Soutenance mémoire
Les cellules de l’épithélium respiratoire
L’appareil respiratoire est recouvert par un épithélium cylindrique pseudo-stratifié. Cet épithélium est principalement constitué de cellules basales, de cellules multiciliées et de cellules sécrétrices de mucus, nonobstant quelques populations cellulaires accessoires (telles que les cellules neuro-endocrines, les cellules immunitaires résidentes, les ionocytes et les cellules tuft).
Les cellules basales
Les cellules basales sont en contact direct avec la lame basale (Figure 1). Leur quantité diminue en descendant le long de l’arbre bronchique et passe de 30% au niveau proximal à environ 6% de la population épithéliale dans les bronchioles (Boers, Ambergen, & Thunnissen, 1998). Ce sont des cellules de petite taille possédant un rapport noyau/cytoplasme très élevé. Ces cellules expriment des marqueurs intracellulaires qui leur sont propres et qui permettent de les identifier facilement. Ces marqueurs sont des cytokératines, comme la cytokeratin-5 (KRT5) ainsi que des facteurs de transcription, comme TP63 (« Tumor Protein P63 »). Les cellules basales ont deux rôles essentiels au sein de l’épithélium. Ces cellules possèdent un rôle structural permettant la cohésion de l’épithélium sur la lame basale. Par ailleurs, ces cellules forment des liaisons avec les cellules voisines à l’aide de desmosomes. Dès lors, les cellules basales assurent le maintien de l’épithélium sur la lame basale (Evans, Cox, Shami, Wilson, & Plopper, 1989). Elles jouent également un rôle de cellules souches ou cellules progénitrices, capables de proliférer mais également de se différencier, notamment lors des mécanismes de réparation suite à une lésion, afin de reformer un épithélium fonctionnel. La capacité à former d’autres types cellulaires différenciés a été mise en évidence grâce à des souris transgéniques exprimant un gène rapporteur sous le contrôle d’un promoteur spécifique de cellules basales. En effet, Hong et collaborateurs ont pu montrer qu’après lésion de l’épithélium in vivo, les cellules multiciliées et sécrétrices de mucus néoformées dérivent toutes deux des cellules basales (Hong, Reynolds, Watkins, Fuchs, & Stripp, 2004).
Les cellules sécrétrices de mucus
Les cellules sécrétrices de mucus sont des cellules cylindriques également appelées cellules en gobelet (« goblet cell » en anglais) (Figure 2). Leur noyau est disposé dans la partie basale de la cellule. A l’inverse, toute la partie apicale est gorgée de vésicules de sécrétion, constituées principalement de glycoprotéines riches en acide sialique, les mucines (composant majeur du mucus) (Rogers, 1994). Ces cellules sont également capables de produire des molécules à forte activité anti-bactérienne (IgA sécrétoires, lactoferrine, lysozyme défensines) (Bals, Weiner, & Wilson, 1999).
Ces cellules sont disséminées au milieu de cellules multiciliées où elles représentent 15% des cellules cylindriques au sein de l’épithélium. Bien que les cellules sécrétrices de mucus soient largement minoritaires au sein de l’épithélium, leur proportion peut augmenter drastiquement en fonction des conditions de stress ou pathologiques (Park et al., 2006) .
Les cellules multiciliées
Les cellules multiciliées (MCC) de l’épithélium respiratoire sont de forme cylindrique ou pyramidale (Breeze & Wheeldon, 1977). Le battement coordonné de centaines de cils vibratiles à leur surface permet d’assurer la fonction de clairance mucociliaire. Chaque cellule multiciliée arbore à son pôle apical 200 à 300 cils motiles (Figure 3) (Rhodin, 1966).
Elles représentent au niveau de la trachée ou des bronches plus de 50% de la population cellulaire pour ne plus représenter que 15% des cellules épithéliales dans les voies respiratoires plus distales (Serafini & Michaelson, 1977). Les cellules multiciliées sont considérées comme différenciées de façon terminale, étant incapables de se diviser à nouveau pour proliférer. Cette règle est susceptible d’être remise en cause par la découverte du mécanisme de transdifférenciation des cellules multiciliées en cellules sécrétrices de mucus (Park et al., 2006). Le noyau est situé à la base de la cellule alors que les mitochondries sont abondamment retrouvées au niveau apical de la cellule, fournissant ainsi de façon efficace l’énergie indispensable au battement ciliaire (Hansell & Moretti, 1969) (Blanquart, Giuliani, Jeulint, Guennou, & Marano, 1995).
La mitochondrie
Généralité et structure
Le terme « mitochondrie » est composé de deux mots, d’étymologie grecque, «mitos» signifiant « filament » et « chondros » signifiant « grain ». Il a été proposé en 1898 par le médecin allemand Carl Benda, pour décrire un organite de type filamenteux. La mitochondrie a été observée pour la première fois dans les années 1850, par le physiologiste Albert Von Kölliker. Entre 1850 et 1880, plusieurs scientifiques ont observé la présence des mitochondries, de manière indépendante, au sein de différents types cellulaires. Les mitochondries ont une structure en forme de bâtonnet ou de sphère de 0,5 à 1 µm de diamètre. Leur nombre est variable selon l’activité métabolique. Leur origine semble établie : elles dériveraient de l’endosymbiose d’une bactérie de la classe des α-protéobactéries (Lazcano & Peretó, 2017). La mitochondrie est présente à des centaines de copies dans tous les types cellulaires, excepté dans les hématies. Son abondance varie en fonction du type cellulaire et des besoins énergétiques de la cellule. Par exemple, dans le foie et dans le muscle cardiaque, les mitochondries représentent respectivement 20% et 40% du volume cytosolique. Les mitochondries sont en mouvement continuel dans la cellule grâce aux interactions avec le cytosquelette. Une mitochondrie est séparée du compartiment cytoplasmique par deux membranes distinctes qui délimitent cinq compartiments distincts : la matrice mitochondriale, l’espace inter-membranaire (EIM) qui sépare la membrane externe (MEM) de la membrane interne mitochondriale (MIM) et les crêtes qui représentent le compartiment généré par l’invagination de la membrane interne (Friedman & Nunnari, 2014) (Figure 4). La matrice mitochondriale d’aspect granuleuse contient des mitoribosomes, de l’ADN circulaire, de l’ARNm et de l’ARNt. Elle est le siège de réactions métaboliques comme le cycle de Krebs qui permet la production de l’ATP cellulaire. Les mitochondries produisent près de 90% de l’énergie de la cellule. L’espace inter membranaire est un espace dense d’une épaisseur de 4 à 7 nm contenant des protons H+ , dont les gradients transmembranaires jouent un rôle déterminant dans la phosphorylation oxydative, et des molécules de cytochrome c (cyt c) (impliqués dans les mécanismes d’apoptose). La membrane externe (MEM) est une bicouche lipidique de 5 à 7 nm d’épaisseur, avec une composition proche de celle de la membrane plasmique. Elle contient 40% à 50% de lipides et 50% à 60% de protéines incluant les porines, protéines membranaires formant des canaux ioniques, qui permettent la libre diffusion de petits métabolites (ions et molécules de masse moléculaire inférieure à 10kDa) (Logan, 2006). La MEM sépare l’EIM du cytoplasme. Au départ considéré comme une simple enceinte de confinement de la mitochondrie, de récentes études lui ont attribué des caractéristiques importantes liées à la physiologie et à la signalisation cellulaire, grâce à son dialogue avec les « mitochondria-associated ERmembranes » (MAMs) (Chami et al., 2008). La membrane interne mitochondriale (MIM) est une bicouche lipidique de 5 à 6 nm avec une organisation très différente de celle de la membrane externe. Elle est composée de 80% de protéines et 20% de lipides. Elle est riche en cardiolipides, en transporteurs et complexes enzymatiques de la chaine respiratoire, responsables de la production d’énergie. Cette membrane a une structure similaire à la membrane plasmique bactérienne. Contrairement à la MEM, elle ne possède pas de porines. La diffusion à travers la MIM ne peut se réaliser que via des transporteurs particuliers appelés translocases. La MIM forme de nombreuses invaginations qui se replient dans des poches appelées crêtes. La conséquence majeure de ces invaginations est l’augmentation de la surface du complexe respiratoire afin d’amplifier de manière considérable, la capacité respiratoire de la mitochondrie et optimiser la production d’ATP (Patten et al., 2014). La taille et la forme des crêtes peuvent changer en fonction du signal intracellulaire. Ainsi, un remodelage des crêtes peut s’opérer suite à l’activation de la mort cellulaire programmée. La forme des crêtes demeure importante dans la formation et la stabilité de la chaine du complexe respiratoire, en une structure quaternaire appelée « super complexe ». L’efficacité et le bon fonctionnement de la respiration mitochondriale, en réponse aux changements du métabolisme ou du stress cellulaire, dépendent directement de la forme des crêtes. De manière intéressante, les protéines qui contrôlent l’architecture des crêtes peuvent être localisées au niveau de la MIM ou des MAMs. Cette coopération inter organelles permettrait de répondre aux changements du métabolisme mais reste encore peu caractérisée. L’interaction des compartiments intra- et inter mitochondriaux demeure indispensable dans la modulation de l’activité mitochondriale.
ADN mitochondrial
Les mitochondries possèdent leur propre information génétique sous forme d’ADN mitochondrial (ADNmt) (Figure 5). Chez l’Homme, le génome mitochondrial est une molécule circulaire double brin de 16569 paires de bases non associé à des histones et ne possédant aucun intron contrairement à l’ADN nucléaire (ADNn). Chaque cellule humaine possède plusieurs centaines à plusieurs milliers de mitochondries. Chaque mitochondrie contenant 2 à 10 copies d’ADNmt, la quantité totale d’ADN mitochondrial peut représenter jusqu’à 1% de la quantité totale d’ADN cellulaire, en dépit de sa faible taille (1/200000ième du génome nucléaire). Les deux brins du génome mitochondrial diffèrent par un brin lourd (H) riche en bases puriques (G et A) et un brin léger (L) riche en bases pyrimidiques (C et T). L’ADN est transcrit sur toute sa longueur à l’exception d’une région appelée boucle D (Displacement) contenant l’origine de réplication du brin lourd ainsi que les promoteurs de transcription des brins lourd et léger, et d’une région plus courte, présentant l’origine de réplication du brin léger. Le brin lourd code 14 ARN de transfert, les 2 ARN ribosomaux et 12 protéines. Le brin léger code 1 protéine et les 8 ARN de transfert restant (Taanman, 1999).
L’ADNmt présente une variabilité de séquence plus importante (environ dix fois) que l’ADN nucléaire. Une telle mutabilité de l’ADNmt s’explique par l’action des radicaux libres oxygénés générés en parallèle de la respiration sur un ADN non protégé par des histones, et par le faible nombre de mécanismes réparateurs efficaces (Martin, 2011). La réplication de l’ADN mitochondrial est dépendante de la seule ADN polymérase présente dans la mitochondrie : la polymérase γ ou polymérase G. La disponibilité et l’équilibre de dNTPs dans la mitochondrie sont les principaux déterminants qui définissent le taux de fidélité de la réplication de l’ADN mitochondrial (Gandhi & Samuels, 2011).
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Table des matières
Introduction
I. Les cellules de l’épithélium respiratoire
a. Les cellules basales
b. Les cellules sécrétrices de mucus
c. Les cellules multiciliées
II. La mitochondrie
a. Généralité et structure
b. ADN mitochondrial
c. ADN mitochondrial et hétéroplasmie
d. Héritage mitochondrial
III. Séquençage et nouvelle technologie
a. Les différents types de séquençage
b. Cellule unique
Objectif
Matériels et méthodes
I. Culture cellulaire
II. Echantillons
a. RNAseq
b. Biopsie (10X Chromium Genomics)
III. Extraction
a. Blood and tissue Kit (Qiagen)
b. Miniprep (Qiagen)
IV. PCR (Polymerase Chain Reaction)
a. Short-PCR
b. Long-PCR
c. qPCR (quantitative PCR)
V. Purification des acides nucléiques
VI. Digestion enzymatique
VII. Sonication
VIII. Contrôles
a. Nanodrop
b. Bioanalyzer
IX. C1 Fluidigm
X. Chromium 10X Genomics
XI. Séquençage
a. RNA-seq
b. DNA-seq
XII. Bioinformatique
Résultats
I. Mise en place du séquençage d’ADNmt
II. Comparaison des données de séquençage d’ADNmt
III. Mise en place du séquençage d’ADNmt en cellule unique
IV. Analyse mitochondriale des données RNAseq et 10X Genomics
a. Détermination de l’haplogroupe mitochondrial
b. Recherche de contamination
c. Analyse de l’hétérogénéité
Conclusion – Discussion
Perspectives
Bibliographies
Annexes
