Les chromosomes dicentriques, causes d’instabilité génétique

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Les chromosomes dicentriques, causes d’instabilité génétique

L’inactivation épigénétique d’un centromère ou son éviction par un réarrangement avant la mitose permet la ségrégation normale des chromosomes fusionnés ou réarrangés (Barra and Fachinetti, 2018; Stimpson et al., 2012). Cependant, cette issue est rare et la présence d’un chromosome dicentrique est une menace pour la cellule lors de la mitose.

Ségrégation et réarrangements induits par les dicentriques

Les centromères sont des séquences d’ADN spécialisées, responsables de la ségrégation fidèle des chromosomes en mitose. Présents en un seul exemplaire sur chaque chromosome, ils permettent la fixation de chaque chromatide soeur à un des pôles opposés du fuseau mitotique. Ainsi, celles-ci sont réparties équitablement dans chacune des cellules filles.
La présence de deux centromères sur un même chromosome conduit, en mitose, à deux configurations équiprobables d’attachement des centromères aux pôles du fuseau mitotique i) les deux centromères d’une même chromatide sont liés au même pôle du fuseau, permettant une ségrégation normale du chromosome et un retour à la situation initiale. ii) Les pôles du fuseau mitotique capturent chacun un centromère d’une même chromatide ce qui mène à la formation de deux ponts d’anaphase (Figure 2) (Hill and Bloom, 1989; McClintock, 1941; Thrower and Bloom, 2001).
Ces ponts sont rompus par la cytodiérèse et forment deux cassures double brin (Lopez et al., 2015).
Un chromosome dicentrique (centromères rouge et bleu) formé en G1 est répliqué normalement puis peut être ségrégé aléatoirement de sorte à former ou pas deux ponts d’anaphase. Les ponts chromatiniens peuvent être ultimement brisés lors de la cytodiérèse ce qui mène à la génération de deux cassures double brin.
La rupture des ponts d’anaphase peut mener à plusieurs résultats i) la réparation des extrémités cassées par recombinaison (HR) en utilisant une séquence homologue comme matrice ii) la mort cellulaire causée par la perte de séquences essentielles et/ou l’absence de Réplication réparation. iii) la stabilisation des extrémités cassées par l’ajout de télomères iv) la ligation des deux fragments par jonction directe des extrémités par NHEJ.
La réparation de ces cassures peut éventuellement être à l’origine de la régénération d’un nouveau dicentrique, qui pourra alors subir des cycles successifs de cassure et réparation, jusqu’à une stabilisation. Ce processus cyclique de cassure-fusion-ponts (BFB) a été décrit pour la première fois par Barbara McClintock (McClintock, 1941, 1942) et peut-être à l’origine de variations rapides du nombre de copies d’un gène (Figure 3).
En mitose, le chromosome dicentrique pourrait également être fragmenté en plusieurs segments sur une de ses portions. La réparation de ces fragments dans un ordre différent de l’ordre initial pourrait mener à une réorganisation du chromosome. Ces fragments pourraient également s’insérer dans d’autres chromosomes et mener à une réorganisation plus globale du génome. Le résultat de cette réorganisation est appelée chromothripsis (Ciullo et al., 2002; Gascoigne and Cheeseman, 2013; Leibowitz et al., 2015; Maciejowski and de Lange, 2017; Maciejowski et al., 2015; Marotta et al., 2013; Pennaneach and Kolodner, 2009; Sabatier et al., 2005; Selvarajah et al., 2006; Stewénius et al., 2005).
Figure 3. Mécanisme de réarrangements du génome par Cassures-Fusions-Ponts
Les extrémités générées par la cassure des deux ponts d’anaphase peuvent fusionner par NHEJ pour former un nouveau chromosome dicentrique, qui sera lui aussi cassé et refusionné à nouveau. La position de cassure sur le dicentrique détermine directement les réarrangements induits. Ceux-ci peuvent être classés en trois catégories i) Perte d’hétérozygotie (jaune) ii) translocation non-réciproque et iii) amplification génique (violet, vert et rouge). Le mécanisme de BFB est donc connu comme celui capable de générer les plus nombreux réarrangements en le nombre de cycles le plus cour, depuis environs 80 ans.

Instabilité génétique et cancers

Du fait que les chromosomes dicentriques sont une source d’instabilité génétique, la création transitoire d’un dicentrique dans une lignée cellulaire est un vecteur de réarrangement du caryotype. Ces réarrangements peuvent potentiellement mener à une dérégulation de l’expression génique et finalement à l’oncogenèse. La formation accidentelle d’un dicentrique pourrait donc suffire à initier un réarrangement complexe et pro-oncogénique du génome (Gascoigne and Cheeseman, 2013; Maciejowski et al., 2015).
La formation de chromosomes dicentriques chez la souris promeut l’apparition de tumeurs, dans lesquelles des traces de BFB sont visibles et peuvent concerner tous les chromosomes (Thomas et al., 2018), montrant un effet pro-oncogénique des réarrangements induits par des dicentriques.
Ainsi, en étant une source de BFB et de chromothripsis, les chromosomes dicentriques peuvent participer à l’initiation de la tumorigenèse, mais aussi à la génération de réarrangements massifs dans un tissu cancéreux. L’hétérogénéité caryotypique des cellules induite par ce mécanisme favorise la résistance aux drogues des tumeurs (Selvarajah et al., 2006).
Le BFB est également une source d’évolution du génome qui favorise, par exemple, l’apparition de résistances aux antifongiques chez les champignons (Croll et al., 2013).
La ségrégation des chromosomes dicentriques est donc un défi pour la cellule mitotique. Les réarrangements induits par la cassure de ces chromosomes en mitose sont responsables de dérégulation de l’expression des gènes et peuvent mener, à la mort cellulaire ou à une évolution et une adaptation au milieu.

Mécanisme de rupture des ponts d’anaphase

Chez les animaux

Le devenir des chromosomes dicentriques et la manière dont ils cassent restent peu étudiés, malgré l’importance qu’ils ont dans les processus de réarrangement de l’ADN favorisant l’oncogenèse. Cependant, des travaux relativement récents ont permis de mettre en lumière ce sujet dans différents systèmes modèles.
L’utilisation d’un dicentrique conditionnel dans les cellules DT40 de poulet a permis de montrer que la contraction de l’anneau d’actomyosine lors de la cytodiérèse est nécessaire à la rupture des chromosomes dicentriques. La tension générée par l’élongation du fuseau mitotique ne suffit donc pas à casser les ponts d’anaphase (Gascoigne and Cheeseman, 2013), en accord avec les études des propriétés biophysiques de l’ADN (Houchmandzadeh et al., 1997; Marko, 2008; Nicklas, 1983). L’apparition de micronoyaux et de chromosomes acentriques, après ruptures de dicentriques, dépend également de la cytodiérèse, dans des cellules humaines (Zhang et al., 2015). Il a ensuite été confirmé, dans des cellules HeLa présentant des fusions de chromosomes provoquées par un allèle dominant négatif de TRF2, que les ponts chromatiniens formés par des dicentriques ne cassaient pas en anaphase. La rupture a lieu plus tard et est facilitée par une digestion par l’exonucléase cytoplasmique TREX1 (Maciejowski et al., 2015).
Cependant, si ce mécanisme explique comment la séparation des masses nucléaires des cellules filles peut être facilitée, l’activité exonucléase de TREX1 suggèrent la formation de cassures simple-brin responsables du début de la réaction de dégradation de l’ADN constituant les ponts (Hou and Cooper, 2018; Maciejowski et al., 2015). La façon dont ces dommages simple-brin sont formés reste inconnue. De plus, le mutant de TRF2 utilisé permet de former spécifiquement des dicentriques par fusions de télomères, cependant on ne peut déterminer quels chromosomes ont fusionnés, ni leur nombre exact dans une cellule (environs 1 par cellule dans (Maciejowski et al., 2015)). Il n’est donc pas possible de faire une étude des positions où cassent les chromosomes dicentriques pour observer une spécificité de région ou de séquence.
Chez le nématode C. elegans, l’irradiation d’oeufs formés d’une seule cellule permet la création aléatoire de dommages et la formation de ponts d’anaphase, dont certains sont des dicentriques. Il a alors été montré que, lors de la cytodiérèse, l’endonucléase double brin LEM-3, est recrutée au niveau du midbody par un mécanisme dépendant de la constriction de l’anneau d’actomyosine et d’Aurora B, la kinase principale en charge de l’orientation et de la croissance du fuseau mitotique. LEM-3, mise au contact de l’ADN par l’anneau d’actomyosine digère les ponts chromatiniens et permet leurs résolutions (Hong et al., 2018a, 2018b).
Les outils permettant de détecter les sites de cassure des dicentriques dans les cellules HeLa et chez C. elegans n’existent pas pour l’instant. La détection des positions de cassure est indirecte et réalisée après un grand nombre de cycles cellulaires. On regarde donc des clones stabilisés après un grand nombre de cycles de BFB. Il n’est donc pas possible de s’intéresser à une spécificité de cassure des dicentriques au niveau de régions préférentielles ou d’être sûr de ne regarder qu’un seul pont formé de deux chromosomes connus.

Le centromère conditionnel et l’étude des dicentriques chez S. cerevisiae

Un outil clef a permis l’étude des chromosomes dicentriques au cours d’un seul cycle cellulaire chez S. cerevisiae, le centromère conditionnel (Hill and Bloom, 1987, 1989).
Chez S. cerevisiae, le centromère consiste en une séquence consensus de 125 pb liant un unique microtubule via le kinétochore et l’histone centromérique (CenH3/Cse4).
Un centromère natif peut être mis sous contrôle de promoteurs forts et inductibles du gène GAL1 (pGAL1). L’activation des promoteurs, par la présence de galactose, provoque une inhibition de la fonction centromérique. Le mécanisme d’inhibition est mal connu mais il passe par un décrochage du kinétochore de son attachement au centromère (Tanaka et al., 2005). Il est pour cela proposé qu’un encombrement stérique, dû au recrutement des différents complexes impliqués dans la transcription, soit responsable de ce détachement.
L’efficacité de ce système dans cet organisme vient sans doute de la force du promoteur pGAL1 dans le recrutement de la machinerie transcriptionelle et du faible attachement du centromère/kinétochore au SPB via un seul microtubule. Dans les autres espèces, le centromère s’étale sur quelques kb ou plus et est lié par plusieurs microtubules ce qui complexifie le détachement et l’inhibition conditionnels (Thomas et al., 2017).
L’inhibition de la fonction d’un centromère, par le galactose, permet de fusionner deux chromosomes et de les propager sous la forme d’un chromosome monocentrique conditionnel.
La levée de l’inhibition du centromère par le glucose réactive rapidement sa fonction et forme un dicentrique dont on pourra observer la cassure dans environs la moitié de la population au cours de la première mitose.
L’utilisation de dicentriques conditionnels a tout d’abord mené à proposer que les chromosomes dicentriques sont cassés, en anaphase par la tension exercée par le fuseau mitotique (Thrower and Bloom, 2001).
Cependant, les chromosomes dicentriques ne sont pas rompus après un blocage en anaphase tardive, provoqué dans un mutant thermosensible (cdc15-2), incapable d’activer la contraction de l’anneau d’actomyosine à température restrictive (Lopez et al., 2015). Ceci montre que même en cas d’élongation maximale du fuseau, l’ADN n’est pas brisé par la tension exercée aux centromères. De plus, la relâche du cycle après un tel blocage permet d’observer la cassure des ponts formés, montrant que l’attachement centromère/kinétochore/microtubule n’a pas été rompu et que les étapes suivant l’anaphase sont celles nécessaires pour casser.
Pour finir, un blocage spécifique de la cytodiérèse permet d’abolir la rupture des dicentriques, ce qui montre que la séparation physique des deux cytoplasmes est nécessaire (Lopez et al., 2015). D’autres études ont également montré que la cytodiérèse casse l’ADN non ségrégé chez S. cerevisiae (Amaral et al., 2016; Baxter and Diffley, 2008; Cuylen et al., 2013; Pampalona et al., 2016; Quevedo et al., 2012).
La cassure des dicentriques se fait préférentiellement au niveau de points chauds pericentromériques s’étalant sur 30 kb. Cette distance est indépendante de la longueur de l’espace intercentromérique, jusqu’à une confusion des deux points chauds de cassure (Lopez et al., 2015; Song et al., 2013). De plus, les chromosomes dicentriques formés par des fusions de télomères cassent préférentiellement au niveau de la fusion, restaurant ainsi fréquemment le caryotype et la viabilité de la lignée (Pobiega and Marcand, 2010), par un mécanisme qui reste à définir. Ce mécanisme pourrait avoir été sélectionné évolutivement comme un ultime moyen de sauvetage du caryotype après une fusion télomère-télomère.

Dynamique des chromosomes dicentriques avant leur rupture

Au cours de l’anaphase d’une cellule monocentrique, les deux pôles du fuseau mitotique (SPB), servant à l’organisation des microtubules sont éloignés l’un de l’autre par l’élongation du fuseau mitotique. A cette étape, les centromères sont tirés par les SPB ce qui permet la séparation des chromatides soeurs. Ils se retrouvent ainsi aux pôles opposés au site de constriction. Il peut alors sembler paradoxal qu’une cassure proche des centromères dépende de la cytodiérèse.
Au début de la cytodiérèse, les deux noyaux ne contenant que des chromosomes monocentriques sont disjoints et la dépolymérisation des microtubules ne provoque alors qu’un mouvement mineur des SPB, en direction du centre de la cellule dans laquelle ils ont été ségrégés (Figure 4 Panneau du haut). Ce comportement est également observé dans la moitié des cellules d’une population contenant un dicentrique, ce qui est attendu vis à vis des deux configurations que peuvent adopter ces chromosomes en mitose (Lopez et al., 2015; Thrower and Bloom, 2001) (Figure 2). Cependant, dans l’autre moitié de cette même population, on assiste à un retour rapide des SPB et des centromères au niveau du point d’abscission, à la fin de la contraction de l’anneau d’actomyosine ou rapidement après sa dépolymérisation (Figure 4 Panneaux du milieu et du bas). Ce mouvement des SPB est par ailleurs précédé par celui des centromères du dicentrique (Lopez et al., 2015; Thrower and Bloom, 2001). Ceci laisse penser que i) la région intercentromérique relie toujours les centromères et donc que le pont d’anaphase n’est pas cassé à ce stade ii) une recondensation ou un retour élastique de la chromatine pourrait diriger ce mouvement après la relâche des forces de tension exercées par le fuseau iii) ce retour permet une cassure des dicentriques par la cytodiérèse au niveau des régions péricentromériques.
Les images sont prises sur une souche contenant un chromosome dicentrique activé en glucose. L’anneau est taggué par Myo1-GFP (schématisé par un demi-cercle vert), les microtubules par Tub1-CFP (bleus) et les pôles du fuseau par Spc42-mCherry (verts). Images issues de : (Lopez et al., 2015).
Comme mentionné plus haut, les chromosomes dicentriques formés par une fusion de télomères cassent plus fréquemment aux sites de fusion. Les fusions télomériques étant constituées d’ADN double brin, il a semblé essentiel de tester le rôle de la principale protéine liant les séquences TG1-3 aux télomères : Rap1.

La protéine Rap1

Découverte et principaux rôles

Rap1 (« Repressor Activator Protein 1 ») est une protéine essentielle de S. cerevisiae découverte par David Shore et Kim Nasmyth en 1987 (Shore and Nasmyth, 1987). Elle est encodée par un gène présent en une seule copie et sans redondance. Ce facteur de transcription fut caractérisé pour son rôle de répresseur de la transcription des loci régulant le type sexuel, mais également pour sa fonction d’activateur de la transcription. La protéine Rap1 est ainsi impliquée dans la régulation de la transcription de 92 des 121 gènes encodant des protéines ribosomales (Rhee and Pugh, 2011) et contrôle la régulation de gènes essentiels à la glycolyse. On estime que Rap1 régule l’expression de 300 à 500 gènes en croissance exponentielle en glucose, ce qui représente entre 5% à 10% du génome de la levure (Lieb et al., 2001; Rhee and Pugh, 2011). En l’absence de glucose, le profil de fixation de Rap1 sur l’ADN varie et on retrouve la protéine aux promoteurs de 52 gènes (Buck and Lieb, 2006) permettant ainsi aux cellules de réguler leur profil transcriptionnel et de s’adapter aux conditions de croissance et à la source de carbone. De même, Rap1 est relocalisé suite à la détection de dommages à l’ADN et permet l’activation de la transcription de RNR3, dont la protéine est impliquée dans le contrôle de la concentration en dNTPs dans la cellule et donc dans la réparation de l’ADN (Tomar et al., 2008). Il est également proposé que Rap1 contrôle l’expression des gènes en senescence réplicative induite par une perte de télomérase, en étant relocalisée des télomères trop courts vers les promoteurs de centaines de gènes. Rap1 réprime notamment l’expression des histones canoniques en senescence (Platt et al., 2013).
La mort rapide des cellules déplétées en Rap1 (Shore and Nasmyth, 1987) est probablement provoquée par la dérégulation globale de la transcription. Cependant, Rap1 possède également un autre rôle majeur aux télomères.
Contrairement au reste du génome où l’on ne trouve que des sites Rap1 isolés ou en cluster de deux sites espacés de 20 à 100 pb (Kubik et al., 2018; Rhee and Pugh, 2011), on estime que les séquences double brin riches en guanines des télomères (TG1-3) sont couvertes, à raison d’une protéine toutes les 15-20 paires de bases environ, d’après des analyses in vitro (Conrad et al., 1990; Gilson et al., 1993; Ray and Runge, 1999a, 1999b). On estime donc qu’il y a entre 15 et 20 protéines Rap1 fixées en tandem, sur chacun des 32 télomères de la levure haploïde (longueur moyenne de l’ordre de 300 ± 40 pb) (Conrad et al., 1990; Förstemann et al., 2000; Wright and Zakian, 1995). Ainsi, entre 500 et 600 protéines Rap1 sont liées aux télomères ce qui correspond à 10 à 15% des 4000 à 5000 molécules estimées présentes dans une cellule (Ghaemmaghami et al., 2003). Cependant, entre 3 et 8 foyers de Rap1 par cellules sont observés, ce qui correspondent aux clusters de télomères et non à une distribution nucléaire homogène (Palladino et al., 1993; Rabl, 1887). Il est donc proposé que des interactions indépendantes de la fixation de Rap1 à l’ADN avec les protéines Sir3/4 aux télomères et subtélomères permettent de concentrer la protéine Rap1 dans ces foyers à la périphérie du noyau (Gotta et al., 1996).

Table des matières

I) Les chromosomes dicentriques
1) Formation des chromosomes dicentriques
2) Les chromosomes dicentriques, causes d’instabilité génétique
a) Ségrégation et réarrangements induits par les dicentriques
b) Instabilité génétique et cancers
3) Mécanisme de rupture des ponts d’anaphase
a) Chez les animaux
b) Le centromère conditionnel et l’étude des dicentriques chez S. cerevisiae
c) Dynamique des chromosomes dicentriques avant leur rupture
II) La protéine Rap1
1) Découverte et principaux rôles
2) Les différents domaines de Rap1 et leurs fonctions
a) Le domaine de fixation à l’ADN (DBD)
b) Conséquences de la structure de Rap1 et de son attachement à l’ADN
i) Fixation de Rap1 et réplication
ii) Réarrangement des nucléosomes
iii) Terminaison de la transcription
iv) Rôle aux télomères
c) La partie N-terminale et le BRCT
d) Le domaine toxique (Tox)
e) Le domaine d’activation
f) Le RCT
III) Condensine chez S. cerevisiae
1) Historique et généralités
2) Méthodes d’étude de la condensation des chromosomes
3) Structure des Condensines et liaison à l’ADN
a) Structure générale des complexes SMC
b) Structure spécifique de Condensine
c) Fixation de Condensine à l’ADN
d) Fonctions des ATPases
e) Les régions Coiled-Coil
i) Les régions Coiled-coil chez les eucaryotes
ii) Structure de Smc chez Baccilus subtilis
4) Rôles, partenaires et fonction de Condensine
a) Multiples rôles de Condensine
b) Modèle de condensation
i) Modèle de réticulation stochastique ou random crosslinking
ii) Modèle d’extrusion de boucles
c) Partenaires de Condensine
i) Facteurs nécessaires à la condensation des chromosomes
ii) Topoisomérase II-α
5) Régulation des Condensines au cours du cycle cellulaire
a) Régulation transcriptionelle
b) Modifications post-traductionelles régulant Condensine
i) Activation de la condensation par les kinases CDK1, Cdc5 et Ipl1
ii) Déphosphorylation et décondensation
iii) Ubiquitination de Condensine et dynamique de fixation
iv) Conservation des mécanismes chez les autres eucaryotes
6) Condensine sur le chromosome in vivo
a) Sites préférentiels de fixation à l’ADN et condensation du chromosome
i) Recrutement de Condensine aux régions péricentromériques
ii) Recrutement aux autres loci
b) Condensine, transcription et remodellage de la chromatine
c) Condensine aux télomères ?
IV) Cytodiérèse et croissance du septum chez S. cerevisiae
1) Le rôle des septines
2) L’anneau d’actomyosine et la formation du septum primaire
a) Recrutement de l’anneau d’actomyosine et synthèse du septum primaire
b) La dépolymérisation de l’anneau d’actomyosine
3) Le septum secondaire
4) Séparation cellulaire
5) Le réseau de sortie mitotique
7) Un point de contrôle de l’abscission ?
Article : Strains and plasmids
Résultats complémentaires
Discussion
Bibliographie

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