Soutenance mémoire
Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études
La famille des canaux ioniques
Ces définitions de base en électrophysiologie étant posées, les paragraphes suivants auront pour objectif de ne donner qu’une vision globale de cette grande famille que sont les canaux ioniques. Cette vision est nécessaire pour bien comprendre leurs interactions dans le contrôle de l’activité électrique cellulaire. Seul le chapitre sur les canaux potassiques rectifiants entrants sera plus étoffé, puisque les canaux KATP appartiennent à cette sous-famille.
Les canaux activés par le potentiel
Comme leur nom l’indique, ces canaux sont activés lors d’un changement du potentiel de membrane. La sonde moléculaire (voltage sensor) des canaux sensibles au voltage est l’hélice transmembranaire S4 qui comprend de nombreux résidus basiques (Arg, Lys) ayant des chaînes latérales chargées positivement et répartis sur toute la longueur d’une face de hélicel’. L’hyperpolarisation ou la dépolarisation provoque une modification du champ électrique transmembranaire modifiant la position de l’hélice S4 respectivement vers l’intérieur ou l’extérieur de la cellule (Figure 2).
Les canaux K+
Les canaux potassiques ont été trouvés dans quasiment toutes les cellules. Les polypeptides formant ces canaux sont bien plus petits que ceux des canaux calciques ou sodiques. Ils forment des complexes homo- ou hétéromultimériques de taille et de structure très proches des autres canaux. Grâce à la multiplicité des gènes codant pour ces canaux potassiques voltage-dépendants, aux épissages alternatifs de certains de ces gènes, à la possibilité de créer différentes associations dans le complexe multimérique, aux modulations par des modifications post-traductionnelles (glycosylation, phosphorylation), à l’existence de sous-unités modulatrices, à la modulation des propriétés biophysiques et pharmacologiques par l’environnement lipidique, il existe une grande variété de canaux voltage-dépendants (Figure 4).
Les canaux Kv
Le premier canal potassique voltage-dépendant fut découvert chez drosophila melanogaster lors du comptage et de la détermination du genre sexuel de ces mouches du vinaigre. En effet, en anesthésiant ces insectes avec de l’éther, ceux-ci se mettaient à trembler à cause de l’activité du canal potassique voltage-dépendant nommé « Shaker » (Papazian et al., 1987). Depuis, d’autres canaux potassiques voltage-dépendants ont été découverts en utilisant des sondes issues du gène shaker. Il s’agit des canaux Shab, Shaw et Shal, très homologues en séquence, mais ayant des cinétiques d’activation et d’inhibition très différentes. De us,pl de nombreuses isoformes de chacun de ces canaux ont également été découvertes, et répertoriées selon la nomenclature suivante :
Kv1.1-Kv1.8 : Canaux homologues au Shaker : activés par dépolarisation, mais inactivation rapide (type A).
Kv2.1-Kv2.2 : Canaux homologues à Shab : cinétique d’inactivation intermédiaire .
Kv3.1-Kv3.4 : Canaux homologues à Shaw : pas d’activation observée (type retardé)
Kv4.1-Kv4.3 : Canaux homologues à Shal : cinétique d’inactivation intermédiaire Leur structure et leurs fonctions sont très homologues aux canaux sodiques
sensibles au potentiel. Comme eux, les canaux Kv sont constitués d’une sous-unité , mais correspondant à un seul domaine transmembranaire de canaux Na+. Dansl’un et l’autres cas, l’hélice S4 est richement chargée en résidus basiques. Comme eux, certains canaux Kv sont associés à une petite sous -unité.
Les différences se situent dans (i) la possibilité de former des complexes hétéromultimériques, (ii) la présence d’une petite hélice H5 qui forme le filtre de sélectivité aux ions potassiques, et (iii) la présence en Nter d’un domaine cytoplasmique T (tétramérisation) qui est impliqué à la fois dans l’oligomérisation et l’interaction avec la sous-unité.
Leur mécanisme d’activation est identique à celui des canaux sodiques voltage-dépendants. Le mouvement de l’hélice S4 en fonction du potentiel provoque un changement conformationnel qui active ou inhibe le canal. Cependant, les canaux Kv ont deux mécanismes d’inactivation, un rapide et un lent .
Le type N correspond, pour les canaux de type Shaker, à une inactivation rapide des canaux Kv par occlusion de la voie d’entrée interne du pore à l’aide d’une « boule » de résidus chargés positivement en Nter (type N).
L’inactivation de type C (Cter) est moins bien comprise. Elle ferait intervenir des éléments présents sur la face externe du canal. Il s’agirait d’un changement conformationnel du canal qui réduirait la taille de l’entrée externe (Liu et al., 1996) .
L’activité de certains canaux Kv est modulée par phosphorylation . C’est le cas de Kv3.4 dont la phosphorylation de la « boule » Nter par la Protéine Kinase C (PKC) empêche l’inactivation de type N.
La maladie connue pour être liée à ces canaux est une maladie neurologique affectant le système nerveux central et périp hérique, l’ataxie (mauvaise coordination des mouvements) épisodique de type 1.
Les canaux KCNQ
Cinq membres composent cette famille dont le plus connu est KCNQ1 (KvLQT1) qui est impliqué dans le syndrome de QT long (LQT1).
KCNQ1 est la sous-unité majeure des canaux IKS cardiaques qui interviennent dans la repolarisation du potentiel d’action ventriculaire. KCNQ1, exprimé de façon hétérologue, génère un courant potassique sortant voltage -dépendant qui ne retrouve ses propriétés natives qu’en présence d’un etitp peptide de 130 résidus, MinK (ISK). Ce petit peptide jouant le rôle de sous-unité n’a qu’une seule hélice transmembranaire. Ces canaux sont principalement exprimés dans le cœur et à un taux plus faible dans le pancréas, les reins, les poumons, le placenta et les oreilles.
KCNQ2 et KCNQ3 sont largement présents dans différentes parties du cerveau. Leur structure est identiques à celle des canaux Kv. Leur canalopathie se situe principalement au niveau du syndrome de QT long, ainsi que dans la surdité et l’épilepsie néonatale familiale bénigne .
Les canaux K+ de type Eag (HERG)
Eag signifie « Ether à go-go » en rapport aux go-go dancings des années 60. En effet, lorsqu’il a été découvert que certaines drosophiles mutantes endormies à l’éther remuaient leurspattes dans tous les sens, les chercheurs ont donné ce nom de eag aux canaux K+ responsables de cette frénésie. Depuis, 2 autres gènes ont été clonés : erg et elk. Les canaux humains HERG (Human Eag Related Genes) n’ont que 49% d’identité de séquence aveces canaux et appartiennent donc très certainement à une autre famille de gènes proches de eag. Les canaux HERG sont fortement exprimés dans le cœur, suggérant une implication dans la repolarisation du potentiel d’action cardiaque. Cette hypothèse a été confirmée par l’implication de mutants de HERG dans le syndrome de QT long (LQT2). Leur structure est identique à celle des canaux Kv avec l’hélice S4 comme voltage-sensor (Figure 5).
Les seules différences sont, premièrement la séquence signature des canaux potassiques qui est GFG et non GYG, et deuxièmement la présen ce dans la partie proximale du Cter d’un domaine homologue au domaine de fixation des nucléotides cycliques. Cependant ceux-ci n’ont pas d’effet sur les courants HERG exprimés dans les ovocytes de Xénope . Ces courants sont sortants et observables après dépolarisation de potentiels supérieurs à –50mV. L’amplitude du courant varie en fonction du potentiel de membrane, l’amplitude maximale étant atteinte à 0mV. Les canaux HERG constituent une partie des canaux IKR cardiaques (courant rectifiant retardé) (Sanguinetti et al., 1995).
En plus de l’implication de HERG dans la forme la moins courante du syndrome de QT long (LQT2), le gène eag est impliqué dans la suppression de l’excitabilité neuronale. Transposées chez l’homme (HERG), ces mutations provoquent une hyperactivité ou une paralysie en fonction de la température. Une autre maladie liée à ces canaux, la « torsade de pointes » correspond à une arythmie cardiaque qui peut être fatale (forme de fibrillation ventriculaire).
Les canaux Ca2+
Ils jouent des rôles cruciaux dans la régulation de nombreuses fonctions cellulaires : initiation de la contraction musculaire, déclenchement du relargage de neurotransmetteurs du système nerveux central et d’hormones de cellules sécrétrices, régulation de l’expression de certains gènes et du cycle cellulaire, et intervention dans la mort cellulaire.
La concentration cytosolique de calcium est très faible comparée aux concentrations externes (Tableau 1), et peut être ainsi modifiée rapide ment par tous les mouvements transmembranaires de calcium. La régulation des quantités de calcium intracellulaire est due, entre autres, aux canaux voltage-dépendants, mais également aux canaux calciques « ligand-gated » et aux canaux endocellulaires contrôlant la sortie du calcium des stocks très importants du réticulum endo – ou sarcoplasmique.
Il existe de nombreux types de canaux calciques voltage-dépendants. Ils sont classés sous les abréviations T, L, N, P, Q et R en fonction de leur sensibilité aux bloqueurs pharmacologiques, de leur conductance unitaire, de leur cinétique et de leur dépendance au voltage (Ashcroft, 2000).
Deux grands groupes de canaux se dégagent suivant leur dépendance au seuil de dépolarisation membranaire nécessaire à leur activation .
· Les canaux bas seuil (LVA : Low Voltage Activated) contenant les canaux de type T (Transient) qui s’activent à des potentiels relativement négatifs (-50, -30mV) et s’inactivent très rapidement. Ils sont impliqués dans la genèse d’activités électriques spontanées et répétitives.
· Les canaux à haut seuil (HVA : High Voltage Activated) dont les autres canaux calciques voltage-dépendants font partie (L, N, P, Q, R). Ils nécessitent une plus forte dépolarisation pour être activés.
Les différents sous-types des canaux HVA sont ensuite séparés selon leur profil pharmacologique (Ashcroft, 2000 ; Dubois, 1999) :
· Les canaux de type L (Long Lasting) sont bloqués par les dihydropyridines. Ils s’inactivent très lentement et sont généralement plus perméables au strontium et baryum qu’au calcium. Ce courant lent, originellement décrit dans les muscles, joue un rôle majeur dans le couplage excitation-contraction ou excitation-sécrétion.
· Les canaux de type N (Non T, Non L, Neuronal) sont pour leur part bloqués par deux toxines du coquillage Conus geographus :-conotoxine GIVA et-conotoxine MVIIA
· Les canaux de type P (présents dans les cellules de Purkinje) sont bloqués par la toxine-agatoxine IVA d’Agelenopsis aperta.
· Les canaux de type Q (juste après P) sont également b loqués par la toxine -agatoxine IVA mais avec une affinité moindre.
· Les canaux de type R (juste après Q) ont été trouvés par clonage et non selon leur profil pharmacologique.
Leur régulation est très complexe et due à un grand nombre de modulateurs cytosoliques dont les plus importants sont les protéines fixant le GTP (protéines G) et les protéines kinases. Leur structure est très complexe puisqu’elle comprend 5 sous-unités1,2,, et d en stœchiométrie 1:1:1:1:1. Cependant, la sous -unité1 a une structure homologue à celle des canaux sodiques avec 4 domaines (I-IV), comprenant chacun intracellulaire (), soit sur la face externe (2), chacune ayant des poids moléculaires bien distincts : 190kDa (1), 160 kDa (2,), 52 kDa () et 32 kDa ().2 et sont issues de la protéolyse d’une pro-protéine issue du même gène. Ces sous -unités ont des rôles auxiliaires tels que l’augmentation de l’amplitude du courant, des effets sur les propriétés cinétiques et dans quelques cas, elles confèrent la sensibilité à des molécules régulatrices.
Sept gènes différents codent pour les sous -unités1.1G se retrouve dans les canaux de type T ;1S,1C,1D dans les canaux de type L ;1D dans les canaux de type N ;1A dans les canaux de type P et Q ; et1E probablement dans les canaux de type R.
A la vue de ce complexe multimérique, il n’est pas surprenant de constater que les interactions protéine-protéine dans ce canal sont très importantes. La plus importante est l’interaction entre les sous-unités (six différents sous-types) et les 4 sous-types de sous-unités actuellement clonées. Ces interactions augmentent de façon non négligeable l’amplitude du courant et/ou ses cinétiques. Les études de Pragnell et al., 1994, ont montré que la sous-unité se fixait dans la région cytoplasmique entre I et II et c’est dans cette même région qu’interagissent les sous-unités1 avec les protéines G (De Waard et al., 1997).
Sur le plan pharmacologique, il existe 3 bloqueurs principaux : les phénylalkylamines, les benz(othi)azipines et les dihydropyridines. Ces composés sont connus pour se fixer sur 3 sites distincts de la sous-unités1 et sont liés de façon allostérique. La localisation de ces sites par mutagenèse dirigée a permis de définir les régions TM5 et TM6 de II et TM6 de IV.
Les pathologies liées aux mutations des canaux calciques voltage-dépendants, sont très nombreuses, telles que la dysgenèse m usculaire chez la souris, la paralysie périodique hypokalémique, l’hyperthermie maligne, l’ataxie épisodique de type 2, la migraine hémiplégique familiale, l’ataxie spinocérébrale de type 6 et bien d’autres encore, justifiant les nombreuses recherches sur ces canaux.
Les canaux Cl –
Les canaux chlorure sont importants pour le contrôle de l’excitabilité membranaire, le transport transépithélial et la régulation du volume cellulaire et du pH intracellulaire. On les retrouve également au niveau des membranes des organelles dans lesquelles les canaux chlorure voltage-dépendants sont importants pour créer une voie électrique dérivée (shunt) qui facilite l’acidification intra-organelle.
Depuis le clonage du premier canal chlorure voltage-dépendant CLC-0 de la torpille électrique Torpedo mamorata en 1990 (Jentsch et al., 1990), 9 canaux Cl- de mammifères ont été clonés : de CLC -1 à CLC-7, CLC-Ka et CLC-Kb. Ils sont regroupés en 3 sous-groupes principaux : (i) CLC-1, CLC-2 et les CLC-K ; (ii) CLC-3 à CLC-5 ; et (iii) CLC-6 et CLC-7.
CLC-1 est localisé principalement dans les muscles squelettiques des mammifères où ils jouent un rôle important dans l’excitabilité musculaire. CLC-2, CLC-6 et CLC-7 sont exprimés de façon ubiquitaire, tandis que CLC-3 et CLC-4 ont une distribution tissulaire très large, et plus précisément dans le cerveau, le cœur, les poumons et le rein pour CLC-3, et dans les muscles squelettiques, le cerveau et le cœur pour CLC -4. CLC-5 et les CLC-K sont majoritaires dans le rein où ils sont impliqués dans le transport transépithélial des ions chlorure. A noter que CLC -2 est activé par le gonflement du volume cellulaire (cell swelling).
Leur poids moléculaire varie entre 75 et 130 kDa (650 à 1000 résidus). Leur profil d’hydrophobicité a permis de prédire une structure à 13 hélices (Figure 7). Les hélices de 1 à 3, de 5 à 8 et de 9 à 12 sont transmembranaires (la zone 9 à 12 n’est pas très bien définie dans le nombre et la positio n des hélices). L’hélice 4 est extracellulaire et l’hélice 13 est cytosolique .
S123 est extrêmement conservée entre tous les CLC, sa mutatio n réduit la sélectivité ionique et la conductance unitaire, tout comme K519. Ces canaux se dimériseraient et formeraient deux pores distincts.
Cette structure est réellement très différente des structures des autres canaux ioniques voltage-dépendants.
Les différentes maladies liées à un dysfonctionnement des canaux CLC sont : la myotonie congénitale et généralisée ; la néphrolithiase et le syndrome de Batter de type III.
Les canaux activés par les ions
KCa
Les canaux KCa sont des canaux potassiques activés par une augmentation du calcium intracellulaire. Ils sont présents dans la plupart des cellules nerveuses où ils jouent un rôle majeur dans le contrôle des potentiels d’action et dans la régulation de l’excitabilité cellulaire .
Suivant leurs propriétés éle ctrophysiologiques, les canaux KCa sont classés en 3 groupes :
(i) les maxi KCa (ou BK) ont une conductance unitaire de 100 à 250 pS dans des conditions symétriques de K+ (100 mM). Ils sont activés à la fois par dépolarisation et par des concentrations µM de c alcium intracellulaire.
(ii) Les canaux KCa de petite conductance (SK) ont des valeurs unitaires comprises entre 5 et 20 pS.
(iii) Les canaux intermédiaires (IK) ont des conductances de l’ordre de 20 à 80 pS . SK et IK ne sont pas sensibles aux changements de potentiel, mais sont activés par le calcium intracellulaire à des concentrations inférieures au mM.
Les canaux BK sont bloqués par le tétraéthylammonium (TEA +) et la charybdotoxine (CTX), mais sont insensibles à l’apamine, tandis que les canaux SK sont insensibles au TEA+, mais sont majoritairement bloqués par l’apamine. La pharmacologie des canaux IK est plus proche de celle des canaux BK, car ils sont bloqués par la CTX et le clotrimazole, mais sont insensibles à l’apamine.
Dans le cas des canaux SK et IK, l’activation perdure tant que la concentration en calcium intracellulaire est suffisante.
La composition et la structure des canaux sont différentes suivant leur type (Figure 8). Ainsi les canaux BK sont composés de 2 sous-unités, et. La sous-unité est constituée de 11 hélices, 7 transmembranaires (S0-S6) et 4 cytoplasmiques. La région S1-S6 ressemble beaucoup à la structure des canaux Kv avec l’hélice S4 richement dotée de résidus basiques comme voltage-sensor. Le filtre de sélectivité est également présent dans l’hélice H5, entre S5 et S6. La sous-unité possède 2 hélices transmembranaires et augmente la sensibilité des canaux BK à la CTX.
|
Table des matières
NDEX DES ILLUSTRATIONS ET TABLEAUX
SIGLES ET ABRÉVIATIONS
1. INTRODUCTION
2. LES CANAUX IONIQUES
2.1. Introduction
2.2. Lois et définitions en électrophysiologie
2.3. La famille des canaux ioniques
2.3.1. Les canaux activés par le potentiel
2.3.1.1. Les canaux Na+
2.3.1.2. Les canaux K+
2.3.1.2.1. Les canaux Kv
2.3.1.2.2. Les canaux KCNQ
2.3.1.2.3. Les canaux K+ de type Eag (HERG)
2.3.1.3. Les canaux Ca2+
2.3.1.4. Les canaux Cl –
2.3.2. Les canaux activés par les ions
2.3.2.1. KCa
2.3.2.2. KNa
2.3.2.3. KATP
2.3.3. Les canaux directement activés par des récepteurs
2.3.4. Les canaux modulés par les nucléotides cycliques
2.3.5. Les canaux mécanosensibles
2.3.6. Les canaux induits par les cytolysines
2.3.7. Les canaux endocellulaires
2.3.7.1. Le récepteur à la ryanodine
2.3.7.2. Le récepteur de l’inositol 5’-triphosphate
2.3.8. Les canaux potassiques rectifiants entrants
2.3.8.1. Structure des canaux Kir
2.3.8.2. Les différentes sous-familles de canaux Kir
2.3.8.2.1. Kir1.x
2.3.8.2.2. Kir2.x
2.3.8.2.3. Kir3.x
2.3.8.2.4. Kir4.x et Kir5.x
2.3.8.2.5. Kir6.x
2.3.8.2.6. Kir7.1
2.3.8.3. Modulation
2.4. Pharmacologie des canaux K+
3. LES TRANSPORTEURS ABC
3.1. MRP/CFTR
3.1.1. MRP1
3.1.2. MRP2
3.1.3. MRP3, MRP4, MRP5 et MRP6
3.1.4. CFTR
3.1.5. SUR
3.2. MDR/TAP
3.2.1. P-gp
3.2.2. MDR3 et BSEP
3.2.3. TAP1 et TAP2
3.2.4. ABC7
3.3. ALD
3.3.1. ALD
3.3.2. PMP70
3.3.3. PMP69
3.4. ABC1
3.4.1. ABC1
3.4.2. ABC2
3.4.3. ABC3
3.4.4. ABCR
3.5. White
3.5.1. ABCG1 (White/ABC8)
3.5.2. ABCG2 (MXR1/BCRP/ABCP)
3.6. GCN20
3.7. OABP
3.8. Les transporteurs ABC d’autres organismes
3.9. Structure des transporteurs ABC
3.9.1. Structure des NBD
3.9.2. Structure complète d’un transporteur ABC
4. LES CANAUX KATP
4.1. Historique
4.2. Localisation tissulaire des canaux KATP
4.3. Rôles physiologiques
4.4. Canalopathie
4.5. Propriétés électrophysiologiques
4.6. Régulation
4.6.1. Régulateurs physiologiques
4.6.2. Pharmacologie des canaux KATP
4.7. Kir6.x
4.7.1. Kir6.1
4.7.2. Kir6.2
4.7.2.1. Taille, séquence et structure
4.7.2.2. Régulation
4.8. SUR
4.8.1. Taille, gènes, sites consensus
4.8.1.1. SUR1
4.8.1.2. SUR2A
4.8.1.3. SUR2B
4.9. Le complexe octamérique
4.9.1. Kir6.2 + SUR1
4.9.2. Kir6.2 + SUR2A
4.9.3. KIR6.2 + SUR2B
4.9.4. Kir6.1 + SUR1
4.9.5. Kir6.1 + SUR2B
4.10. Régulation du canal par la sous-unité SUR
4.10.1. Les ligands endogènes
4.10.1.1. MgADP
4.10.1.2. MgATP
4.10.1.3. PIP2 et PIP
4.10.1.4. Les neurohormones
4.10.1.5. Les protéines G
4.10.1.6. L’endosulfine
4.10.2. Les effecteurs synthétiques
4.10.2.1. Les sulfonylurées et les bloqueurs
Localisation du site d’action des bloqueurs
4.10.2.2. Les ouvreurs potassiques
Mécanisme d’action des ouvreurs (sujet de cette thèse)
5. Matériel et Méthodes
5.1. Biologie moléculaire
5.1.1. Matériel biologiques
5.1.1.1. Clones disponibles
5.1.1.2. Bactérie compétente
5.1.1.3. Xénopus laevis
5.1.2. Méthodes de biologie moléculaire
5.1.2.1. Construction des protéines chimériques
5.1.2.2. Mutagenèse dirigée par PCR
5.1.2.3. Transformation des bactéries compétentes
5.1.2.4. Miniprep d’ADN
5.1.2.5. MidiPrep d’ADN
5.1.2.6. Séquençage
5.1.2.7. Transcription
5.2. Expression hétérologue du canal KATP
5.3. Caractérisation fonctionnelle
5.3.1. Principe de la technique du Patch-Clamp
5.3.2. Les configurations du patch clamp
5.3.3. Instrumentation et poste opératoire (Figure 33)
5.3.4. Conditions expérimentales
6. RÉSULTATS ET INTERPRÉTATIONS
6.1. Interactions nucléotides-ouvreurs potassiques
6.1.1. Principe
6.1.2. Méthodes
6.1.3. Résultats et interprétations
6.1.3.1. Le diazoxide a également un effet sur SUR2A
6.1.3.2. L’activité ATPase du récepteur des sulfonylurées
6.1.3.3. Interactions différentes entre les ouvreurs et les NBD
6.2. Localisation du site de fixation des ouvreurs
6.2.1. Principe
6.2.2. Méthodes
6.2.3. Résultats et interprétations
7. DISCUSSION
7.1. Le site de liaison des ouvreurs
7.1.1. Les différentes hypothèses
7.1.2. PIP2
7.1.2.1. Run down et flippase
7.1.3. Proposition de poursuite du projet
7.2. Interaction NBD-ouvreurs
7.3. Modèle à activation constante
8. CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
Télécharger le rapport complet
