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Les chromosomes bactériens : plusieurs niveaux d’organisation du chromosome.
Les bactéries sont des organismes ubiquitaires microscopiques dont la taille des génomes va de moins de 200 kb à plus de 13 Mb (Rocha, 2008). Elles peuvent avoir différentes formes (bacilles, coques, etc..) et sont capables d’échanges génétiques horizontaux par différents mécanismes (conjugaison, transduction, transformation, transposition) via différents éléments génétiques mobiles (phages, plasmides, transposons).
Deux formes d’ADN sont retrouvées chez les bactéries : l’ADN chromosomique et l’ADN porté par les plasmides ou pièces d’ADN circulaires non chromosomiques. Ces derniers ne sont pas essentiels pour la cellule hôte mais peuvent conférer certains avantages dans certaines conditions de croissance.
Le plus souvent, les bactéries possèdent un unique chromosome circulaire. 10 % des bactéries dont le génome a été séquencé possèdent cependant deux ou plusieurs chromosomes. Ces bactéries appartiennent à différents taxons notamment les Chloroflexi, les Deinococcus, les Spirochaete, les Proteobacteria (de classe alpha, beta, gamma), suggérant que les chromosomes supplémentaires sont apparus de façon indépendante et plusieurs fois au cours de l’évolution (Casjens, 1998). En général ces chromosomes supplémentaires sont circulaires mais dans certains cas ils peuvent être linéaires comme par exemple chez Agrobacterium dont l’un des deux chromosomes est linéaire. Par ailleurs, les chromosomes des bactéries des genres Borelias et Streptomyces sont linéaires (Casjens, 1998; Feijoo-Siota et al., 2017; Val et al., 2014) (Figure 6).
Les chromosomes bactériens sont beaucoup plus petits que les chromosomes eucaryotes (le plus petit chromosome humain est 10 fois plus grand que le chromosome d’E. coli qui a une taille de 4 Mb environ). L’absence de noyau dans ces cellules a laissé imaginer un ADN libre dans le cytoplasme. Le développement de nouvelles techniques de microscopie a permis la mise en évidence d’une organisation de l’information génétique. L’utilisation de colorant de l’ADN a en effet permis d’observer en microscopie que cet ADN est confiné dans la cellule dans une région distincte de la cellule ne contenant pas de ribosomes appelée « nucléoide ». Le « nucléoide » d’E. coli a été décrit pour la première fois en 1937 par Piekarski qui a utilisé un marquage au réactif de Feulgen puis avec une coloration au Giemsa, qui permettent tous deux de visualiser l’ADN (Figure 7). Sa visualisation a ensuite été améliorée avec la microscopie en contraste de phase (Mason and Powelson, 1956, Stempen 1950). Par ailleurs des organisations en « nucléoides » ont également été observées pour plusieurs autres types de bactéries notamment par Neumann (Robinow and Kellenberger, 1994). Ensuite en 1963, Cairns a démontré que le chromosome bactérien est unique et circulaire par des observations en autoradiographie du chromosome (Cairns, 1963).
Figure 8 Le chromosome bactérien circulaire
(A) Le rond blanc représente l’origine de réplication, l’ovale noir représente le site dif.
Le replichore gauche est représenté en rose, le réplichore droit en bleu
(B) Sur ce schéma est représenté le chromosome circulaire en cours de réplication. Ainsi, on peut voir deux copies de l’origine de réplication. Les deux flèches indiquent le sens des deux fourches de réplication.
L’organisation des chromosomes bactériens a par la suite été étudiée plus en détail et plusieurs niveaux d’organisation ont été ainsi identifiés. Deux types d’organisation du chromosome bactérien peuvent être distingués. Il y a en effet une organisation moléculaire qui est le résultat d’une combinaison de processus. L’ADN est surenroulé et des protéines interagissant avec l’ADN comme les NAPs (Nucleoid Associated Proteins) et les protéines de types SMC (homologues aux protéines SMC eucaryotes) participent aussi à l’organisation et la compaction du chromosome bactérien. A une échelle supérieure des domaines d’interaction ou CIDs (Chromosomal Interaction Domains) ont aussi été identifiés et chez certaines bactéries il existe également une organisation à plus grande échelle en macrodomaines.
Il y aussi une organisation spatiale du chromosome dans la cellule. Selon les bactéries, le chromosome peut ainsi être orienté transversalement ou longitudinalement.
Une combinaison de ces deux types d’orientations est aussi retrouvée chez certaines espèces.
Organisation moléculaire
Comme déjà évoqué précédemment, chez les bactéries réplication et ségrégation sont concomitantes. Selon les bactéries, un ou plusieurs nouveau(x) cycle(s) de réplication sont entamés avant la division cellulaire et la fin du cycle de réplication précédent, permettant ainsi à la bactérie d’avoir un cycle cellulaire plus rapide (20 minutes chez E. coli par exemple).
En général le chromosome bactérien contient une origine de réplication (oriC), un bras droit, un bras gauche, et une région de terminaison. Il est répliqué via deux fourches de réplication qui contiennent les complexes protéiques nécessaires, chacune sur un bras du chromosome (Figure 8). La réplication est asymétrique. Elle est en effet continue sur l’un des deux brins d’ADN ou « leading strand » et est discontinue sur le deuxième brin ou « lagging strand » (Rocha, 2004) (Figure 8).
L’asymétrie de la réplication entraîne des biais mutationnels :
Réplication et transcription se font souvent simultanément. La vitesse de l’ARN polymérase (RNAP) est de 50nt/seconde chez E. coli soit 20 fois moins rapide que l’ADN polymérase. Des collisions entre ARN polymérase et ADN polymérase sont donc inévitables. La transcription se fait dans le sens 5’->3’; donc ces collisions sont frontales pour le brin « lagging » et co-orientées pour le brin « leading». Des études ont par ailleurs montré que seules les collisions frontales sont plus dommageables pour la fourche de réplication (Deshpande and Newlon, 1996; French, 1992). Cette différence engendre un biais d’orientation au niveau des gènes sur chaque brin : Il a en effet été observé chez la plupart des bactéries qu’il y a plus de gènes (55 à 80% selon les espèces) sur le brin « leading » (McLean et al., 1998). Chez Bacillus subtilis par exemple, 75% des gènes sont sur le brin « leading » (Kunst et al., 1997). Ce pourcentage est de 55% chez E. coli (Blattner et al., 1997). De plus, les gènes fortement exprimés sont souvent sur le brin « leading » (Rocha, 2004).
Un autre biais de composition de gènes est également observé sur les chromosomes bactériens, notamment chez E. coli. Sachant que la vitesse de réplication varie autour de 600-1000nt/sec chez cette espèce, cela veut dire qu’il faut entre 40 et 67 min pour répliquer tout le chromosome. En condition de croissance rapide le temps de multiplication observé est de 20 min, ce qui implique que deux à trois cycles de réplication se font en même temps (1 nouveau cycle est initié toutes les 20 minutes).
Cela implique aussi qu’il y a dans la cellule plus de copies des gènes situés au niveau de l’origine de réplication qu’au niveau du terminus (de 4 à 8x plus) (Chandler and Pritchard, 1975). Pour cette raison, chez les bactéries à cycle rapide, les gènes essentiels (hautement transcrits ou non) sont souvent regroupés dans la région d’oriC.
Le surenroulement de l’ADN
Un premier niveau d’organisation du chromosome est le surenroulement négatif de l’ADN qui entraîne la formation de domaines topologiquement isolés sur le chromosome.
Une étude réalisée en 1972 chez E. coli, a tout d’abord permis la mise en évidence de ces domaines topologiques (Worcel and Burgi, 1972). En effet, il a été observé in vitro que si une coupure suffit au relâchement de l’ADN d’un plasmide, un grand nombre de coupures par la DNase I est nécessaire pour relâcher intégralement le chromosome. Dans la même étude, l’utilisation de centrifugations en gradient de sucrose, a permis de montrer que le chromosome est divisé en 12 à 80 domaines. Cela a été confirmé in vivo en utilisant du psoralène (un agent pontant) qui fixe les boucles d’ADN (l’incorporation du psoralène est proportionnel au surenroulement négatif) (Sinden and Pettijohn, 1981). 50 domaines par chromosome ont ainsi été délimités. Des analyses ont aussi été réalisées en microscopie électronique et ont permis l’observation de nombreuses boucles émanant d’une région centrale, formant des microdomaines (Kavenoff and Bowen, 1976; Kavenoff and Ryder, 1976). 65 à 200 boucles ou domaines ont été comptés, ce qui corrèle avec les études précédentes. Cependant les techniques utilisées dans ces études ont leurs limites.
Notamment les expériences in vitro qui peuvent entraîner la formation de barrières lors des étapes d’isolation/fixation de l’ADN et à l’inverse la perte des domaines dus à des interactions transitoires in vivo. Concernant les calculs réalisés à partir des images de microscopie, ils ont été faits en partant du principe que tous les domaines sont de même taille ce qui n’est pas prouvé. Plus récemment, chez Salmonella enterica l’utilisation d’un outil génétique (la résolvase qui requiert le surenroulement négatif de l’ADN pour fonctionner) a réduit la taille des domaines à 25kb (Higgins et al., 1996). En 2004, des études de la réponse transcriptionnelle suite à des cassures doubles brins par des enzymes de restrictions, et des études de microscopie électronique ont finalement permis de conclure que les domaines topologiques sont en moyenne d’une longueur de 10kb (le chromosome de E. coli environ 4Mb donc 4000/10 = 400 domaines) (Postow et al., 2004) (Figure 9). Ils ne sont pas forcément à la même localisation dans chaque cellule et leur taille n’est pas forcement identique.
Ces domaines condensent le chromosome, et aident notamment pour la réparation des cassures double brins d’ADN (en maintenant les deux extrémités cassées entre elles).
Ce surenroulement négatif est régulé par des ADN-topoisomérases. Ces enzymes sont de deux types : les topoisomérases de type I coupent un seul brin d’ADN pour réguler la super-hélicité de l’ADN. Les topoisomérases de type II, comme la gyrase et la topoIV, agissent sur l’ADN par des cassures double brin.
Protéines interagissant avec l’ADN
NAP (Nucleoid Associated Proteins)
Une part de la compaction est assurée par des petites protéines abondantes interagissant avec l’ADN, appelées NAP pour Nucleoid Associated Protein. Ces protéines, conservées plus ou moins fortement entre les espèces bactériennes se fixent de façon spécifique et non spécifique sur l’ADN et facilitent la compaction notamment en formant des ponts entre des loci du chromosome ou en courbant l’ADN (Dame, 2005; Dillon and Dorman, 2010). Elles peuvent aussi avoir un impact sur la transcription des gènes et jouer un rôle dans certains processus importants pour la cellule, comme la recombinaison site-spécifique ou la réplication. De nombreuses études les concernant ont été réalisées, surtout chez E. coli ou environ une dizaine de NAPs ont été identifiées dont les 4 plus connues sont détaillées ciaprès (Figure 10). Certaines de ces NAPs sont retrouvées chez P. aeruginosa, notamment des homologues fonctionnels de HN-S (MvaU et MvaT), de HUde FIS et de IHF mais leurs rôles dans l’organisation des chromosomes restent à explorer (Kim et al., 2004; Ohniwa et al., 2011; Takeyasu et al., 2004). Si leur structure est maintenant assez bien connue, leur rôle in vivo n’est pas facile à caractériser car leur mutation a des effets pléiotropiques et il y a souvent des redondances fonctionnelles.
– H-NS : Histone-like Structuring Protein : Cette protéine est conservée chez les Gammaproteobactérie dont notamment E. coli, P. aeruginosa (deux homologues fonctionnels MvaU
et MvaT), Vibrio. Cholerae (Dillon and Dorman, 2010). Abondante et versatile, elle est constituée d’une partie N-terminale lui permettant de former des dimères et peut se fixer à l’ADN par sa partie C-terminale. Les complexes H-NS-ADN forment des ponts entre des régions d’ADN doubles brins proches et condensent ainsi l’ADN surenroulé. Elle se fixe sur l’ADN, souvent dans des régions riches en AT, au niveau des promoteurs de gènes sensibles au surenroulement de l’ADN renforçant le lien de cette protéine avec celui-ci (Noom et al., 2007). Un site de fixation spécifique de 10pb a plus récemment été identifié au niveau des régions régulatrices des gènes régulés par H-NS. L’alternance entre ces sites de fixation spécifiques de hautes affinités et de fixation dans des régions riches en AT favorise la formation d’oligomères de H-NS, qui peuvent se repartir sur le chromosome entraînant la fixation et donc la régulation d’autres gènes. Elle régule ainsi environ 8% des gènes chez E.coli principalement en les réprimant (notamment les gènes issus du transfert horizontal).
Figure 10 : 4 exemple de NAPs (Nucloid Associated Proteins)
a, image en SFM (Scanning Force Microscopy) de boucles d’ADN, conséquences du « bridging » d’un duplex d’ADN par H-NS
b modèle basse résolution du « bridging » d’un duplex d’ADN par H-NS
c image en SFM d’un complexe ADN-IHF
g image en SFM d’un complexe ADN-HU qui courbe l’ADN à basse concentration (photo du haut) et forme des filaments rigides à forte concentration (photo du bas)
d,h modèle basse résolution de la compaction de l’ADN par fixation de nombreuses molécules de IHF/HU et par formation de filaments de HU
e image en SFM des complexes ADN-FIS qui entrainent la formation de noeuds
f modèle basse résolution des noeuds formés par FIS sur l’ADN via des interaction FIS-FIS (Luijsterburg and Noom, 2006).
– HU : Heat-Unstable Protein : Cette protéine est retrouvée chez la plupart des bactéries. HU peut exister sous forme d’homodimères ou d’hétérodimères (selon la croissance de la bactérie) formés des sous-unités HU et HUqui sont identiques en séquence à 70%. HU se fixe de manière non spécifique sur l’ADN mais avec une préférence pour les régions déformées et/ou riches en AT (comme les régions courbées). En fonction de sa concentration, cette protéine peut avoir différents effets. La fixation de simples dimères à différentes positions, peut courber localement l’ADN et augmenter sa flexibilité (Swinger and Rice, 2004). A plus forte concentration, HU peut également former des filaments rigides dans lesquels HU et l’ADN sont enroulés en spirales (Luijsterburg et al., 2006) et participer ainsi à l’organisation du chromosome. HU est présent en très grand nombre sur le chromosome en phase exponentielle, et en le recouvrant permet de courber 10% de l’ADN (environ 30000 HU par cellule) (Ali Azam et al., 1999). HU aurait un effet sur le surenroulement négatif car sa mutation entraîne une diminution du surenroulement de l’ADN. Chez Caulobacter crescentus, l’effet de HU sur le chromosome a été étudié par capture de conformation chromosomique (HI-C) ce qui a confirmé un effet global sur la compaction du chromosome.
– IHF (Integration Host Factor) : Egalement présente chez la plupart des bactéries, c’est une protéine homologue à HU en séquence mais elle a un mode d’interaction avec l’ADN différent. Sa forme native est un hétéro-dimère. Cette protéine se fixe sur l’ADN entraînant sa courbure d’environ 160°. Elle peut donc fortement influencer la structure de l’ADN et entraîne la formation de boucles d’ADN réduisant la longueur de ce dernier jusqu’à 30% (Luijsterburg et al., 2006). Chez E.coli elle se fixe sur des sites spécifiques (1000 sites sur le chromosome) souvent localisés proches des promoteurs des gènes. Elle est en effet reconnue comme un facteur de régulation de la transcription de nombreux gènes (Swinger and Rice, 2004). Elle est particulièrement abondante en début de phase stationnaire suggérant un rôle de cette protéine sur le nucléoide (structural ou fonctionnel) pendant la transition phase exponentielle/phase stationnaire (Ali Azam et al., 1999).
– FIS : Factor for Inversion Stimulation : Cette protéine a d’abord été identifiée chez E. coli puis a été retrouvée chez d’autres Gamma-protéobactérie en tant que facteur impliqué dans la recombinaison site-spécifique. Elle est également constituée de deux sous unités. Les homo-dimères de FIS se fixe à l’ADN de façon spécifique sur une séquence de 17bp riche en AT et courbent l’ADN d’environ 50-90°. Ils influencent ainsi probablement l’organisation et la compaction de l’ADN (Dillon and Dorman, 2010). Cette fixation se fait à de nombreuses localisations surtout dans les régions promotrices. FIS peut en effet activer ou réprimer l’expression des gènes notamment de gènes impliqués dans la croissance comme le montre son expression au cours du cycle cellulaire. Il régule l’expression d’une topoisomérase (gyrase) influençant ainsi le surenroulement de l’ADN. C’est la NAP la plus abondante chez E. coli en phase exponentielle de croissance. Son expression diminue ensuite jusqu’à devenir indétectable en phase stationnaire (Ali Azam et al., 1999).
Les 3 familles de condensines retrouvées chez les bactéries sont représentées ici.
SMC-ScpA/B en orange à gauche
MukB-MukEF en bleu au centre
MksB-MksEF en vert à droite (Gruber, 2011).
Figure 12 : Localisation de ScpB-YFP dans une souche WT et dans le mutant spo0J
En haut : Localisation de ScpB-YFP, dans une souche sauvage à gauche et spo0J à droite.
En bas : superposition de la localisation de ScpB-YFP, dans une souche sauvage à gauche et spo0J à droite, et de la coloration des membranes avec du TMA-DPH (trimethylamine-diphenylhexatriene) (Sullivan et al., 2009).
Les protéines de type SMC
Chez les bactéries, les complexes protéiques de type SMC ou condensines bactériennes sont beaucoup moins abondants que les NAPs. Ces condensines bactériennes sont retrouvées dans la grande majorité des espèces bactériennes séquencées. Elles contiennent un dimère de protéines de type SMC fortement homologues aux condensines eucaryotes et des sous-unités associées qui sont plus proches de celles associées aux protéines SMC5/6 (Palecek and Gruber, 2015). Au vue des défauts observés en cas d’inactivation de ces condensines bactériennes, ces complexes protéiques jouent un rôle dans l’organisation et la ségrégation des chromosomes.
Trois grandes familles de condensines bactériennes ont été identifiées : SMC et ses sous-unités associées ScpA et ScpB, MukB et ses sous-unités associées MukE et MukF et plus récemment MksB et ses sous-unités associées MksE et MksF (Figure 11). Même si elles diffèrent par leurs séquences, elles présentent toutes une architecture similaire. La plupart des bactéries possèdent un complexe SMC-ScpA/B (Soppa et al., 2002) ; Chez certaines gamma-protéobactéries SMC est remplacé par MukBEF comme E.coli et V. cholerae (Niki et al., 1991; Rybenkov et al., 2014). Plus recemment le complexe MksbEF a été identifié chez certaines espèces (Petrushenko et al., 2011). Certaines bactéries ont plusieurs condensines bactériennes. C’est notamment le cas de la souche PAO1 de P. aeruginosa possède un complexe SMC et un complexe MksBEF (Petrushenko et al., 2011). Il y a aussi des bactéries qui ont plusieurs complexes MksBEF et un complexe SMC/ScpAB (Pseudomonas synrigae, Roseburia inulinivora, Bifidobacterium longum), d’autres qui ont MukBEF et SMC-ScpA/B (Aeromonas) et des bactéries qui ont un complexe MksBEF, un complexe MukBEF et un complexe SMC/ScpAB (Photorhabdus luminescens subsp laumondii) (Petrushenko et al., 2011). Plusieurs combinaisons sont donc possibles et le rôle propre à chaque complexe (selon ces différentes conditions) reste à caractériser plus en détails. Selon les bactéries ces condensines sont plus ou moins essentielles. Ainsi chez B. subtilis, la délétion de SMC à un fort impact sur la ségrégation (Britton et al., 1998) et smc est même essentiel pour la ségrégation des origines en condition de croissance rapide cf. détails SMC-ScpA/B) alors que chez P. aeruginosa sa mutation n’a qu’un faible impact (voir deuxième partie des résultats).
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Table des matières
INTRODUCTION
1. Organisation des chromosomes
1.1. Les niveaux d’organisation des chromosomes eucaryotes
1.2 Les chromosomes bactériens : plusieurs niveaux d’organisation du chromosome.
1.2.1 Organisation moléculaire
1.2.1.1. Le surenroulement de l’ADN
1.2.1.2 Protéines interagissant avec l’ADN
NAP (Nucleoid Associated Proteins)
Les protéines de type SMC
1.2.1.3 Chromosomal Interaction Domains (CID)
1.2.1.4 Macrodomaines
1.2.2 Organisation spatiale
2. Ségrégation des chromosomes
2.1 Initiation de la ségrégation des chromosomes bactériens :
2.1.1. Ségrégation des origines chez les bactéries ayant un système de partition.
2.1.1.1. Ségrégation des chromosomes bactérien – système de partition de type I
2.1.1.2. Un ancrage au pôle du chromosome pour certaines bactéries
2.1.2. Ségrégation des origines de réplication chez les bactéries sans système de partition
2.2. Ségrégation de l’ensemble du chromosome
2.3. La terminaison de la ségrégation – division cellulaire
3. Pseudomonas aeruginosa
3.1. Un pathogène opportuniste
3.2. Organisation du chromosome et cycle cellulaire
3.3. Souche PAO1 du laboratoire
3.4. Problématiques de la thèse
RESULTATS
1. Article “Regional Control of Chromosome Segregation in Pseudomonas aeruginosa”
1.1. Résumé de l’article “Regional Control of Chromosome Segregation in Pseudomonas aeruginosa”
1.2 Article “Regional Control of Chromosome Segregation in Pseudomonas aeruginosa
2. Etude du rôle de SMC-ScpAB et lien avec le système ParABS
2.1. Etude préliminaire effet de SMC-ScpAB sur la ségrégation
3. Synthèse / conclusions
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
1 Processus de ségrégation des chromosomes
1.1. Fixation de ParB sur le chromosome
1.2. « Zone de compétence » de parS
1.3. Impact du déplacement d’un site parS sur le chromosome
1.4. Impact de la présence de deux parS éloigné sur le chromosome
2. Conformation, disposition et positionnement du chromosome.
MATERIEL ET METHODES
1. Matériels
1.1. Milieux
1.2. Souches
2. Méthodes
2.1. Construction des souches
2.2 Suivi de la croissance au cours du temps.
2.3 Marquage des cellules et coloration DAPI
2.4. Etude de la position cellulaire du chromosome par microscopie.
2.5. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP).
2.6 Transposition suivie d’un séquençage haut-débit (Tn-seq)
2.7 Capture de conformation chromosomique (3C-seq)
ANNEXES
BIBLIOGRAPHIE
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