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La pression partielle en oxygène
Les bactéries peuvent être classées en plusieurs groupes suivant leur rapport avec l’oxygène :
– les bactéries aérobies strictes : elles ne se développent qu’en présence d’oxygène.
– Les bactéries microaérophiles : elles se développent mieux ou exclusivement lorsque la pression partielle en oxygène est inférieure à celle de l’air.
– Les bactéries aéro-anaérobies facultatives : qui se développent avec ou sans oxygène.
La majorité des bactéries d’intérêt médical se retrouve dans le groupe des bactéries aéro-anaérobies facultatives.
– Les bactéries anaérobies strictes : elles se développent qu’en absence totale d’oxygène qui est toxique pour elles. Cette toxicité s’explique par la production de radicaux superoxyde que les bactéries anaérobies ne peuvent détruire du fait de l’absence de superoxyde dismutase et ou de l’absence d’une activité enzymatique à type de catalase et de peroxydase.
Les substances antibactériennes
Certaines substances antibactériennes peuvent inhiber la croissance bactérienne : c’est le principe des milieux sélectifs. Exemple : GSC + gentamicine à 6mg/l
C’est un milieu sélectif pour Streptococcus pneumoniae
ETUDE DE LA CROISSANCE BACTERIENNE
MESURE DE LA CROISSANCE BACTERIENNE (4)
La mesure de la croissance bactérienne permet de connaître la concentration cellulaire (nombre d’individus par unité de volume) et l’état physiologique de cette population (croissance rapide, état stationnaire)…
Cette mesure de la croissance peut se faire en milieu solide comme en milieu liquide.
La mesure de la croissance bactérienne fait intervenir deux groupes de méthodes.
Les méthodes indirectes :
– La numération totale en dénombrant au microscope ou avec des compteurs spéciaux les individus viables ou non.
– La numération viable en dénombrant les colonies auxquelles ont donné naissance les bactéries viables en partant du principe qu’une bactérie donne naissance à une colonie.
NB : Quelle que soit son activité métabolique ou génétique, une bactérie est dite non viable si elle est incapable de former une colonie.
Les méthodes directes
– La détermination du poids sec
Les bactéries sont lavées, séchées, et pesées. On supposera qu’un milligramme de poids sec correspond à quelques milliards de corps bactériens.
– Le dosage de l’azote bactérien
– Mesure de l’activité enzymatique des bactéries (méthode est peu précise) ;
– Mesures optiques par turbidimétrie
La culture bactérienne peut absorber ou réfléchir la lumière qui passe à travers elle. Dans certaines limites, la lumière absorbée ou réfléchie par la suspension bactérienne peut être directement proportionnelle à la concentration de cellules de la culture pour une longueur d’onde donnée. Pour de telles déterminations, on utilise un spectrophotomètre qui permet de mesurer la turbidimétrie, on exprime ses valeurs sous forme d’absorbance (A).
Cette méthode est rapide et précise, cependant elle n’est applicable qu’à partir de 107 bactéries par ml de culture.
La longueur d’onde choisie est celle correspondante au minimum d’absorption pour le milieu de culture.
CINETIQUE DE LA CROISSANCE BACTERIENNE :
Pour une population bactérienne homogène se développant en milieu liquide dans des conditions de culture stables, le nombre de cellules double à chaque génération.
Quand on ensemence un milieu nutritif neutre composé de quantités limitées d’aliments nécessaires à la croissance microbienne, on constate que plusieurs phases de croissance se succèdent, caractérisées par des variations de la constante de croissance .Il y a successivement :
– une phase de latence : le taux de croissance est nul. elle correspond au temps nécessaire à la bactérie pour synthétiser les enzymes adaptées au substrat ;
– une phase de croissance exponentielle : le taux de croissance augmente pour atteindre un maximum, les enzymes sont synthétisées et le métabolisme se déroule normalement ;
– une phase de ralentissement : la vitesse de croissance régresse du fait de l’appauvrissement du milieu de culture et d’une accumulation des déchets ;
– une phase stationnaire : le taux de croissance devient nul, les bactéries qui se multiplient compensent celles qui meurent ;
– une phase de déclin : le taux de croissance devient négatif, toutes les ressources nutritives du milieu sont épuisées et il y a accumulation de métabolites toxiques ; cependant, il peut persister une croissance par libération des substances lors de la lyse : on parle de croissance cryptique.
RAPPEL SUR LES SOUCHES BACTERIENNES
HAEMOPHILUS INFLUENZAE
Historique (1)
Il a été observé dans l’exsudat de conjonctivites purulentes par KOCH en 1883 en Egypte puis en 1886 aux USA par WEEKS et signalé dans un traité de 1889 sous le nom de Bacillus aegyptius. Au cours de la pandémie de grippe de 1889 à 1892, Pfeiffer a observé et cultivé à partir de crachats de grippés, un petit bacille, Bacillus influenzae et en a fait l’agent étiologique de la grippe ou influenza. Il a montré le rôle indispensable du sang dans la culture de cette bactérie et a inventé la gélose au sang.
Le nom du genre Haemophilus a été proposé en 1917.
En 1930 Miss M. Pittman met en évidence l’existence de souches capsulées, propose des types sérologiques et montre la prédominance du type b dans les méningites et autres infections aiguës suppurées.
Caractères morphologiques (3)
Haemophilus influenzae se présente sous forme de petits bacilles ou coccobacilles de 0,3μ à 0,4 μ de diamètre sur 1 à 1,5μ, non sporulés, immobiles, généralement capsulés et gram négatif avec parfois une coloration bipolaire. Dans certains produits pathologiques (crachat, LCR) ou en culture le polymorphisme s’accentue.
La capsule tend à disparaître au cours des repiquages.
Caractères culturaux (36)
Haemophilus influenzae ne peut pousser que sur des milieux de culture enrichis en sang , lesquels apportent les deux facteurs que sont l’hémine ( ou facteur X ) et le facteur V ( NAD ou nicotinamide adénine dinucléotide ). Cette double exigence permet de le distinguer des autres espèces et notamment Haemophilus parainfluenzae qui nécessite que du NAD. Cependant, comme le sang frais contient également des inhibiteurs du facteur V, il est nécessaire d’utiliser des milieux d’isolement au sang cuit (75 – 80 °C pendant 15 minutes).
A l’inverse, un chauffage excessif détruit le NAD, il est donc important de s’assurer de la qualité des milieux de cultures pour Haemophilus.
En anaérobiose, la croissance d’Haemophilus influenzae n’est pas dépendante de l’hémine, ce qui peut être source de difficultés d’identification. L’exigence en NAD peut être recherchée sur des milieux additionnés de NAD purifié, ou par la mise en évidence d’un satellitisme d’Haemophilus influenzae autour des colonies de Staphylococcus aureus (qui produisent du NAD). Après 24 heures de culture à 37°C sur gélose – chocolat, Haemophilus influenzae donne des colonies lisses, convexes grisâtres, translucides, de 0,5 à 1 mm. Les souches encapsulées donnent des colonies mucoïdes de plus grosse taille. Certaines espèces nécessitent pour leur croissance une atmosphère enrichie en CO2.
Caractères biochimiques
Huit biotypes (I à VIII) ont été définis pour l’espèce Haemophilus influenzae à partir des caractères métaboliques suivant : production d’indole, activités enzymatiques uréase et ornithine décarboxylase (23). Le biotype I est plus fréquemment retrouvé dans les méningites et le biotype IV dans les infections génitales (23 ).
Haemophilus influenzae possède une catalase et une peroxydase.
Un certains nombre de caractères biochimiques et enzymatiques permettent dans certains cas de le différencier des voisines. Ces caractères sont rassemblés dans le tableau I (3 , 4 ).
Caractères antigéniques :
La capsule :
Six variétés antigéniques (a, b, c, d, e, f ) ont été décrites par PITTMAN en fonction de la structure antigénique du germe (27). La spécificité de type dépend de la composition en polysaccharides de la capsule. Différents sucres ont été individualisés : glucose, ribose, galactose, acide mannuronique Seul le polysaccharide de type b, constitué de polyribosyl ribitol phosphate ou PRP a une structure composée de deux riboses. L’association fréquente entre sérotype b et biotype I semble être une conséquence de la diversité génétique limitée des Haemophilus influenzae de type b (23). La majorité des pathologies invasives chez l’enfant ( méningites, septicémies, arthrites) est due aux souches capsulées de type b en raison du rôle majeur du PRP comme facteur de virulence.
La membrane externe
Comme tous les bacilles gram négatif, Haemophilus influenzae possède une membrane externe constituée de protéines, de porines, de phospholipides et de lipo- oligosaccharides ( LOS ). Les LOS sont constitués de lipide A, de 2 ceto 3 desoxyoctonate et d’oligosaccharides (23). Les profils electrophorétiques des LOS permettent de définir des sous-types utilisables dans les études épidémiologiques. L’ activité endotoxinique est liée à la proportion lipidique A. C’est la lyse des LOS avec libération de lipide A qui est responsable de choc septique à Haemophilus influenzae ( 27 ). Les protéines de membrane externe (PEM), très immunogènes, représentent des facteurs de virulence chez les souches de Haemophilus influenzae en particulier celles non capsulées ( 29 ). Pili ou fimbriae :
La présence de pili ou fimbriae, mise en évidence chez Haemophilus influenzae, confère à la bactérie des propriétés d’adhésion à la muqueuse nasopharyngée, étape précédant l’invasion sanguine et méningée.
Chez Haemophilus influenzae de type b, la piliation permet de définir 5 sérotypes.
Pour Haemophilus influenzae de type b, les souches isolées du LCR et du sang sont le plus souvent non piliées contrairement à celles isolées du rhinopharynx (24).
Identification d’Haemophilus influenzae (1, 3)
L’identification formelle de haemophilus influenzae porte d’abord sur la mise en évidence de l’exigence en facteurs de croissance. Différentes méthodes permettent d’étudier cette exigence :
– le phénomène de satellisme sur gélose au sang avec un strie de Staphylococcus aureus qui réalise un apport en facteur V ;
– l’utilisation de milieux complémentés avec l’un et ou l’autre facteur ;
– l’utilisation de disques contenant l’un et ou l’autre facteur et qui sont
déposés à la surface d’un milieu gélosé.
L’identification est ensuite complétée par la macroscopie, la microscopie et l’étude des caractères biochimiques présentés dans le tableau I.
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
Historique(13) :
Il est découvert pour la première fois par Louis Pasteur en 1880.
En 1923, GRIFFITH observa que le pneumocoque virulent possédait une capsule donnant aux colonies un aspect lisse (S). Avec HEIDELBERGER, AVERY montra que la capsule était un polysaccharide et non une protéine ou un complexe de molécules diverses .
En 1944, AVERY, Mac Leod et Mac Carthy établissent les bases de la génétique bactérienne en montrant que l’ADN est le facteur transformant chez les pneumocoques.
Caractères morphologiques(3)
Le pneumocoque se présente sous forme de cocci gram positif sphériques ou ovoïdes disposés en paire pour former des diplocoques donnant l’aspect de flamme de bougie ou de 8. Cependant, il faut noter que cet aspect n’est pas toujours évocateur. En effet, si l’environnement est carencé en magnésium, on peut observer des chaînettes relativement longues.
Caractères culturaux(5,9)
La culture du pneumocoque peut se faire dans un intervalle de température allant de 25 à 42˚C, mais en routine le germe se cultive à 37˚C. La culture se fait à un pH de 7,5 sur des milieux nutritifs riches comme la gélose au sang de cheval ou de mouton (5 à 10 %) sous une atmosphère de 5 à 10 % de CO2. L’addition d’antibiotique comme la gentamicine ou l’acide nalidixique rendrait le milieu plus sélectif.
CONSERVATION DES SOUCHES BACTERIENES(15)
Les souches bactériennes exigeantes comme leur nom l’indique, sont difficiles à conserver et nécessitent des milieux de conservation particuliers qui tiennent compte de leurs exigences.
Les milieux de conservation varient suivant l’espèce à conserver.
Exemple :
– Pour Haemophilus influenzae on conserve sur : Bouillon MH + sang de mouton à 5 % + glycérol à 10 % BCC + glycérol à 10 % GSC + Polyvitex ( en pente )
– Pour Streptococcus pneumoniae :
BCC + glycérol à 10 %
Bouillon MH + sang de mouton à 5 % + glycérol à 10 % GSC + gentamicine (en pente)
La conservation se fera selon deux méthodes qui se distinguent par la durée et par la température de conservation :
9 Méthode de courte durée où les bactéries sont conservées à une température de – 20°C pendant un mois.
9 Méthode de longue durée où les bactéries sont conservées à – 70°C pendant deux à trois mois.
Méthode de courte durée :
Apres l’isolement et l’identification, les souches bactériennes sont repiquées sur une gélose appropriée afin d’ obtenir des colonies jeunes :
– GSC + Polyvitex pour Haemophilus influenzae
– GSC + gentamicine à 6mg / l pour Streptoccus pneumoniae L’incubation se fait à 37°C pendant 24 heures sous 5 % de CO2.
A partir des colonies jeunes obtenues, les milieux de conservation ( BCC et bouillon MH, et GSC en pente) sont ensemencés puis incubés à 37°C sous 5 % de CO2 pendant 24 heures .
Après l’incubation les milieux sont placés sur un portoir et immédiatement conservés à –20°C pendant un mois.
Afin de suivre la viabilité des souches conservées, on sortira chaque jour une gélose en pente et un bouillon puis on repiquera sur une gélose appropriée suivant l’espèce conservée.
NB : Les tubes qui seront décongelés pour une étude de la viabilité ne seront pas remis dans le portoir de conservation .
Cette méthode a l’avantage d’être facile, efficace et économique, cependant les pertes sont loin d’être rares.
Méthode de longue durée
Les milieux utilisés et la technique de conservation sont les mêmes que pour la méthode de courte durée à la seule différence qu’ici les bactéries sont conservées à -70 °C pendant 2 à 3 mois et que la conservation sur gélose en pente n’est pas utilisée.
Les colonies jeunes obtenues après repiquage sur gélose appropriée seront ensemencées dans des tubes nunc contenant 1ml de bouillon de conservation à raison de deux colonies par tube. Les tubes seront ensuite placés sur un portoir et incubés à 37°C sous 5 % de CO2 pendant 24 heures au terme desquelles ils seront placés immédiatement à -20 °C pendant 24 à 48 puis à -70°C pendant trois mois.
Comme pour la méthode de courte durée, on sortira chaque jour un tube de conservation puis on repiquera sur une gélose appropriée afin d’apprécier la viabilité des souches conservées.
Cette méthode réduit de façon considérable les pertes enregistrées avec la méthode de courte durée. Cependant elle est onéreuse.
TRAVAIL PERSONNEL
MATERIEL ET REACTIFS :
CADRE D’ETUDE :
Ce travail a pour cadre d’étude l’unité de recherche et de biotechnologie microbienne du laboratoire de Bactériologie – Virologie de l’hôpital Aristide le Dantec.
LES SOUCHES BACTERIENNES :
Notre étude a porté sur des souches de Streptococcus pneumoniae et d’Haemophilus influenzae. Ces souches sont d’une part des souches isolées à partir de prélèvements provenant de la pédiatrie de l’hôpital Aristide Le Dantec de Dakar et d’autre part des souches de références qui existaient au laboratoire.
Les souches de références utilisées sont de type American Type Culture Collection ( ATCC ). Il s’agit de :
– Haemophilus influenzae ATCC 49766
– Haemophilus influenzae ATCC 10211
– Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
MATERIEL ET REACTIFS POUR L’ISOLEMENT ET L’IDENTIFICATION :
– Anse de platine
– Autoclave
– Bec bunsen Boites de Pétri
– Boites de Pétri
– Bougie ou générateur de CO2
– Désoxycholate de sodium 10%
– Disques d’optochine
– Disques d’oxydase
– Ecouvillon stérile
– Etuve à 37°C
– Gélose trypticase – soja
– Gentamicine
– Isovitalex
– Jarre d’incubation
– Lames porte – objet
– Microplaques pour l’identification / Micro CSB
– Microscope optique
– Peroxyde d’hydrogène à 3 %
– Pipettes pasteur
– Sang de cheval.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I / RAPPELS SUR LA CROISSANCE BACTERIENNE
I-1 / DEFINITION
I-2 / NUTRITION BACTERIENNE
I-2-1/ Les besoins alimentaires
I-2-2/ Les besoins énergétiques
I-2-3/ Les besoins spécifiques
I-3/ LES CONDITIONS PHYSICO-CHIMIQUES DE LA CROISSANCE
I-3-1/ La température
I-3-2/ Le pH
I-3-3/ La pression partielle en oxygène
I-3-4/ Les substances antibactériennes
II/ ETUDE DE LA CROISSANCE BACTERIENNE
II-1 / MESURE DE LA CROISSANCE
II-2 / CINETIQUE DE LA CROISSANCE
III / RAPPELS SUR LES SOUCHES BACTERIENNES
III-1 / HAEMOPHILUS INFLUENZAE
III-1-1/ Historique
III-1-2/ Caractères morphologiques
III-1-3/ Caractères culturaux
III-1-4/ Caractères biochimiques
III-1-5 / Caractères antigéniques
III-1-6/ Identification
III-2 / STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
III-2-1/ Historique
III-2-2/ Caractères morphologiques
III-2-3/ Caractères culturaux
III-2-4/ Caractères biochimiques
III-2-5/ Identification
IV / CONSERVATION DES SOUCHES BACTERIENNES
IV-1/ Méthode de courte durée
IV-2/ Méthode de longue durée
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
I / MATERIEL ET REACTIFS
I-1 / Cadre d’étude
I-2 / Souches bactériennes
I-3 / Matériel et réactifs pour l’isolement et l’identification
I-4 / Matériel et réactifs pour la conservation
I-5 / Matériel pour la mesure de la croissance
II / METHODOLOGIE
II-1 / Milieux de culture pour l’isolement et l’identification
II-2 / Milieux de culture pour la conservation
II-3 / Isolement et identification des souches bactériennes
II-3-1 / Streptococcus pneumoniae
II-3-2 / Haemophilus influenzae
II-4 / Conservation des souches bactériennes
II-4-1 / Méthode de courte durée
II-4-2 /Méthode de longue durée
III / RESULTATS
III-1 / Isolement et identification avant la conservation
III-2 / Etude de la viabilité des souches conservées
III-3 / Identification des souches après conservation
IV / DISCUSSION
V / CONCLUSION
VI / REFERENCES BIBLIOGRAFIQUES
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