Les composés phénoliques

Les composés phénoliques

Chapitre II. Matériel et méthodes

Les substances naturelles issues des végétaux ont des intérêts multiples mis à profit dans les industries : alimentaire, cosmétique et médicale. Notre choix de la plante punica granatuim à été basé sur des études ethnobotanique réalisé par des différents chercheurs, et qui ont révélé une large utilisation de cette plante par les peuples dans le traitement des maladies.

Matériel

La plante étudiée

Notre travail porte sur l’étude de la composition chimique et sur l’activité antioxydante de l’écorce de fruit de grenadier.
L’écorce du fruit de grenade présentée sur la figure 8 est séchée à l’ombre dans un endroit bien aéré, à une température ambiante et à l’abri de la lumière, pour préserver le maximum de molécules, puis broyées. La poudre obtenue est conservée à l’abri de la lumière.

Préparation des réactifs

 Réactif de mayer:
Dans 60ml de l’eau distillée solubiliser 1.358g d’HgCl2, puis dans 10ml dissoudre 5g de KI, mélanger les deux solutions et ajuster le volume total à 100ml.
 Réactif de wagner:
Dans 75ml de l’eau distillée, solubiliser 2g de KI et 1.27g d’I2, puis ajouter 25ml de l’eau distillée.

Préparation des extraits

Extrait hydro éthanoïque

La préparation de l’extrait hydroalcolique consiste à placer 20g de la poudre dans la cartouche cellulosique du montage soxhlet qui est surmonté d’un réfrigérant et 170ml de n-hexane dans le ballon relatif au montage. Le tout est porté à ébullition pendant 4h à une température de l’ordre de 65°C. Puis l’extrait lipidique est récupéré par élimination du solvant contenu dans le ballon de distillation à l’aide d’un évaporateur rotatif sous vide selon le principe (Feknous et al., 2014), (Virot et al., 2008). Ensuite, une deuxième extraction hydroalcoolique de la marque restante dans la cartouche est effectuée avec un mélange d’éthanol/d’eau distillé (80v/20v) pendant 4h. L’élimination de l’éthanol et de l’eau se fait aussi à l’aide du rotavapor.
Figure 9: Montage d’extraction: Sohxlet et Rotavapeur.

Infusion

Une masse «m» de la poudre est mise dans un volume V d’eau distillée bouillante est laissée infuser pendant 30min puis filtrée à l’aide d’un papier filtre.

Extraction des flavonoïdes

L’extraction des flavonoïdes a été faite selon la méthode modifiée de Lee et al. (1995). La poudre a été extraite par soxhlet en utilisant un mélange eau distillée/ éthanol absolu (100ml, 100ml) pendant quatre heures. L’extrait a été filtré à travers le papier filtre. La phase aqueuse a été ensuite extraite par 200ml de n-butanol, puis acidifiée par HCl à10% au pH 3. La phase butanolique a été évaporée à sec sous pression réduite par le rotavapor à 40°C et à vitesse 4. Le résidu sec a été extrait trois fois par 200ml du mélange eau distillée/acétate d’éthyle (100ml, 100ml) pendant une heure. La phase organique a été basifiée par NaHCO3 au pH 9. Après 15 minutes de repos la phase organique (=flavonoïdes) a été évaporée à sec à 40°C, pesée et reprise par de l’éthanol à 1% pour les tests.

Screening phytochimique

Il s’agit d’une étude analytique qualitative qui a pour but de rechercher les principaux groupes chimiques contenus dans les deux extraits de la plante étudiée avec des concentrations 5mg/l pour l’infusion et de 4g/100ml pour l’extrait hydroalcoolique.

Révélation des polyphénols

A 2ml de l’extrait, est ajoutée une goutte de solution alcoolique de chlorure ferrique à 2%. L’apparition d’une coloration bleu-noirâtre ou verte plus ou moins foncée est signe de la présence des polyphénols (N’Guessan et al., 2009).

Révélation des flavonoïdes

5ml de l’extrait est placé dans un tube à essai sur laquelle est ajouté quelques gouttes d’acide chlorhydrique concentré, puis, 2 à 3 copeaux de magnésium. Le dégagement de chaleur puis d’une coloration rose orangé ou violacée indique la présence des flavonoïdes.

Révélation des saponines

Dans un tube à essai contenant 5ml de l’extrait a été ajouté 10ml d’eau distillée puis agité pendant 20s et laissé au repos durant 15min. l’apparition d’une mousse de hauteur supérieure à 1cm et persistante, indique la présence des saponosides (Harborne, 1998).

Révélation des stérols et des polyterpènes

Dans un tube à essai contenant 5ml de l’extrait a été ajouté 1ml d’Anhydride Acétique, 0,5ml de Chloroforme et 0,5ml d’acide sulfurique concentré sans agitation. L’apparition, à l’interphase, d’un anneau pourpre ou violet, virant au bleu puis au vert, indique la présence de stérols et de polyterpènes (Ghedadba et al., 2015).

Révélation des alcaloïdes

Les alcaloïdes sont caractérisés par l’utilisation des réactifs de Mayer et de Wagner. Le principe consiste à préparer d’abord un extrait chloridrique à partir de 15mg d’extrait et de 5ml de HCl à 1% qui est chauffé pendant 5min dans un bain mari puis filtré sur papier filtre. Ensuite, le filtrat est mis dans deux tubes à essai sur lesquelles sont ajoutées quelques gouttes du réactif de Mayer dans le premier tube et quelques gouttes du réactif de Wagner dans le deuxième tube. L’apparition de précipité blanc jaunâtre (Mayer) et un précipite brun-rouge (Wagner) indique la présence d´alcaloïdes (Iqbal et al., 2015).

Dosages des polyphénols totaux

La teneur en polyphénols totaux a été déterminée par le réactif de Folin-Ciocalteu selon la méthode de Singleton et Rossi (1965) avec quelques modifications: 100µl de l’extrait est mélangé avec 500µl de réactif Folin-Ciocalteu (dilué 10 fois dans l’eau distillé) et laissé au repos à température ambiante durant 5 minutes. Ensuite 750µl de la solution de Na2CO3 (60 g/l) a été ajouté. L’absorbance a été mesurée à 760nm après 90min d’incubation à l’abri de la lumière. Une courbe d’étalonnage standard d’acide gallique (0 à 0,2 mg/ml) a été préparée et les résultats ont été exprimés en milliéquivalents d’acide gallique par gramme l’extrait (mg/g) (Kong et al., 2012).

Dosages des flavonoïdes

La teneur totale en flavonoïdes a été déterminée à l’aide de la méthode colorimétrique (Chang et al., 2002; Stankovic, 2011) avec quelques modifications utilisant la quercétine comme étalon. Une courbe d’étalonnage de la quercétine a été préparée dans la gamme de 0-200 μg/mL. Brièvement, l’extrait (0,5 ml) et l’étalon (0,5ml) ont été placés dans différents tubes à essai et à chaque 10% de chlorure d’aluminium (0,1ml), 1M d’acétate de potassium (0,1ml), 80% de méthanol (1,5ml) et de l’eau distillée (2,8ml) ont été ajoutés et mélangés. Un blanc a été préparé de la même manière où 0,5ml d’eau distillée a été utilisé à la place de l’échantillon ou de l’étalon, et la quantité de chlorure d’aluminium a également été remplacée par de l’eau distillée. Tous les tubes ont été incubés à température ambiante pour 30min. L’absorbance a été prise à 415nm. La concentration de flavonoïdes a été exprimée en mg d’équivalent quercétine (QE) par gramme d’extrait.

Dosages des flavonols

La teneur totale en flavonols a été analysée selon la méthode de (Pattanayak et al., 2011; Kalita et al., 2013) avec quelques modifications. Dans cette méthode, la quercétine a été utilisée pour établir une courbe d’étalonnage standard de 0 à 100 μg/mL. Dans différents tubes à essai, chaque extrait (1ml) et des solutions étalons (1ml) ont été placés, puis du chlorure d’aluminium à 2% (1ml), de l’acétate de sodium à 5% (3ml) et bien mélangés. Le mélange a ensuite été centrifugé à 3000 tr/min pendant 20 minutes pour obtenir une solution limpide. L’absorbance de l’étalon et de l’échantillon a été prise à 440nm. Les résultats ont été exprimés en mg d’équivalent quercétine (QE) par gramme d’extrait.

Dosages des anthocyanines

Les anthocyanines totaux ont été déterminées par la méthode de variation de pH décrie par Hosseinian et al. (2008) avec quelque modification. 0,5ml d’extrait a été ajouté à 3,5ml de tampon chlorure de potassium (0,025M) pour donné un pH=1,0. Le mélange a été agité et laisse reposer pendant 15 minutes avant la mesure de l’absorbance à 515nm et 700nm par le spectrophotomètre contre de l’eau distillée comme blanc. Pour le pH=4.5, l’extrait à été également mélangés avec un tampon d’acétate de sodium (0,025M) de la même manière qu’avec du tampon chlorure de potassium, puis l’absorbance a été mesurée aux mêmes longueurs d’onde après une période d’incubation de 15 minutes. Les résultats ont été exprimés en mg d’équivalents de cyanidine-3-glucoside/g d’extrait par la relation suivante:
∗ ∗ ∗1000
Anthocyanine totaux =
ɛ∗
Avec : A (absorbance) = ((A515-A700) pH1-(A515-A700) pH4.5).
MW= masse molaire de cyanidine 3-glucoside (449.2 g/mol).
DF= facteur dilution.
Ɛ = coefficient d’extinction (L*cm-1*mol-1)= 26 900 pour cyanidine 3-glucoside.
L = trajet optique (cm).
1000 = facteur de conversion de g à mg.

Activité antioxydante

Une solution de DPPH a été préparée par solubilisation de 4 mg de DPPH dans 100 ml de méthanol. dans des tubes à essai en introduit 750µl de différentes concentrations extraits (0.1 ;0.25 ;0.5 ;1 :2 :5) g/l et de vitamine C (0.01 ;0.1 ;0.25 ;0.5 ;1 ;2) g/l, ensuite 1.5ml de la solution de DPPH à été ajoutée, après incubation de 30min à l’obscurité et à température ambiante, les absorbances sont mesurés à 517nm contre le blanc correspondant. Les pourcentages d’inhibition ont été calculés par la relation suivante:
Pourcentage d’activité antioxydante = [DO contrôle – DO échantillon / DO contrôle] x 100.

Table des matières

Introduction
Chapitre I. Présentation de la plante punica granatuim et le stress oxydatif
1. Le grenadier
1.1. Généralités sur le grenadier
1.2. Classification
1.3. Aspect botanique
1.4. Répartition géographique
1.5. Exigences écologiques
1.6. Utilisation de grenadier
1.7. Composition chimique de la plante
1.8. Propriétés thérapeutiques de punica granatum
2. Les composés phénoliques
2.1. Généralités sur les composés phénoliques
2.2. Classification des composés phénoliques
2.2.1 Les acides phénoliques
2.2.2 Flavonoïdes
2.2.3 Tanins
2.3. Espèces radicalaires et le stress oxydatifs
2.3.1. Généralités
2.3.2. Le type des espèces radicalaires et leur mécanisme de formation
2.3.3. Le pouvoir antioxydant
Chapitre II. Matériel et méthodes
1. Matériel
1.1. La plante étudiée
1.2. Réactifs et matériels
1.3. Préparation des réactifs
2. Préparation des extraits
2.1. Extrait hydro éthanoïque
2.2. Infusion
3. Extraction des flavonoïdes
3. Screening phytochimique
3.1. Révélation des polyphénols
3.2. Révélation des flavonoïdes
3.3. Révélation des saponines
3.4. Révélation des stérols et des polyterpènes
3.5. Révélation des alcaloïdes
4. Dosages des polyphénols totaux
5. Dosages des flavonoïdes
6. Dosages des flavonols
7. Dosages des anthocyanines
8. Activité antioxydant
Chapitre III. Résultats et discussions
1. Rendement des extractions
2. Les tests phytochimiques
3. Dosage des polyphénols totaux
4. Dosage des flavonoïdes
5. Dosage des flavonols
6. Dosage des anthocyanines
7. Pouvoir antioxydant par DPPH
Conclusion
Références

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