Les colonnes non remplies, phases en tube ouvert

Les colonnes non remplies, phases en tube ouvert

Les colonnes capillaires non-remplies se présentent sous la forme d’un capillaire de faible diamètre dont la paroi interne a été recouverte d’une certaine épaisseur de phase stationnaire. Il existe plusieurs méthodes pour obtenir une phase stationnaire attachée aux parois et chacune présente un grand choix de fonctionnalités disponibles. Ces phases ont été développées en ECC pour permettre de remédier aux problèmes rencontrés avec les phases stationnaires particulaires liés à la présence et à la fabrication de frittés.

Description des procédés de préparation et des chimies de phases stationnaires associées 

Il existe différentes procédures permettant d’immobiliser une phase stationnaire sur les parois d’un capillaire.

Phases greffées ou physisorbées
Les phases en tube ouvert peuvent être formées par interactions électrostatiques entre des ligands, ou modificateurs, et la surface chargée du capillaire. Si les interactions sont suffisamment fortes énergétiquement alors il s’agit d’adsorption physique permettant un greffage rémanent, sinon ce sont des phénomènes d’adsorption dynamique qui ont lieu. Dans ce dernier cas, il faut donc que le ligand soit ajouté à la phase mobile. Les modificateurs utilisés peuvent être classés en trois grandes catégories : des surfactants cationiques, des surfactants polymériques, des polymères chargés [26]. Par ailleurs, des ligands tels que des biopolymères, des protéines, des polymères fonctionnalisés, peuvent être mis en œuvre permettant ainsi de réaliser des séparations basées sur des phénomènes d’affinité ou de chiralité.

Phases liées chimiquement
L’obtention de ces phases consiste en premier lieu à activer la surface interne du capillaire par une étape dite de gravure. Puis, la deuxième étape consiste à lier chimiquement un composé comportant un groupement organique par des réactions de silanisation et d’hydrosilylation. Ces phases sont liées aux parois et le processus d’activation permet d’augmenter la surface d’interaction. Ce procédé a été adapté pour l’ECC par Pesek et al. [27]. Le réactif d’activation est le bifluorure d’ammonium qui provoque des effets très différents lorsque le protocole et les conditions de silanisation varient. Les réactions mises en jeu sont les suivantes :

Silanisation : Si-OH + (EtO)3SiH → Si-O-Si-H + EtOH
Hydrosilylation : Si-O-Si-H + HCH=CHR → Si-O-Si-CH2-CH2R
De nombreux greffages de phase stationnaire ont été réalisés en utilisant cette méthode par Pesek et Matyska [27-31] : des groupements octadécyle, octyle, diol, des groupements chiraux ou encore des dérivés du cholestérol. Leurs études ont porté sur la caractérisation de ces phases et de leurs performances avec des peptides ou des protéines comme composés tests [27,31].

Phases à base de polymère inorganique obtenues par le procédé sol-gel 

Dans le but d’augmenter la surface spécifique et donc d’augmenter les interactions solutés – phase stationnaire, des phases stationnaires polymériques inorganiques ont été développées. La réalisation d’un sol-gel sur les parois de capillaires comprend une étape de prétraitement de ces parois (lavage à la soude 0.1 M, par exemple) afin d’augmenter au maximum le nombre de groupements silanol disponibles. L’étape suivante porte sur la formation du sol-gel à partir d’une solution sol optimisée. Cette solution est généralement composée de précurseur(s) (généralement des alkoxysilanes), d’un catalyseur (acide, base, température, lumière…), d’eau et de solvant(s) approprié(s), et d’un agent porogène.

En contrôlant chacun de ces paramètres on obtient un polymère aux propriétés bien définies et qui peuvent être ajustées aux besoins des analystes. La réaction de polymérisation commence par l’hydrolyse catalytique des précurseurs (Si(OR)4) générant les espèces réactives en solution :

Si(OR)4 + 4 H2O → Si(OH)4 + 4 ROH ou Si(OR)4 + H2O → (RO)3SiOH + ROH

Ces espèces contenant une ou des fonctions silanol vont subir une condensation avec d’autres espèces réactives présentes dans la solution de manière à former un réseau polymérique tridimensionnel de sol-gel. Il existe deux types de réaction de condensation :

condensation alcoolique : (RO)4Si + (RO)3SiOH → (RO)3Si –O- Si(OR)3 + ROH
condensation aqueuse : 2 (RO)3SiOH → (RO)3Si –O– Si(OR)3 + H2O

Une partie de ce sol-gel se développant près des parois va ainsi se retrouver liée de façon covalente à la surface interne du capillaire. Après avoir laissé un certain temps de polymérisation (10-20 minutes), le capillaire est rincé sous pression afin d’expulser la partie non liée au capillaire de la solution sol. Ensuite le capillaire est séché puis subit un vieillissement à la soude .

Ce type de colonne permet d’obtenir des rétentions assez importantes grâce à leur surface développée élevée et présentent une très bonne stabilité. Cependant il est nécessaire d’optimiser les proportions des divers constituants du mélange réactionnel afin d’obtenir une phase performante.

Phases à base de polymères organiques 

Une autre technique pour obtenir des colonnes polymériques non-remplies est d’utiliser des monomères organiques [32]. Le procédé d’obtention est similaire à celui décrit dans le paragraphe précédent. La première étape consiste à prétraiter le capillaire à la soude puis à l’acide pour accroître le nombre de fonctions silanol susceptibles de réagir. Le prétraitement se termine par une réaction de silanisation. Ensuite le capillaire est rempli de la solution de monomères comprenant : un ou des monomères (méthacrylate ou polystyrène (PS)), un agent réticulant (à base de méthacrylate ou divinylbenzène (DVB)), un initiateur et des solvants porogènes. Une fois la réaction de polymérisation réalisée, suit une fonctionnalisation du polymère poreux par un composé basique (N,N-diméthyldodécylamine) permettant d’ajouter des charges à ce polymère et donc de générer un flux électroosmotique. Ce type de phase a été mis en œuvre pour l’analyse de protéines par ECC et présente une bonne stabilité [32].

Ce type de colonne permet d’obtenir des rétentions plus importantes que dans les autres technologies de colonnes tubulaires grâce à leur plus grande surface développée . Cependant le procédé de fabrication de ces phases est plus complexe que celui des phases adsorbées et demande à être optimisé lorsque l’on change un paramètre comme la nature des monomères ou des solvants par exemple.

 Avantages et inconvénients des colonnes non remplies 

Ces colonnes non-remplies sont de réalisation relativement simple, comparées aux colonnes particulaires, et les systèmes séparatifs développés donnent lieu à de très bonnes efficacités. Une grande diversité de groupements fonctionnels de phases stationnaires et de procédés existent et permettent d’adapter la colonne en fonction des analyses à mettre au point. Dans cette technologie de colonnes, les problèmes de bulles ne se posent plus, ni ceux des frittés.

Néanmoins, les diamètres internes des colonnes non-remplies sont de faibles dimensions (10 à 20 µm) pour permettre un accès suffisant des solutés à la phase stationnaire car les vitesses de diffusion des solutés dans la phase mobile ont de faibles valeurs. De plus, l’utilisation de ces diamètres de capillaires entraîne alors des limitations importantes au niveau de la détectabilité. Ainsi, les phases tubulaires présentent une plus faible surface spécifique comparées aux phases particulaires et donc un rapport surface sur volume assez faible. Par conséquent, les volumes injectables sont fortement réduits ainsi que le trajet optique, soit la sensibilité de la détection.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
1. Les phases particulaires
1. 1 Description des phases stationnaires particulaires
1. 2 Description des procédés de fabrication
1. 2. 1 Remplissage de la colonne
1. 2. 2 Immobilisation des phases stationnaires : fabrication de frittés
1. 3 Avantages et inconvénients des phases stationnaires particulaires
2. Les colonnes non remplies, phases en tube ouvert
2. 1 Description des procédés de préparation et des chimies de phases stationnaires associées
2. 1. 1 Phases greffées ou physisorbées
2. 1. 2 Phases liées chimiquement
2. 1. 3 Phases à base de polymère inorganique obtenues par le procédé sol-gel
2. 1. 4 Phases à base de polymères organiques
2. 2 Avantages et inconvénients des colonnes non remplies
3. Les phases monolithiques
3. 1 Origine et description de ce type de phase stationnaire
3. 1. 1. Définition et origine
3. 1. 2. Caractéristiques des phases monolithiques
3. 2 Description des principaux types de matériaux monolithiques
3. 2. 1 Monolithes inorganiques
3. 2. 1. 1- Colonnes monolithiques à base de particules immobilisées
3. 2. 1. 2-Colonnes monolithiques obtenues in situ par le procédé sol-gel
3. 2. 2 Monolithes organiques réalisés in situ
3. 2. 2. 1-Monolithes obtenues par métathèse et ouverture de cycles
3. 2. 2. 2-Phases stationnaires obtenues par polymérisation radicalaire
3. 3 Phases monolithiques adaptées à l’ECC
3. 3. 1. Les phases utilisant le procédé sol-gel
3. 3. 2. Les phases à base de monomères organiques
3. 4 Comparaison des technologies de colonne en ECC et choix retenu
4. Phases monolithiques organiques photopolymérisées in situ
4. 1 Processus de polymérisation
4. 2 Influence des divers constituants du mélange sur la structure et les propriétés séparatives du monolithe
4. 2. 1 Concentration en initiateur et conditions d’illumination
4. 2. 2 Influence du rapport des solvants porogènes
4. 2. 3 Influence du rapport entre les monomères et les solvants
4. 2. 4 Influence du pourcentage en agent réticulant
4. 2. 5 Influence du pourcentage en monomère chargé
4. 3 Fonctionnalités de surface des monolithes
4. 4 Monolithes développés au laboratoire
5. Les microsystèmes séparatifs
5. 1 Description et intérêts des microsystèmes
5. 2 Les microsystèmes séparatifs électrophorétiques
5. 3 Microsystèmes séparatifs électrochromatographiques
5. 3. 1 Structures microfabriquées
5. 3. 2 Canaux remplis de particules
5. 3. 3 Monolithes polymériques poreux formés in situ dans les microcanaux
6. Principes de l’électrochromatographie capillaire
6. 1 Principe et définition
6. 2 Flux électroosmotique et électromigration
6. 2. 1 Flux électroosmotique en EC
6. 2. 2 Flux électroosmotique en électrochromatographie capillaire
6. 2. 3 L’électromigration
6. 3 Rétention en ECC
6. 4 Efficacité et phénomènes de dispersion
7. Conclusion
8. Références bibliographiques
CONCLUSION GENERALE

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