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La pression partielle en oxygรจne
Les bactรฉries peuvent รชtre classรฉes en plusieurs groupes suivant leur rapport avec lโoxygรจne :
– les bactรฉries aรฉrobies strictes : elles ne se dรฉveloppent quโen prรฉsence dโoxygรจne.
– Les bactรฉries microaรฉrophiles : elles se dรฉveloppent mieux ou exclusivement lorsque la pression partielle en oxygรจne est infรฉrieure ร celle de lโair.
– Les bactรฉries aรฉro-anaรฉrobies facultatives : qui se dรฉveloppent avec ou sans oxygรจne.
La majoritรฉ des bactรฉries dโintรฉrรชt mรฉdical se retrouve dans le groupe des bactรฉries aรฉro-anaรฉrobies facultatives.
– Les bactรฉries anaรฉrobies strictes : elles se dรฉveloppent quโen absence totale dโoxygรจne qui est toxique pour elles. Cette toxicitรฉ sโexplique par la production de radicaux superoxyde que les bactรฉries anaรฉrobies ne peuvent dรฉtruire du fait de lโabsence de superoxyde dismutase et ou de lโabsence dโune activitรฉ enzymatique ร type de catalase et de peroxydase.
Les substances antibactรฉriennes
Certaines substances antibactรฉriennes peuvent inhiber la croissance bactรฉrienne : cโest le principe des milieux sรฉlectifs. Exemple : GSC + gentamicine ร 6mg/l
Cโest un milieu sรฉlectif pour Streptococcus pneumoniae
ETUDE DE LA CROISSANCE BACTERIENNE
MESURE DE LA CROISSANCE BACTERIENNE (4)
La mesure de la croissance bactรฉrienne permet de connaรฎtre la concentration cellulaire (nombre dโindividus par unitรฉ de volume) et lโรฉtat physiologique de cette population (croissance rapide, รฉtat stationnaire)โฆ
Cette mesure de la croissance peut se faire en milieu solide comme en milieu liquide.
La mesure de la croissance bactรฉrienne fait intervenir deux groupes de mรฉthodes.
Les mรฉthodes indirectes :
– La numรฉration totale en dรฉnombrant au microscope ou avec des compteurs spรฉciaux les individus viables ou non.
– La numรฉration viable en dรฉnombrant les colonies auxquelles ont donnรฉ naissance les bactรฉries viables en partant du principe quโune bactรฉrie donne naissance ร une colonie.
NB : Quelle que soit son activitรฉ mรฉtabolique ou gรฉnรฉtique, une bactรฉrie est dite non viable si elle est incapable de former une colonie.
Les mรฉthodes directes
– La dรฉtermination du poids sec
Les bactรฉries sont lavรฉes, sรฉchรฉes, et pesรฉes. On supposera quโun milligramme de poids sec correspond ร quelques milliards de corps bactรฉriens.
– Le dosage de lโazote bactรฉrien
– Mesure de lโactivitรฉ enzymatique des bactรฉries (mรฉthode est peu prรฉcise) ;
– Mesures optiques par turbidimรฉtrie
La culture bactรฉrienne peut absorber ou rรฉflรฉchir la lumiรจre qui passe ร travers elle. Dans certaines limites, la lumiรจre absorbรฉe ou rรฉflรฉchie par la suspension bactรฉrienne peut รชtre directement proportionnelle ร la concentration de cellules de la culture pour une longueur dโonde donnรฉe. Pour de telles dรฉterminations, on utilise un spectrophotomรจtre qui permet de mesurer la turbidimรฉtrie, on exprime ses valeurs sous forme dโabsorbance (A).
Cette mรฉthode est rapide et prรฉcise, cependant elle nโest applicable quโร partir de 107 bactรฉries par ml de culture.
La longueur dโonde choisie est celle correspondante au minimum dโabsorption pour le milieu de culture.
CINETIQUE DE LA CROISSANCE BACTERIENNE :
Pour une population bactรฉrienne homogรจne se dรฉveloppant en milieu liquide dans des conditions de culture stables, le nombre de cellules double ร chaque gรฉnรฉration.
Quand on ensemence un milieu nutritif neutre composรฉ de quantitรฉs limitรฉes dโaliments nรฉcessaires ร la croissance microbienne, on constate que plusieurs phases de croissance se succรจdent, caractรฉrisรฉes par des variations de la constante de croissance .Il y a successivement :
– une phase de latence : le taux de croissance est nul. elle correspond au temps nรฉcessaire ร la bactรฉrie pour synthรฉtiser les enzymes adaptรฉes au substrat ;
– une phase de croissance exponentielle : le taux de croissance augmente pour atteindre un maximum, les enzymes sont synthรฉtisรฉes et le mรฉtabolisme se dรฉroule normalement ;
– une phase de ralentissement : la vitesse de croissance rรฉgresse du fait de lโappauvrissement du milieu de culture et dโune accumulation des dรฉchets ;
– une phase stationnaire : le taux de croissance devient nul, les bactรฉries qui se multiplient compensent celles qui meurent ;
– une phase de dรฉclin : le taux de croissance devient nรฉgatif, toutes les ressources nutritives du milieu sont รฉpuisรฉes et il y a accumulation de mรฉtabolites toxiques ; cependant, il peut persister une croissance par libรฉration des substances lors de la lyse : on parle de croissance cryptique.
RAPPEL SUR LES SOUCHES BACTERIENNES
HAEMOPHILUS INFLUENZAE
Historique (1)
Il a รฉtรฉ observรฉ dans lโexsudat de conjonctivites purulentes par KOCH en 1883 en Egypte puis en 1886 aux USA par WEEKS et signalรฉ dans un traitรฉ de 1889 sous le nom de Bacillus aegyptius. Au cours de la pandรฉmie de grippe de 1889 ร 1892, Pfeiffer a observรฉ et cultivรฉ ร partir de crachats de grippรฉs, un petit bacille, Bacillus influenzae et en a fait lโagent รฉtiologique de la grippe ou influenza. Il a montrรฉ le rรดle indispensable du sang dans la culture de cette bactรฉrie et a inventรฉ la gรฉlose au sang.
Le nom du genre Haemophilus a รฉtรฉ proposรฉ en 1917.
En 1930 Miss M. Pittman met en รฉvidence lโexistence de souches capsulรฉes, propose des types sรฉrologiques et montre la prรฉdominance du type b dans les mรฉningites et autres infections aiguรซs suppurรฉes.
Caractรจres morphologiques (3)
Haemophilus influenzae se prรฉsente sous forme de petits bacilles ou coccobacilles de 0,3ฮผ ร 0,4 ฮผ de diamรจtre sur 1 ร 1,5ฮผ, non sporulรฉs, immobiles, gรฉnรฉralement capsulรฉs et gram nรฉgatif avec parfois une coloration bipolaire. Dans certains produits pathologiques (crachat, LCR) ou en culture le polymorphisme sโaccentue.
La capsule tend ร disparaรฎtre au cours des repiquages.
Caractรจres culturaux (36)
Haemophilus influenzae ne peut pousser que sur des milieux de culture enrichis en sang , lesquels apportent les deux facteurs que sont lโhรฉmine ( ou facteur X ) et le facteur V ( NAD ou nicotinamide adรฉnine dinuclรฉotide ). Cette double exigence permet de le distinguer des autres espรจces et notamment Haemophilus parainfluenzae qui nรฉcessite que du NAD. Cependant, comme le sang frais contient รฉgalement des inhibiteurs du facteur V, il est nรฉcessaire dโutiliser des milieux dโisolement au sang cuit (75 – 80 ยฐC pendant 15 minutes).
A lโinverse, un chauffage excessif dรฉtruit le NAD, il est donc important de sโassurer de la qualitรฉ des milieux de cultures pour Haemophilus.
En anaรฉrobiose, la croissance dโHaemophilus influenzae nโest pas dรฉpendante de lโhรฉmine, ce qui peut รชtre source de difficultรฉs dโidentification. Lโexigence en NAD peut รชtre recherchรฉe sur des milieux additionnรฉs de NAD purifiรฉ, ou par la mise en รฉvidence dโun satellitisme dโHaemophilus influenzae autour des colonies de Staphylococcus aureus (qui produisent du NAD). Aprรจs 24 heures de culture ร 37ยฐC sur gรฉlose โ chocolat, Haemophilus influenzae donne des colonies lisses, convexes grisรขtres, translucides, de 0,5 ร 1 mm. Les souches encapsulรฉes donnent des colonies mucoรฏdes de plus grosse taille. Certaines espรจces nรฉcessitent pour leur croissance une atmosphรจre enrichie en CO2.
Caractรจres biochimiques
Huit biotypes (I ร VIII) ont รฉtรฉ dรฉfinis pour lโespรจce Haemophilus influenzae ร partir des caractรจres mรฉtaboliques suivant : production dโindole, activitรฉs enzymatiques urรฉase et ornithine dรฉcarboxylase (23). Le biotype I est plus frรฉquemment retrouvรฉ dans les mรฉningites et le biotype IV dans les infections gรฉnitales (23 ).
Haemophilus influenzae possรจde une catalase et une peroxydase.
Un certains nombre de caractรจres biochimiques et enzymatiques permettent dans certains cas de le diffรฉrencier des voisines. Ces caractรจres sont rassemblรฉs dans le tableau I (3 , 4 ).
Caractรจres antigรฉniques :
La capsule :
Six variรฉtรฉs antigรฉniques (a, b, c, d, e, f ) ont รฉtรฉ dรฉcrites par PITTMAN en fonction de la structure antigรฉnique du germe (27). La spรฉcificitรฉ de type dรฉpend de la composition en polysaccharides de la capsule. Diffรฉrents sucres ont รฉtรฉ individualisรฉs : glucose, ribose, galactose, acide mannuronique Seul le polysaccharide de type b, constituรฉ de polyribosyl ribitol phosphate ou PRP a une structure composรฉe de deux riboses. Lโassociation frรฉquente entre sรฉrotype b et biotype I semble รชtre une consรฉquence de la diversitรฉ gรฉnรฉtique limitรฉe des Haemophilus influenzae de type b (23). La majoritรฉ des pathologies invasives chez lโenfant ( mรฉningites, septicรฉmies, arthrites) est due aux souches capsulรฉes de type b en raison du rรดle majeur du PRP comme facteur de virulence.
La membrane externe
Comme tous les bacilles gram nรฉgatif, Haemophilus influenzae possรจde une membrane externe constituรฉe de protรฉines, de porines, de phospholipides et de lipo- oligosaccharides ( LOS ). Les LOS sont constituรฉs de lipide A, de 2 ceto 3 desoxyoctonate et dโoligosaccharides (23). Les profils electrophorรฉtiques des LOS permettent de dรฉfinir des sous-types utilisables dans les รฉtudes รฉpidรฉmiologiques. Lโ activitรฉ endotoxinique est liรฉe ร la proportion lipidique A. Cโest la lyse des LOS avec libรฉration de lipide A qui est responsable de choc septique ร Haemophilus influenzae ( 27 ). Les protรฉines de membrane externe (PEM), trรจs immunogรจnes, reprรฉsentent des facteurs de virulence chez les souches de Haemophilus influenzae en particulier celles non capsulรฉes ( 29 ). Pili ou fimbriae :
La prรฉsence de pili ou fimbriae, mise en รฉvidence chez Haemophilus influenzae, confรจre ร la bactรฉrie des propriรฉtรฉs dโadhรฉsion ร la muqueuse nasopharyngรฉe, รฉtape prรฉcรฉdant lโinvasion sanguine et mรฉningรฉe.
Chez Haemophilus influenzae de type b, la piliation permet de dรฉfinir 5 sรฉrotypes.
Pour Haemophilus influenzae de type b, les souches isolรฉes du LCR et du sang sont le plus souvent non piliรฉes contrairement ร celles isolรฉes du rhinopharynx (24).
Identification dโHaemophilus influenzae (1, 3)
Lโidentification formelle de haemophilus influenzae porte dโabord sur la mise en รฉvidence de lโexigence en facteurs de croissance. Diffรฉrentes mรฉthodes permettent dโรฉtudier cette exigence :
– le phรฉnomรจne de satellisme sur gรฉlose au sang avec un strie de Staphylococcus aureus qui rรฉalise un apport en facteur V ;
– lโutilisation de milieux complรฉmentรฉs avec lโun et ou lโautre facteur ;
– lโutilisation de disques contenant lโun et ou lโautre facteur et qui sont
dรฉposรฉs ร la surface dโun milieu gรฉlosรฉ.
Lโidentification est ensuite complรฉtรฉe par la macroscopie, la microscopie et lโรฉtude des caractรจres biochimiques prรฉsentรฉs dans le tableau I.
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
Historique(13) :
Il est dรฉcouvert pour la premiรจre fois par Louis Pasteur en 1880.
En 1923, GRIFFITH observa que le pneumocoque virulent possรฉdait une capsule donnant aux colonies un aspect lisse (S). Avec HEIDELBERGER, AVERY montra que la capsule รฉtait un polysaccharide et non une protรฉine ou un complexe de molรฉcules diverses .
En 1944, AVERY, Mac Leod et Mac Carthy รฉtablissent les bases de la gรฉnรฉtique bactรฉrienne en montrant que lโADN est le facteur transformant chez les pneumocoques.
Caractรจres morphologiques(3)
Le pneumocoque se prรฉsente sous forme de cocci gram positif sphรฉriques ou ovoรฏdes disposรฉs en paire pour former des diplocoques donnant lโaspect de flamme de bougie ou de 8. Cependant, il faut noter que cet aspect nโest pas toujours รฉvocateur. En effet, si lโenvironnement est carencรฉ en magnรฉsium, on peut observer des chaรฎnettes relativement longues.
Caractรจres culturaux(5,9)
La culture du pneumocoque peut se faire dans un intervalle de tempรฉrature allant de 25 ร 42หC, mais en routine le germe se cultive ร 37หC. La culture se fait ร un pH de 7,5 sur des milieux nutritifs riches comme la gรฉlose au sang de cheval ou de mouton (5 ร 10 %) sous une atmosphรจre de 5 ร 10 % de CO2. Lโaddition dโantibiotique comme la gentamicine ou lโacide nalidixique rendrait le milieu plus sรฉlectif.
CONSERVATION DES SOUCHES BACTERIENES(15)
Les souches bactรฉriennes exigeantes comme leur nom lโindique, sont difficiles ร conserver et nรฉcessitent des milieux de conservation particuliers qui tiennent compte de leurs exigences.
Les milieux de conservation varient suivant lโespรจce ร conserver.
Exemple :
– Pour Haemophilus influenzae on conserve sur : Bouillon MH + sang de mouton ร 5 % + glycรฉrol ร 10 % BCC + glycรฉrol ร 10 % GSC + Polyvitex ( en pente )
– Pour Streptococcus pneumoniae :
BCC + glycรฉrol ร 10 %
Bouillon MH + sang de mouton ร 5 % + glycรฉrol ร 10 % GSC + gentamicine (en pente)
La conservation se fera selon deux mรฉthodes qui se distinguent par la durรฉe et par la tempรฉrature de conservation :
9 Mรฉthode de courte durรฉe oรน les bactรฉries sont conservรฉes ร une tempรฉrature de โ 20ยฐC pendant un mois.
9 Mรฉthode de longue durรฉe oรน les bactรฉries sont conservรฉes ร โ 70ยฐC pendant deux ร trois mois.
Mรฉthode de courte durรฉe :
Apres lโisolement et lโidentification, les souches bactรฉriennes sont repiquรฉes sur une gรฉlose appropriรฉe afin dโ obtenir des colonies jeunes :
– GSC + Polyvitex pour Haemophilus influenzae
– GSC + gentamicine ร 6mg / l pour Streptoccus pneumoniae Lโincubation se fait ร 37ยฐC pendant 24 heures sous 5 % de CO2.
A partir des colonies jeunes obtenues, les milieux de conservation ( BCC et bouillon MH, et GSC en pente) sont ensemencรฉs puis incubรฉs ร 37ยฐC sous 5 % de CO2 pendant 24 heures .
Aprรจs lโincubation les milieux sont placรฉs sur un portoir et immรฉdiatement conservรฉs ร โ20ยฐC pendant un mois.
Afin de suivre la viabilitรฉ des souches conservรฉes, on sortira chaque jour une gรฉlose en pente et un bouillon puis on repiquera sur une gรฉlose appropriรฉe suivant lโespรจce conservรฉe.
NB : Les tubes qui seront dรฉcongelรฉs pour une รฉtude de la viabilitรฉ ne seront pas remis dans le portoir de conservation .
Cette mรฉthode a lโavantage dโรชtre facile, efficace et รฉconomique, cependant les pertes sont loin dโรชtre rares.
Mรฉthode de longue durรฉe
Les milieux utilisรฉs et la technique de conservation sont les mรชmes que pour la mรฉthode de courte durรฉe ร la seule diffรฉrence quโici les bactรฉries sont conservรฉes ร -70 ยฐC pendant 2 ร 3 mois et que la conservation sur gรฉlose en pente nโest pas utilisรฉe.
Les colonies jeunes obtenues aprรจs repiquage sur gรฉlose appropriรฉe seront ensemencรฉes dans des tubes nunc contenant 1ml de bouillon de conservation ร raison de deux colonies par tube. Les tubes seront ensuite placรฉs sur un portoir et incubรฉs ร 37ยฐC sous 5 % de CO2 pendant 24 heures au terme desquelles ils seront placรฉs immรฉdiatement ร -20 ยฐC pendant 24 ร 48 puis ร -70ยฐC pendant trois mois.
Comme pour la mรฉthode de courte durรฉe, on sortira chaque jour un tube de conservation puis on repiquera sur une gรฉlose appropriรฉe afin dโapprรฉcier la viabilitรฉ des souches conservรฉes.
Cette mรฉthode rรฉduit de faรงon considรฉrable les pertes enregistrรฉes avec la mรฉthode de courte durรฉe. Cependant elle est onรฉreuse.
TRAVAIL PERSONNEL
MATERIEL ET REACTIFS :
CADRE DโETUDE :
Ce travail a pour cadre dโรฉtude lโunitรฉ de recherche et de biotechnologie microbienne du laboratoire de Bactรฉriologie โ Virologie de lโhรดpital Aristide le Dantec.
LES SOUCHES BACTERIENNES :
Notre รฉtude a portรฉ sur des souches de Streptococcus pneumoniae et dโHaemophilus influenzae. Ces souches sont dโune part des souches isolรฉes ร partir de prรฉlรจvements provenant de la pรฉdiatrie de lโhรดpital Aristide Le Dantec de Dakar et dโautre part des souches de rรฉfรฉrences qui existaient au laboratoire.
Les souches de rรฉfรฉrences utilisรฉes sont de type American Type Culture Collection ( ATCC ). Il sโagit de :
– Haemophilus influenzae ATCC 49766
– Haemophilus influenzae ATCC 10211
– Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
MATERIEL ET REACTIFS POUR LโISOLEMENT ET LโIDENTIFICATION :
– Anse de platine
– Autoclave
– Bec bunsen Boites de Pรฉtri
– Boites de Pรฉtri
– Bougie ou gรฉnรฉrateur de CO2
– Dรฉsoxycholate de sodium 10%
– Disques dโoptochine
– Disques dโoxydase
– Ecouvillon stรฉrile
– Etuve ร 37ยฐC
– Gรฉlose trypticase โ soja
– Gentamicine
– Isovitalex
– Jarre dโincubation
– Lames porte โ objet
– Microplaques pour lโidentification / Micro CSB
– Microscope optique
– Peroxyde dโhydrogรจne ร 3 %
– Pipettes pasteur
– Sang de cheval.
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Table des matiรจres
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I / RAPPELS SUR LA CROISSANCE BACTERIENNE
I-1 / DEFINITION
I-2 / NUTRITION BACTERIENNE
I-2-1/ Les besoins alimentaires
I-2-2/ Les besoins รฉnergรฉtiques
I-2-3/ Les besoins spรฉcifiques
I-3/ LES CONDITIONS PHYSICO-CHIMIQUES DE LA CROISSANCE
I-3-1/ La tempรฉrature
I-3-2/ Le pH
I-3-3/ La pression partielle en oxygรจne
I-3-4/ Les substances antibactรฉriennes
II/ ETUDE DE LA CROISSANCE BACTERIENNE
II-1 / MESURE DE LA CROISSANCE
II-2 / CINETIQUE DE LA CROISSANCE
III / RAPPELS SUR LES SOUCHES BACTERIENNES
III-1 / HAEMOPHILUS INFLUENZAE
III-1-1/ Historique
III-1-2/ Caractรจres morphologiques
III-1-3/ Caractรจres culturaux
III-1-4/ Caractรจres biochimiques
III-1-5 / Caractรจres antigรฉniques
III-1-6/ Identification
III-2 / STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
III-2-1/ Historique
III-2-2/ Caractรจres morphologiques
III-2-3/ Caractรจres culturaux
III-2-4/ Caractรจres biochimiques
III-2-5/ Identification
IV / CONSERVATION DES SOUCHES BACTERIENNES
IV-1/ Mรฉthode de courte durรฉe
IV-2/ Mรฉthode de longue durรฉe
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
I / MATERIEL ET REACTIFS
I-1 / Cadre dโรฉtude
I-2 / Souches bactรฉriennes
I-3 / Matรฉriel et rรฉactifs pour lโisolement et lโidentification
I-4 / Matรฉriel et rรฉactifs pour la conservation
I-5 / Matรฉriel pour la mesure de la croissance
II / METHODOLOGIE
II-1 / Milieux de culture pour lโisolement et lโidentification
II-2 / Milieux de culture pour la conservation
II-3 / Isolement et identification des souches bactรฉriennes
II-3-1 / Streptococcus pneumoniae
II-3-2 / Haemophilus influenzae
II-4 / Conservation des souches bactรฉriennes
II-4-1 / Mรฉthode de courte durรฉe
II-4-2 /Mรฉthode de longue durรฉe
III / RESULTATS
III-1 / Isolement et identification avant la conservation
III-2 / Etude de la viabilitรฉ des souches conservรฉes
III-3 / Identification des souches aprรจs conservation
IV / DISCUSSION
V / CONCLUSION
VI / REFERENCES BIBLIOGRAFIQUES
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