effectrices. Ainsi, in vitro l’IFN-γ augmente l’activité anti-parasitaire des monocytes/macrophages (Ockenhouse et al., 1984a) et des neutrophiles (Kumaratilake et al., 1991), en stimulant la phagocytose et la production de molécules cytotoxiques comme le NO (Anstey et al., 1996), les radicaux oxygénés H2O2 , et le TNF-α. En zone d’endémie, l’ IFN-γ est associé à la protection contre la réinfection (Luty et al., 1999), ou à une diminution de l’infection (Ferreira et al., 1986; Herrera et al., 1992), alors que dans d’autres études, la production d’ IFN-γ par les cellules mononuclées in vitro, est associée à une augmentation du risque d’accès palustres simples (Riley et al., 1991b). De plus, dans un modèle murin d’infection par P. berghei ANKA, l’ IFN-γ a été impliqué dans le neuropaludisme (Grau et al., 1989).

Génétique du contrôle des parasitémies sanguines

Des analyses de ségrégation des niveaux d’infection sanguins ont été menées dans 2 populations au Cameroun. Abel et al, en 1992 examinaient 42 familles camerounaises venant d’une ville nommée Edéa sur une période de 2ans et demi. Durant ce temps 10 échantillons de sang ont été prélevés par participant et les densités parasitaires ont été déterminées. Les résultats suggèrent qu’un gène majeur récessif serait responsable du contrôle de la densité parasitaire. La fréquence du gène a été estimée à 0,44 -0,48 et 23% de la population est prédisposée à un haut niveau d’infection.

En résumé les processus conduisant à la pathogenèse sont mal connus. Il est admis qu’une charge parasitaire sanguine élevée est un facteur de risque pour la survenue des accès simples et sévères. Ainsi, en contrôlant la charge sanguine, certains gènes pourraient jouer un rôle dans la protection clinique. Ces gènes sont donc des candidats intéressants pour l’analyse du contrôle génétique des accès simples et sévères. Ces gènes pourraient contrôler efficacement la parasitémie en induisant une forte réponse anti parasitaire mais en contre partie, il est possible qu’une telle réponse puisse favoriser la pathogenèse. Les cytokines pro inflammatoires telles que TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-1 et l’oxyde nitrique produit durant l’infection palustre sont critiques pour le contrôle du développement du parasite. Cependant, une production excessive de cytokines peut aboutir à des sévères conditions pathologiques.

Cas spécifique de l’enfant: Acquisition de l’immunité antipalustre

L’expression du paludisme chez l’enfant est sous la dépendance de multiples facteurs conditionnant l’acquisition de l’immunité: les modalités d’exposition au P. falciparum de la naissance à l’âge adulte, les facteurs génétiques modulant la vulnérabilité à l’infection palustre et d’autres facteurs d’environnement.

L’acquisition de l’immunité se fait au prix d’une forte morbidité et d’une mortalité élevée. Elle est sous la dépendance étroite du niveau de transmission.

Le support immunologique intime de cette protection n’est pas encore bien connu.

On évoque deux types d’immunité :

Immunité antiparasitaire

Développée au prorata des expositions répétées aux plasmodies, ce qui permettrait aux enfants plus âgés de maintenir leur parasitémie au dessous d’un seuil pyrogène, diminuant ainsi progressivement avec l’âge l’incidence et la durée des accès cliniques. Cette immunité aurait un support cellulaire contrôlé par des lymphocytes T et un support humoral (IgG1 et IgG3).

Immunité antitoxique

Elle apparaît rapidement dès les premières infections et qui est à l’origine de la tolérance de la parasitémie, même à des taux très élevés ainsi une association entre l’âge et la densité parasitaire.

Méthodes de diagnostic

Morphologiques

Les techniques de la goutte épaisse et du frottis mince sont les méthodes les plus anciennes et toujours utilisées en laboratoire. Elles sont basées sur l’observation directe au microscope de la morphologie des différents parasites.

Immuno-chromatographiques

Récemment des méthodes immuno-chromatographiques de diagnostic rapide ont été mises au point. Ce sont des tests basés sur la reconnaissance d’antigènes des parasites par des anticorps monoclonaux conjugués dirigés contre ces antigènes. Le complexe antigène anticorps (et donc la présence du parasite) est révélé par une réaction colorée. Plusieurs tests existent dont le test Optimal-IT™ où l’antigène considéré est la lactate Déshydrogénase (LDH), Parasight F™ et Core ™Malaria Pf basés sur la capture de la protéine Histine rich protein 2 (HRP2).

Biologie moléculaire

Le diagnostic peut également être réalisé à l’aide de la technique de la PCR (Polymerase chain reaction). Cette méthode permet en plus d’étudier l’empreinte génétique de cette espèce à condition d’avoir des marqueurs moléculaires.

Les marqueurs sont des gènes à une seule copie dans le génome haploïde du parasite. Ils peuvent être utilisés pour estimer le nombre de parasites circulants dans le sang périphérique, à condition qu’ils soient suffisamment polymorphiques. Les gènes candidats dans ce but doivent être stables durant la phase asexuée du cycle de vie du parasite et avoir une seule copie du gène par génome parasitaire haploïde (Koita., 2000). Cette PCR avec de tels marqueurs est souhaitable pour l’étude de la dynamique de populations parasitaires.

Le diagnostic par la PCR utilise généralement des marqueurs de gènes à copies multiples, dans la plupart des cas ces séquences de gènes doivent être conservées et capables de discriminer les espèces.
Au cours de cette étude nous avons utilisé des marqueurs moléculaires des gènes à une seule copie, Il s’agit des amorces du Bloc 2 du gène MSP-1. En se référant à la séquence du gène de MSP-1 publiée par Miller et al., en 1993. Nous avons utilisé trois paires d’amorces s’hybridant au niveau des régions conservées des blocs 1 à 5. De ce fait, chacun des allotypes est traité avec deux amorces spécifiques, mises au point à partir des séquences de chacune des souches: K1, MAD20 et RO33.

MSP-1 de P. falciparum

Ce gène est situé sur le chromosome 9, il code pour une glycoprotéine de 195 kDa qui est synthétisée au cours de la schizogonie érythrocytaire. Le séquençage du gène de la protéine MSP-1 a permis de le diviser en 17 blocs. Grâce à la comparaison des données de séquences provenant de nombreux isolats. Le bloc 1 contenant la séquence signal est hautement conservé. Il est suivi du Bloc 2 qui a 3 répétitions de tri peptides de type S-XX.

En se basant sur ces répétitions 2 formes (allotypes) ont été décrites le K1 (Karnjanaburi-1) et le MAD20 (Madang) allotypes de Thaïlande et de Papouasie nouvelle guinée respectivement (Tanabe et al., 1987). Plus récemment un 3ème bloc 2 allotypique (RO33) a été retrouvé au Ghana (Certa et al., 1987) et en Thaillande (Peterson et al.,1988b). Une forme hybride entre MAD20 et RO33 a été récemment découverte (Koita, 2000) .Les autres blocs 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14,15, et 17 sont dimorphiques et ils peuvent être des allotypes soit K1 ou MAD20. En revanche les blocs 1, 3, 5,12 et 17 sont relativement conservés. Le bloc 17 est riche en cystéine et possède une séquence d’ancrage pour la molécule de glycosylphosphatidylinositol (GPI) par lequel la protéine MSP1 est attachée à la membrane du parasite.

La Polymerase Chain Reaction (PCR) ou Réaction de Polymérisation en Chaîne

Définition et Principe de la PCR

Mise au point par Karry Mullis en 1985, la PCR est une technique d’amplification génique, c’est à dire qu’elle permet de repérer un fragment d’ADN ou de gène précis, même présent en quantité infime dans un mélange, puis de le multiplier rapidement. Le principe de la PCR est d’utiliser de manière répétitive l’une des propriétés des ADN polymérase: celle de ne pouvoir synthétiser un brin complémentaire d’ADN qu’à partir d’une amorce.

Les réactifs utilisés

Les amorces 

Les amorces de la PCR sont des oligonucléotides longs de 18 à 30 nucléotides qui peuvent s’apparier aux séquences complémentaires des matrices d’ADN.
Elles s’apparient sur les brins opposés de la séquence cible de sorte qu’ils puissent être allongés les uns vers les autres par addition de nucléotides à partir de leur extrémité-3 (réaction de polymérisation).

L’enzyme

Une importante avancée technologique est venue de la découverte d’une bactérie vivant dans les eaux chaudes et ayant une ADN polymérase. Cette enzyme est efficace à des hautes températures. L’espèce Thermus aquaticus vit dans l’eau à une température de 72°C. Son ADN polymérase appelé Taq polymérase a une température optimale de 72°C et est raisonnablement stable à 94°C. Deux formes de Taq sont disponibles, une native et l’autre obtenue par génie génétique. Les 2 formes de la polymérase portent une activité 5’-3’ de polymérisation exonucléasique dépendante mais elles ne disposent pas d’une activité 3’-5’ exonucléasique. Un excès d’enzyme peut conduire à des amplifications non spécifiques.

Méthodes utilisées pour l’étude de l’expression génétique

Isolation d’ARN total : récupération du matériel génétique

De nombreuses sociétés commerciales proposent actuellement des kits pour l’isolation d’ARN à partir du sang périphérique. Néanmoins elles reposent toutes les mêmes principes. Les cellules sont homogénéisées dans un tampon contenant un détergent puissant à haute concentration (SDS ou Sarcosyl), un agent dissociant (chlorure ou thiocyanate de guanidine), une solution tampon (acétate) et un agent réducteur à haute concentration (2- mercaptoéthanol ou DTT). Ce tampon permet d’inhiber les RNases endogènes et de dénaturer les acides nucléiques et enfin dissocier les protéines qui pourraient être fixées. Quelle que soit la technique l’ARN doit être ensuite lavé par de l’acétate de sodium 3M pH 5 et précipité à l’éthanol. (Cf. : Biologie moléculaire et médecine .2ème édition).

Techniques d’analyse des ARN

Chez l’homme il existe environ 30000 gènes répartis sur 24 chromosomes. Un gène est un court fragment d’ADN contenant une information spécifiant un produit nécessaire à l’activité cellulaire.
Les gènes ubiquitaires qui sont utilisés comme contrôle interne dans le Northern blot, la Real time reverse transcriptase PCR ainsi que par la technologie des microarrays sont des gènes qui s’expriment dans n’importe quel tissu donc n’importe quel type cellulaire. Par exemple le Glyceraldehyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) est une enzyme catalytique impliquée dans la glycolyse dans le cytoplasme, la fusion membranaire, construction des microtubules, activité phosphotransférase, exportation d’ARN nucléaires, la réplication de l’ADN, la réparation de l’ADN. . …… Cette enzyme est exprimée dans presque tous les tissus à des niveaux élevés.

Nuclease protection assays (NPA)

Il s’agit d’une technique incluant la ribonucléase protection assays (RPAs) et S1 nuclease assays, sont des méthodes très sensibles pour la détection, la quantification des ARNs spécifiques dans une mixture complexe d’ARN cellulaire. Elles sont constituées par une solution d’hybridation de sondes monobrins antisens de petite taille de l’échantillon d’ARN. Après l’hybridation, toutes les sondes non hybridées restantes ainsi que l’échantillon d’ARN sont éliminés par digestion enzymatique avec une mixture de nucléases. Les nucléases sont ensuite inactivées et les hybrides sondes cibles restants sont précipités. Ces produits sont séparés sur gel de polyacrylamide et visualisés par autoradiographie.

Hybridation in situ

On appelle hybridation in situ (HIS) l’utilisation de sondes d’acides nucléiques pour mettre en évidence et localiser , dans les cellules ou les tissus , des séquences d’acides nucléiques, complémentaires de la sonde par leurs bases. L’HIS est un outil pour étudier l’expression des gènes. Elle est très proche dans son principe des Southern et des Northern Blots et repose comme eux, sur l’hybridation d’une sonde d’acide nucléique (ADN ou ARN) marquée avec une séquence complémentaire d’acides nucléiques que l’on cherche à identifier et à localiser.

Northern Blot 

Cette technique permet de mesurer les niveaux d’expression relatifs de l’ARN messager. Il consiste en une isolation de l’ARNm suivie d’une purification. Une électrophorèse sur gel d’agarose est ensuite effectuée suivie d’un transfert physique de l’ARNm sur une membrane de nylon (le blot). Le blot est sondé par hybridation avec un fragment d’ADN provenant du gène à étudier.

Real Time Reverse Transcriptase PCR

Il s’agit ici d’amplifier des ADNc qui sont en fait les brins d’ARN messager retranscrit en ADN par une reverse transcriptase. Elle est basée sur le même principe que la PCR classique. Cette technique a l’avantage de pouvoir estimer la quantité de l’ADN au cours de l’amplification. La chimie de Taq Man est l’une des plus utilisées :

La chimie Taq Man 

Cette chimie permet d’obtenir un signal fluorescent à partir d’une sonde bi marquée et dont l’augmentation de fluorescence est proportionnelle au produit de PCR. Elle est appelée chimie Taq Man (brevet déposé par Hoffmann La Roche) et la sonde est appelée « sonde Taq Man ». Le principe de cette chimie repose sur la fonction exonucléasique5’-> 3’ de la Taq Polymérase. La sonde est un oligonucléotide spécifique d’un morceau interne à la séquence amplifiée. La sonde est marquée en 5’ par un fluorophore appelé ‘reporter’ et en 3’ par un autre type de fluorophore appelé ‘quencher’. Le spectre d’émission du reporter chevauche le spectre d’excitation du quencher. L’émission du reporter est atténué ou ‘quenché’ (éteint) par la proximité du quencher. Si la sonde est dégradée par l’activité exonucléasique de la Taq, les fluorophores ne seront plus reliés entre eux et l’émission du reporter sera augmentée. L’augmentation du signal correspondant à la composante du fluorophore reporter est proportionnelle au nombre de copies polymérisées à chaque cycle de la PCR.

Un des avantages des sondes Taq Man, particulièrement pour la quantification réside dans le fait que la fluorescence ne dépend pas seulement de la présence de la séquence cible, mais aussi de l’amplification de la cible. Cependant, à l’instar des sondes molecular beacons®, les sondes Taq Man® doivent être conçues individuellement pour des cibles spécifiques.

Principe de fonctionnement

Comme cité précédemment le principe des microarrays est basé sur la technique d’hybridation. Immobilisés sur un support solide (matrice), des oligonucléotides (simples brins) spécifiques de différents gènes ou ADNc connus constituent les sondes dont le rôle est de détecter des cibles marquées complémentaires, présentes dans le mélange complexe à analyser (ARNm extraits de cellules, tissus ou organismes entiers et convertis en ADNc). Les sondes sont soit greffées sur le support, soit synthétisées in situ (unité d’hybridation = plot). Les signaux d’hybridation sont détectés par fluorescence.

Méthode de fabrication et design des puces

Fabrication de la puce

Les sondes sont synthétisées soit in situ (sur la puce) ou par synthèse conventionnelle suivie par une fixation sur la puce. Elles sont généralement appelées puces à ADN ou puces à oligonucléotides. Ce type de puce a été développée par Affymetrix sous le nom Gene Chip®. A chaque gène correspondent 11 à 20 paires de sondes synthétisées sur la puce.

Chaque paire de sondes possède 2 oligonucléotides :
− Perfect macth (PM, séquence de référence) ATG….C….TGC (20- 25 bases);
L’échantillon d’ARN est marqué par la biotine et hybridé à la puce. La sonde hybridée à l’échantillon est rendue fluorescente par la fixation de la streptavidine-phycoérythrine (fluorochrome devenant fluorescent lorsqu’il est excité par un faisceau lumineux). La quantité de lumière émise à 570nm est proportionnelle à la fixation de la cible à chaque localisation de la collection de sondes. Le rôle de chaque sonde est de reconnaître, dans le mélange appliqué à la surface de la biopuce, une séquence cible. La phase d’hybridation est réalisée dans une sorte d’incubateur (station fluidique) et suivie d’un lavage destiné à débarrasser la puce des cibles nucléiques non hybridées.

La détection des hybridations consiste à repérer les adresses des sondes qui sont complémentaires des cibles de l’échantillon à tester. Une lecture optique effectuée par un scanner (GeneChip®Scanner 3000 ou le GeneArray®Scanner) permet de révéler les sondes devenues fluorescentes (hybridées avec les cibles marquées). Les données récoltées sont analysées par un logiciel traitement d’images.

Table des matières

I. INTRODUCTION 
OBJECTIFS
II. GENERALITES 
1. Epidémiologie
2. Cycle de vie du parasite
3. Physiopathologie
4. Système immunitaire de l’hôte
4.1 Immunité innée
4.2 Immunogénétique de la réponse de l’hôte humain
5 Cas spécifique l’enfant
6. Méthodes de diagnostic
7. Les molécules antipaludiques
8. Les méthodes utilisées pour l’étude de l’expression génétique
8.1 Isolation d’ARN total
8.2 Techniques d’analyse des ARN
9. Aspects spécifiques et challenges
IV. METHODOLOGIE 
1. Démarche méthodologique
2. Matériels et méthodes
2.1 Cadre et lieu d’étude
2.2 Population d’étude
2.3 Période d’étude
2.4 Echantillonnage
2.5 Organisation du travail
2.6 Techniques de l’étude
2.7 Analyse Microarray
2.8. Validation des données par la qRT-PCR : Méthode de Taq Man
V. RESULTATS
1. Identification des patients
1.1 Résultats cliniques
1.2 Résultats parasitologiques
2. Optimisation des techniques de lymphoséparation
3. Examen des molécules d’ARN total
3.1 Evaluation de la concentration et la pureté des échantillons
3.2 Evaluation de l’intégrité des échantillons par électrophorèse
3.3 Validation des échantillons par le Bioanalyser 2100 Agilent
4. Résultats des microarrays
4.1 Résultats par comparaison des stades A et C
4.2 Résultats par comparaison des stades A, B et C
4.3 Résultats par comparaison des stades A, B et C avec seuil de filtrage 1,5
VI. COMMENTAIRES ET DISCUSSION 
VII. CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS 
VIII. ANNEXES
Annexe 1 : Extraction d’ADN génomique avec le QIAmp® DNA Mini Kit
Annexe 2 : Extraction d’ARN avec le Kit RiboPure™-Blood 
Annexe 3 : Protocole pour l’électrophorèse d’ARN total
Annexe 4 : Lavage de l’ARN total avec le Kit Rneasy® Cleanup
IX. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
X. RESUME

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