LES CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES D’ORIGINE ADIPEUSES

LES CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES D’ORIGINE ADIPEUSES

Cancer et CSM : risque de tumorigénicité ou potentiel inhibiteur, une question complexe et controversée

Les propriétés des cellules souches mésenchymateuses leur donne un fort potentiel thérapeutique et ouvrent un champ prometteur pour la médecine qui ne cesse de prouver leur intérêt à travers les essais cliniques. Comme nous allons cependant le voir à travers la problématique du cancer, ce sont ces mêmes capacités intrinsèques des cellules souches mésenchymateuses qui pourraient être la source de complications.
 Contradictions : des modèles non standardisés et grande variabilité des facteurs de risque
La problématique quant au potentiel de tumorigénicité intrinsèque des cellules souches réside dans leur capacité d’autorenouvèlement et de multiplication qui laisse à penser qu’une dérive vers un phénotype tumoral est possible dans des conditions in vitro ou in vivo. En 2011 s’est tenue une réunion rassemblant des experts de la médecine régénérative, la Cell Products Working Party. Les conclusions et les questionnements de cette assemblée mettent en évidence des contradictions dans les dernières publications scientifiques traitant du lien entre les cellules souches mésenchymateuses et les processus tumoraux. In vitro, la transformation des cellules souches en cellules tumorales a pu être démontrée après des processus de culture cellulaire à long terme (Serakinci et al., 2004) (Engels et al., 2011), ou bien rejetée (Grulich et al., 2007) (Zhang et al., 2009) (Lazennec et al., 2008). Cette opposition de résultats est le reflet d’un manque de systématisation et de standardisation des méthodes expérimentales en médecine régénérative, qui reste un domaine de recherche nouveau, où les mécanismes d’action restent inconnus dans le détail. D’ailleurs, un rapport concernant ces études ((Serakinci et al., 2004) et (Engels et al., 2011)) montre que les cultures cellulaires utilisées étaient en fait contaminées par des cellules malignes (Garcia et al., 2010) (Torsvik et al., 2010).
L’importance de ce groupe de travail a ainsi été de pousser les chercheurs à instaurer des conditions de bonne pratique de façon à rendre les résultats de leurs études comparables entre eux. Certains facteurs de risques potentiels inhérents aux conditions expérimentales ont pu être identifiés durant la discussion, et concourent à expliquer la grande variabilité des réponses au potentiel tumoral des cellules souches mésenchymateuses :
– les anomalies chromosomiques donneur-dépendant
-les conditions de culture cellulaire (comme la dissociation cellulaire enzymatique à la trypsine par rapport à la dissociation mécanique)
– la durée d’amplification des cellules (qui augmente significativement la formation d’anomalie chromosomique)
Même si la plupart des anomalies chromosomiques mène la cellule à l’apoptose, il a été suggéré dans un contexte thérapeutique, d’évaluer le risque de transformation des cellules souches lors de leur culture à l’aide de marqueurs moléculaires.
Les différents aspects du risque de transformation tumorale des CSM sont fortement débattus, et restent encore à être confirmés. La cohérence des résultats doit être discutée en fonction des conditions expérimentales des études, pour statuer sur l’innocuité d’une thérapie régénérative par injection de cellules souches mésenchymateuses.

Le potentiel tumoral est multiple

Comme nous l’avons mentionné plus haut, une problématique de la thérapie régénérative repose sur le potentiel tumoral qui pourrait être inhérent à la nature même des cellules souches mésenchymateuses, qui ont la capacité d’auto-renouvèlement. Il existe cependant d’autres perspectives négatives à l’utilisation d’un tel traitement dans un contexte où l’individu receveur pourrait déjà être atteint d’un cancer. Certaines propriétés des CSM laissent penser que leur interaction avec les cellules tumorales préexistantes in vivo pourraient ne pas être neutre, comme leur potentiel d’angiogenèse, d’immunosuppression ou de communication paracrine par l’intermédiaire de cytokines.

Migration des CSM dans le tissu tumoral : reconnaissance d’un milieu lésionnel

Un des critères rendant l’injection de CSM potentiellement risquée est leur capacité à reconnaitre le milieu tumoral comme un site lésionnel au même titre que les sites inflammatoires et les pertes de substance, capacité pour laquelle elles ont d’ailleurs été étudiées à l’origine. Les CSM sont normalement présentes dans la circulation générale à un niveau de fréquence bas, mais un signal pathologique comme l’hypoxie ou l’inflammation les mobilise faisant augmenter leur quantité dans le sang périphérique, phénomène que l’on peut qualifier de migratoire (Zhang et al., 2009) (Nilsson et al., 2004) (Hall et al., 2007). En 2009, Zhang et al. ont démontré la capacité des cellules issues de la FSV (fraction stromale vasculaire) et du tissu adipeux blanc à migrer dans des xénogreffes tumorales (modèles de sarcome de Kaposi, adénocarcinome mammaire, adénocarcinome prostatique) chez la souris nude (Zhang et al., 2009). Dans la mesure où aucune des cellules injectées n’ont été repérées dans les organes contrôles, la reconnaissance spécifique du site tumoral par les cellules progénitrices est rendue évidente, au même titre que les sites inflammatoires.

L’angiogenèse dans la promotion tumorale

Beaucoup d’études s’accordent sur le fait que les ASC soutiennent la croissance tumorale. Il existe d’ailleurs une relation positive entre l’obésité et le cancer ((Casteilla 2011) (Roberts et al., 2006) (Zhang et al., 2009), qui a donné naissance à l’idée selon laquelle les cellules souches mésenchymateuses d’origine adipeuse, qui ont la particularité d’avoir un potentiel d’angiogenèse plus important que les cellules souches dérivées de la moelle osseuse, favoriseraient la croissance tumorale de manière directe, en apportant de la néovascularisation (Zimmerlin et al., 2011) (Lin et al. 2010) (Zhang et al., 2009) (Lazennec et al., 2008). Des cellules issues de la FSV injectées par voie intraveineuses peuvent se greffer dans des compartiments tumoraux distincts, 80% étant associé au stroma, le reste à la paroi vasculaire (Zhang et al., 2009). A une semaine post-injection, environ 25% des vaisseaux tumoraux contiennent des cellules marquées à la GFP (Green Fluorescence Protein), qui au jour 14 ont pu acquérir une morphologie vasculaire non distinguable du reste des capillaires tumoraux.Cette étude montre de même que les ASC soutiennent la croissance tumorale. L’injection sous-cutanée de 104 ASC chez la souris nude ayant subi une xénogreffe de tumeur KS1767, a mis en évidence une croissance accélérée de la tumeur sur un intervalle de 2 semaines. Cet effet a ensuite été reproduit sur un modèle de cancer prostatique. L’analyse des tissus après 6 semaines a montré une accumulation des ASC dans les tumeurs et non dans les tissus de contrôle.Mais le soutien à la croissance tumorale ne se résume pas dans un effet direct de participation à l’angiogenèse, et réside aussi dans l’attraction et la stimulation des cellules endothéliales par les CSM, grâce à l’expression de facteurs proangiogéniques induits par l’interaction entre les cellules carcinomateuses et les cellules souches (Lazennec et al., 2008) (Sun et al., 2005) (Kyriakou et al., 2006). De plus les CSM expriment les interleukines 8 (IL8), impliquées dans le recrutement des cellules progénitrices endothéliales.

Cytokines

La co-culture de CSM et de cellules issues de tumeur mammaire, ou bien une interaction indirecte (à travers des facteurs de croissance par exemple) entre les deux types d’entité améliore la prolifération des cellules tumorales. Ceci suggère l’implication de facteurs solubles, notamment des interleukines 6 et les VEGF, comme le démontre une étude de 2004 mettant en évidence l’influence identique de ces facteurs et des CSM sur une lignée cellulaire de cancer du sein MCF-7 (Fierro et al., 2004).Le myélome multiple (MM) sécrète le facteur Dkk1 (l’inhibiteur Wnt Dickkopf-1) qui empêche les CSM de se différentier en ostéoblastes. De leur côté les CSM sécrètent des IL-6 qui stimulent la prolifération des cellules myélomateuses (Gunn et al., 2006). De plus, il a été démontré que les CSM sécrètent un fort taux d’IL-6 qui à leur tour permettent la phosphorylation de STAT 3 (un facteur d’activation de la transcription) à travers un effet paracrine (Sasser et al., 2007). La lignée de cellules tumorales mammaires Erα + n’expriment normalement qu’un niveau bas de STAT 3, jusqu’à ce qu’elles soient exposées aux CSM, qui sont donc responsable de leur croissance d’après un processus paracrine.

Table des matières

INTRODUCTION
1e PARTIE : ESSAI BIBLIOGRAPHIQUE : LES ENJEUX ACTUELS DE LA RECHERCHE EN MEDECINE REGENERATIVE SUR LES CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES D’ORIGINE ADIPEUSES
CHAPITRE 1. LES CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES D’ORIGINE ADIPEUSE : INTERETS ET APPLICATIONS EN MEDECINE REGENERATIVE
1.1. Choisir entre éthique et efficacité : des cellules souches embryonnaires ou adultes ?
1.2. Les cellules souches mésenchymateuses et leur implication en médecine régénérative
1.2.1. Qu’est-ce qu’une cellule souche mésenchymateuse ?
1.2.2. Etendue de la recherche sur les csm
1.3. Identification des ASC : une étape indispensable dans le processus de compréhension
1.3.1. De la nécessité d’imposer des définitions claires à la communauté des chercheurs
1.3.2. Les ASC dépassent les critères minimum pour l’identification des MSC
1.3.3. Doit-on caractériser différents types d’ASC ?
CHAPITRE 2. PROBLEMATIQUES DE LA RECHERCHE ACTUELLE
2.1. Mécanisme d’action des ASC
2.1.1. L’activité stromale des CSM dépasse leur potentiel de transdifférentiation
2.1.2. L’activité stromale dans la promotion de l’angiogenèse
2.1.3. Immunomodulation et activité anti-inflammatoire
2.1.4. La fusion hétérotypique permet une reprogrammation
2.2. Biodistribution et traces de rémanence à long terme
2.2.1. Ce que les études s’accordent à dire plus ou moins
2.2.2. Facteurs de variation dans les résultats
a. Le modèle pathologique
b. L’injection locale
2.3. Cancer et CSM : risque de tumorigénicité ou potentiel inhibiteur, une question complexe et controversée
2.3.1. Contradictions : des modèles non standardisés et grande variabilité des facteurs de risque
2.3.2. Le potentiel tumoral est multiple
a. Migration des CSM dans le tissu tumoral : reconnaissance d’un milieu lésionnel
b. L’angiogenèse dans la promotion tumorale
c. Cytokines
d. Immunosuppression
e. Transformation spontanée des CSM en cellules malignes
2.3.3. Inhibition tumorale
2.3.4. Inhibition ou croissance tumorale : une question de dose ?
2.3.5. Thérapies anticancéreuses et CSM
CHAPITRE 3. MATERIEL ET METHODES POUR LE TRACKING in vivo DES ASC EN MEDECINE REGENERATIVE
3.1. Tracking cellulaire : des techniques d’étude complémentaires
3.1.1. De la cytotoxicité de certains marqueurs
3.1.2. Des résultats contradictoires
3.1.3. De nombreuses méthodes de tracking à confronter
3.2. La culture cellulaire pour le développement des meilleurs agents thérapeutiques possible
3.3. Les modèles animaux de la recherche en médecine régénérative : un souci pour l’extrapolation à l’homme ?
3.3.1. Les « chimères » ou modèles de xénotransplantation
3.3.2. Une véritable boite à outils pour la recherche
3.3.3. Des avantages et des inconvénients : l’extrapolation à l’homme est-elle raisonnable ?
a. La question de la taille
b. La niche cellulaire
c. Avantages et inconvénients des modèles animaux en recherche pré-clinique de thérapie cellulaire
2e PARTIE : MISE AU POINT TECHNIQUE DANS L’IDENTIFICATION DES ASC HUMAINES DANS LES TISSUS MURINS
CHAPITRE 1. OBJECTIF DU TRAVAIL
CHAPITRE 2. MATERIELS ET METHODES
2.1. Les prélèvements tissulaires
2.1.1. Isolement de la FSV à partir du tissu adipeux humain
2.1.2. Culture et obtention des ASC
2.1.3. Les animaux
2.1.4. Protocole d’injection des cellules
2.1.5. Prélèvement des tissus murins
2.1.6. Préparation de lames cytologiques
2.1.7. Choix des lames à marquer
a. Lames témoins
b. Echantillons
2.2. Protocole de marquage cellulaire des CSM adipeuses humaine par la technique d’hybridation in situ en fluorescence (HIS)
2.2.1. Choix de la sonde ADN
2.2.2. Protocole de couplage d’une sonde Cot-DNA à la biotine
a. Préparation des échantillons à marquer
b. Dénaturation
c. Hybridation des promoteurs et synthèse des brins d’ADN marqués à la biotine
d. Précipitation des sondes marquées
2.2.3. Protocole d’hybridation in situ adapté aux coupes histologiques
a. Déparaffinage
b. Etapes de prétraitement
c. Dénaturation
d. Hybridation
e. Lavage stringent
f. Révélation
2.3. Protocole de marquage immunohistochimique des ASC humaines sur tissu murin à l’aide des marqueurs Ku80 et hMito
2.3.1. Ku80
2.3.2. hMito
2.4. Lecture et numérisation des lames
2.4.1. Première lecture au microscope
2.4.2. Numérisation
CHAPITRE 3. RESULTATS
3.1. Validation des marqueurs Cot-1 DNA, Ku80 et hMito
3.1.1. Validation de la spécificité du marquage Cot-1 DNA sur la base des contrôles positifs et négatifs sur cytologie et coupes tissulaires en paraffine
3.1.2. Validation de la spécificité des marquages Ku80 et hMito sur la base des contrôles positifs et négatifs en histologie
3.1.3. Localisation sub-cellulaire des marqueurs Ku80, hMito et Cot-1 DNA
3.1.4. Répétabilité des techniques de marquage
3.1.5. Etude des marquages indésirables (bruit de fond, marquage non spécifique, réactivité croisée)
3.2. Application à une étude de biodistribution après injection locale (intramusculaire ou sous-cutanée) ou systémique (IV rétro-orbitaire)
3.2.1. Evaluation de la biodistribution des ASC humaines dans les tissus murins
3.2.2. Evaluation de la morphologie des ASC humaines en fonction de la cinétique
3.2.3. Observation de différentiation vasculaire des ASC
3.2.4. Evaluation de la répartition/diffusion des ASC après administration locale…88 CHAPITRE 4. DISCUSSION
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES

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