Soutenance mémoire
Les canaux calciques
Généralités sur les canaux
Les canaux sont des protéines enchâssées dans la membrane permettant le passage d’ions à travers cette membrane suivant le gradient électrochimique. Le passage de ces ions peut s’effectuer de l’extérieur de la cellule vers l’intérieur de la cellule et inversement. Les canaux sont caractérisés par leur sélectivité ionique. Cette sélection s’effectue par le biais de contacts étroits entre le pore et les ions. Le pore doit permettre le passage spécifique d’ions selon leur taille et leur charge. De plus, ces ions ne doivent pas lier de molécules d’eau. Leur déshydratation est importante pour le passage à travers le pore. Les canaux constituent des portes à travers la membrane. Ils doivent permettre un contrôle des flux ioniques. Les canaux oscillent entre l’état ouvert et fermé. L’ouverture nécessite un stimulus. Le canal peut s’ouvrir :
– suite à la modification du potentiel de repos de la membrane,
– suite à la liaison d’un ligand,
– suite à une stimulation mécanique,
Diversité des canaux calciques
La signalisation calcique s’effectue via des augmentations de concentration et nécessite le transfert du calcium des espaces intra et extracellulaires de stockage vers le cytoplasme, par l’intermédiaire de canaux calciques. Il existe différents types de canaux qui se différencient par leur stimulus d’activation et leur localisation cellulaire .
Les canaux calciques activés par le voltage (Voltage Operated Calcium Channels)
Il s’agit de protéines transmembranaires qui laissent entrer le calcium dans la cellule en réponse à une dépolarisation de la membrane. Dans la majorité des cellules, le potentiel de repos de la membrane est déterminé par l’équilibre des ions K+ . Ainsi une augmentation de la concentration extracellulaire des ions K+ et le déplacement du potentiel qui suit peuvent être utilisé pour activer les canaux calciques dépendant du voltage. Pour les canaux calciques sensibles à la dépolarisation, le passage du potentiel de repos à un potentiel plus positif permet l’ouverture transitoire du canal et l’entrée de calcium dans la cellule, le canal est alors activé. Le canal passe progressivement dans un état inactivé où l’entrée de calcium est bloquée par un changement de conformation de la protéine. Le canal est dans un état réfractaire et ne peut plus être activé .
Structure moléculaire et classification
Les VOCCs sont des protéines hétéro-oligomériques. Ils possèdent une structure commune la sous-unité α1 qui forme le pore du canal. Cette protéine contient le filtre sélectif ionique, le senseur du voltage et les sites de fixation des drogues. Elle est constituée de quatre domaines homologues (I-IV). Chaque domaine comprend six domaines transmembranaires (S1-S6) séparés par des boucles intra et extracellulaires. Les S5, S6 ainsi que les boucles liants les domaines 5 et 6 de chaque motif constituent le pore (McClesky, 1994). Les hélices IIIS5, IIIS6 et IVS6 forment le domaine de liaison des dihydropyridines (DHP) pour les canaux de type L.
Après le clonage de son ADNc, la séquence primaire de la sous-unité α1 a montré des homologies avec la sous-unité qui forme le pore des canaux sodiques dépendants du voltage. En effet, la sous-unité α1 comprend le senseur du voltage et constitue le pore permettant le passage du calcium vers l’intérieur de la cellule.
Dix gènes homologues ont été clonés pour la sous-unité α1 et classés en fonction de leur degré d’homologie pour les régions putatives transmembranaires et du pore (Figure 4). Les séquences en acides aminés de ces sous-unités α1 présentent 80 % d’homologie au sein d’une même famille, mais moins de 40 % d’homologie entre les différentes familles (Ertel et al., 2000). Un grand nombre de variants d’épissages ont été décrits pour ces sous-unités α1 (Bourinet et al., 1999). La diversité de cette molécule explique les différents courants calciques observés.
Il existe deux classes de canaux calciques activés par le voltage. La classification de ces canaux a tous d’abord été fondée sur des critères électrophysiologiques (Tsien et al., 1991) puis des critères pharmacologiques se sont rajoutés avec la découverte de toxines spécifiques. Sur l’ensemble de ces critères, six classes de canaux ont été clairement identifiés et regroupés en deux grandes familles en fonction du seuil d’activation (Nargeot and Charnet, 1994).
Les 7 sous-unités α1S,C,D,F,A,B,E ont été regroupées dans la famille des canaux HVA pour « High Voltage Activated »
Ces canaux sont activés par de fortes dépolarisations. Ils nécessitent une dépolarisation de la membrane supérieur à –30 mV pour être activé. Ils ont une conductance élémentaire entre 11 et 25 pS. Une perméabilité aux ions baryum supérieur aux ions calcium. Ils sont séparés en plusieurs familles :
– L pour « Long Lasting » : la caractéristique principale de ces canaux est leur sensibilité aux dihydropyridines qui sont des antagonistes des canaux calciques. Ces canaux sont impliqués, entre autre, dans le couplage excitation-contraction des muscles squelettiques, lisses et cardiaques où ils permettent la libération de calcium du réticulum sarcoplasmique via les récepteurs de la ryanodine.
– N pour « Neuronal » : ces canaux présentent une inactivation importante et s’activent pour de fortes dépolarisations. Au niveau pharmacologique, ces canaux N sont bloqués par l’application de ω-conotoxine GVIA spécifiquement. Ces canaux sont essentiellement neuronaux et se localisent au niveau synaptique où ils sont impliqués dans la libération des neurotransmetteurs.
– P/Q : Les canaux P sont exprimés, en majorité, dans les cellules de Purkinje du cervelet alors que les canaux Q ont été localisés dans les cellules granulaires du cervelet. La distinction fonctionnelle entre ces deux types de canaux n’est pas claire. Ils appartiennent donc à une famille unique appelé P/Q. Ils sont codés par la même sous-unité α1A qui est la sous unité majoritaire dans le cerveau. La souris KO pour la sous-unité α1A présente une ataxie progressive et une transmission synaptique altérée. L’étude du phénotype associé à l’absence de sous-unité α1A est compliquée car les autres canaux calciques sont surexprimés chez cette souris (Toru et al., 2000).
– R : ce sont les canaux les moins caractérisés parmi les canaux HVA. Ces courants ont été enregistrés dans les neurones granulaires du cervelet chez le rat. Ils sont classifiés comme haut seuil alors que leur cinétique diffère des autres HVA et se rapproche des LVA. La sousunité α1E a été identifiée pour induire les courants R (Piedras-Renteria and Tsien, 1998). Une toxine issue de la tarentule, la SNX-482 bloque sélectivement ces courants (Newcomb et al., 1998).
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Table des matières
INTRODUCTION
Préambule
Chapitre 1 : Les canaux calciques
1. Généralités sur les canaux
2. Diversité des canaux calciques
2.1. Les canaux calciques activés par le voltage (Voltage Operated Calcium Channels)
2.1.1. Introduction
2.1.2. Structure moléculaire et classification
2.1.2.1. Les 7 sous-unités α1S,C,D,F,A,B,E ont été regroupées dans la famille des canaux HVA pour « High Voltage Activated »
2.1.2.2. Les 3 sous-unités α1G, H, I appartiennent à la famille des canaux LVA pour « Low Voltage Activated »
2.1.3. Régulation des canaux T
2.1.3.1. La facilitation
2.1.3.2. Effets des hormones
2.1.3.3. Effet des modifications covalentes
2.1.3.4. Dans les cellules spermatogéniques
2.2. Les canaux récepteurs activés par la liaison d’un agoniste (Receptor Activated Channels)
2.3. Les canaux sensibles au relâchement de calcium des stocks intracellulaires (Store-Operated Channel)
2.3.1. Les canaux TRPCs
2.3.2. TRPC2
2.3.3. Les différents partenaires connus des TRPCs
2.3.3.1. Le récepteur à l’IP3
2.3.3.2. Homer
2.3.3.3. La junctate
2.3.2.4. L’enkurin
2.4. Les canaux des stocks calciques
2.4.1. Le Récepteur à l’Inositol Triphosphate
2.4.1.1. Régulation par le calcium
2.4.1.2. Régulation par des phosphorylations
2.4.1.3. Régulation par les nucléotides
2.4.1.4. Régulation par des interactions protéines-protéines
2.4.2. Le Récepteur de la Ryanodine (RyR)
3. Les protéines de liaison du calcium
4. Les chélateurs de calcium
5. Maintien de l’homéostasie calcique
5.1. Les pompes calciques
5.2. Rôle des mitochondries
6. Méthodes d’études des canaux
6.1 Electrophysiologie
6.2. Imagerie
6.3. La technique du « planar bilayer » ou des membranes artificielles
6.4. La biochimie et la biologie moléculaire
Chapitre 2. Signalisation calcique dans le spermatozoïde de Mammifère
1. Le spermatozoïde et la réaction acrosomique : contexte physiologique
1.1. Le spermatozoïde
1.1.1 Morphologie
1.1.2 Maturation
1.1.2.1. La capacitation
1.1.2.2. L’hyperactivation
1.2. La réaction acrosomique
1.2.1. La zone pellucide
1.2.2. Mécanisme de la réaction acrosomique
2. La réaction acrosomique : une signalisation calcique particulière
2.1. Les canaux calciques dépendants du voltage de type T
2.1.1. Méthodologie
2.1.2. Historique concernant la mise en évidence d’un canal dépendant du voltage dans la RA
2.2. Le récepteur à l’IP3
2.2.1. Dans les cellules spermatogéniques
2.2.2. Dans le spermatozoïde mature
2.3. Les canaux TRPCs
2.3.1. TRPC2
2.3.2. Les autres TRPCs
PROBLEMATIQUE
RESULTATS
Article 1 : Interaction fonctionnelle entre les canaux LVA des cellules spermatogéniques et les canaux calciques modulés par la Thapsigargine
Introduction
Conclusion
Article 2 : Caractérisation biophysique et pharmacologique des courants calciques de type T dans les souris KO pour le canal calcique Cav3.1 (α1G) : Cav3.2 (α1H) est le canal calcique principal dans les cellules spermatogéniques sauvages
Introduction
Conclusion
Article en préparation : Les canaux calciques LVA du spermatozoïde : étude chez les souris déficientes en α1H
Introduction
Résultats
Conclusion
Article 3 : La junctate, une protéine associée à l’IP3R, est présente dans les spermatozoïdes de souris et interagit avec les canaux TRPC2 et TRPC5 mais pas avec TRPC1
Introduction
Conclusion
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
