Soutenance mémoire
Les BioMEMS : Solution idoine à la problématique de biodéfense
Introduction aux biocapteurs
Définition
En se basant sur la définition donnée par l’Union Internationale de Chimie Pure et Appliquée (IUPAC, 1999) et sur celles rencontrées dans la littérature [19] [20], on peut définir l’objet de notre étude comme suit : un biocapteur est un dispositif intégré et autonome, capable de fournir une information analytique quantitative ou semi-quantitative, sélective, en combinant un élément de détection biologique et un transducteur physico-chimique. Le transducteur assure la transformation de la reconnaissance biologique en un signal physiquement mesurable . A partir de cette définition, on peut mettre en exergue les caractéristiques clés des biocapteurs que sont la sensibilité et la sélectivité. La sensibilité est liée aux caractéristiques du transducteur capable de transformer chaque événement de reconnaissance biologique en un signal biologique de plus ou moins grande intensité. La sélectivité quant à elle, comme évoqué plus haut, est liée à la capacité de la couche biologique sensible à reconnaitre uniquement l’élément ciblé (analyte) au sein d’un environnement biologique dense et varié.
Les promesses des biocapteurs en termes de sensibilité, sélectivité mais également de temps de réponse (dont l’horizon est représenté par les mesures en temps réel), de faible coût de fabrication et les grandes potentialités de miniaturisation ont enthousiasmé le monde scientifique. Chaque année et cela depuis les premières apparitions du terme [21], les publications et brevets traitant de biocapteurs sont plus nombreux.
La couche biologique sensible consiste en un arrangement spatial de biorécepteurs réalisant l’accroche de l’élément biologique ciblé à la surface du capteur. Afin d’assurer la meilleure spécificité du biocapteur, cette couche biologique permet l’accrochage préférentiel de l’élément ciblé au sein du milieu réactionnel mais permet également de protéger le capteur des accroches non spécifiques d’autres éléments biologiques. Les biorécepteurs peuvent être de plusieurs types : biocatalytique (enzymes), immunologique (anticorps) ou encore basés sur des chaines d’acide désoxyribonucléique. Il convient de noter ici que des biocapteurs basés sur des biorécepteurs biomimétiques (i.e. polymères à empreinte moléculaire) [25] ou constitués de parties d’organismes cellulaires [26] ont été développés.
Le transducteur, quant à lui, réalise la transformation du signal biologique en un signal physiquement mesurable. Il est principalement de nature optique, électrochimique ou mécanique. D’autres principes de transduction tels que des méthodes magnétiques ou calorimétriques sont possibles mais relativement moins répandus.
En ce qui concerne les domaines de diffusion des biocapteurs commerciaux, c’est sans aucun doute le milieu médical et clinique qui profite du plus grand nombre d’applications. Le plus grand succès commercial reste le capteur de glucose sanguin pour les individus souffrant du diabète. Ce biocapteur portable est pourtant basé sur une technologie développée il y a plus de 40 ans [27]. D’autres biocapteurs portables, aisément manipulables, ont connu un développement commercial à grande échelle. Recensons l’i-STAT Portable Clinical AnalyserTM un biocapteur permettant de doser dans le sang du patient plusieurs électrolytes (sodium, potassium, calcium), gaz (oxygène dioxyde de carbone) et autres molécules (urée, glucose, hématocrite) [28]. Cependant en majorité les biocapteurs commerciaux sont de plus grosses tailles et destinés principalement aux laboratoires d’analyses et de recherche où ils ont trouvé leur place comme instruments de paillasse pour l’évaluation d’interactions biologiques. Ainsi, le système BiacoreTM (Biacore AB, Suède) basé sur des principes de résonance plasmonique de surface [29] mais également le système QCM-D (Microbalance à quartz avec suivi de la dissipation, Q-sense, Suède) sont maintenant très répandus [30].
Une grande variété de couches biologiques sensibles : les biorécepteurs
La couche biologique sensible consiste en la conjonction de deux éléments : un biorécepteur immobilisé à la surface du biocapteur via une technique d’immobilisation spécifique. La description exhaustive et complète de ces deux éléments complémentaires dans l’optimisation de la couche biologique n’entrera pas dans le cadre de cette étude. De telles revues et descriptions du fonctionnement des biorécepteurs ont déjà été menées et peuvent être trouvées dans la littérature [41].
On distingue deux grands types de biorécepteurs : les biorécepteurs d’affinité et ceux dits catalytiques correspondant pour la plupart à des enzymes. Les enzymes sont des protéines structurées de façon à posséder un site actif leur conférant la capacité de catalyse d’une réaction chimique pour un substrat donné. L’éventuelle dénaturation de cette protéine supprime son potentiel catalytique. Pour leur capacité d’amplification de la détection, ce sont les enzymes qui ont été employés historiquement comme biorécepteurs des premiers biocapteurs [27]. Grâce à son rôle catalytique, cette protéine peut produire plusieurs milliers de molécules issues de la réaction enzymatique à la seconde. Cette génération exceptionnelle au voisinage de la surface du biocapteur confère aux enzymes d’excellents avantages dans la course à la miniaturisation des capteurs [42]. Ainsi, des temps de réponse très courts peuvent être fournis même pour des capteurs à l’échelle micronique [43]. La principale limite des biorécepteurs enzymatiques est leur forte propension à perdre leur capacité catalytique avec la dénaturation de leur structure protéique. Cette dénaturation peut survenir lors de variations de température ou de pH. C’est ce principal désavantage qui éloigne de nos jours les récepteurs enzymatiques du cadre des biocapteurs appliqués à la détection d’AGB.
La seconde grande famille de biorécepteurs est celle des biorécepteurs dits d’affinité en raison de la reconnaissance hautement spécifique de molécules biologiques qu’ils permettent (constantes de liaisons supérieures à 10⁹ M⁻¹). Les plus répandues dans des applications de biocapteurs sont les immunoglobulines (e.g. anticorps) et les molécules d’acide désoxyribonucléique et ribonucléique (e.g. ADN et ARN).
Les molécules d’ADN et ARN sont d’énormes molécules véhiculant l’information génétique des êtres vivants, elles sont uniques pour un être vivant donné. La molécule d’ADN est présente dans les cellules et organismes vivants sous la forme de deux chaînes moléculaires liées à intervalles réguliers par des ponts hydrogène sous une structure tridimensionnelle double-hélicoïdale. Ces deux chaînes peuvent également se trouver sous une forme séparée l’une de l’autre. La structure moléculaire de ces chaînes est constituée d’une suite de nucléotides. Un nucléotide est constitué d’un acide phosphorique suivi d’un sucre, le désoxyribose, sur lequel vient s’attacher une base azotée. Ces bases azotées sont de quatre types (Adenine, Cytosine, Guanine et Thymine, dans la molécule d’ARN, l’Uracile remplace la Thymine) ; elles sont responsables de l’attachement en hélice des deux chaines d’ADN suivant un procédé associant toujours Adenine à Thymine et Cytosine à Guanine. La réaction permettant de rassembler deux brins d’ADN complémentaires en une structure à double hélice est dite réaction d’hybridation de l’ADN. La réaction d’hybridation est d’une très grande affinité, et une différence d’un nucléotide seulement peut induire des forces de liaison bien distinctes même lors de l’association de chaînes d’ADN constituées de centaines de bases [44].
La technique de biodétection basée sur l’utilisation de molécules d’ADN ou d’ARN est la suivante : une molécule d’ADN non hybridée et caractéristique d’une entité biologique en particulier est immobilisée à la surface du transducteur. Les conditions d’occurrence de la réaction d’hybridation étant alors recréées, le brin immobilisé se liera avec une molécule d’ADN présente dans le milieu réactionnel si et seulement si cette dernière possède l’enchaînement nucléotidique exactement complémentaire. En d’autres termes, cette technique possède l’avantage principal de permettre l’identification presque infaillible, au nucléotide prés, de l’entité biologique ciblée dans le milieu réactionnel [45]. De plus, grâce au développement des techniques d’amplification du matériel génétique (appelé PCR pour Polymerase Chain Reaction, méthode basée sur la réplication de faibles quantités de molécules d’ADN pour en produire des milliards de copies en quelques heures), de très faibles quantités de micro-organismes peuvent être détectées. Les travaux d’Hartley et Baeummer ont par exemple montré la détection de l’ADN extrait puis amplifié à partir d’une seule spore de Bacillus anthracis [46].
Bien qu’affichant des performances de sensibilité impressionnantes, la détection par hybridation de brins d’ADN en utilisant la PCR nécessite un traitement de l’échantillon de plusieurs heures. Le temps de détection associé a été cependant réduit à une heure en utilisant la méthode dite de PCR en temps réel, pour laquelle le processus d’amplification du matériel génétique est suivi au fur et à mesure.
La réalisation d’une telle identification requiert cependant de nombreux préalables à même de limiter les conditions d’utilisation des molécules d’ADN comme biorécepteurs. Tout d’abord, l’ADN doit être extrait de l’organisme ciblé en solution. Or, celui-ci se trouve systématiquement à l’intérieur d’une ou plusieurs membranes moléculaires définissant l’enveloppe du micro-organisme visé. Accéder à la molécule d’ADN de l’entité biologique signifie ainsi détruire par lyse son enveloppe externe. Il faut ensuite procéder à la déshybridation de la structure en double hélice afin de disposer de molécules d’ADN monobrin capables alors de venir s’hybrider avec le biorécepteur immobilisé. L’ensemble de ces étapes nécessite plusieurs traitements consécutifs et variés de l’échantillon à analyser. Même si des efforts considérables ont été faits pour miniaturiser l’ensemble des procédés de traitement des échantillons et d’amplification par PCR [47] [48], les biocapteurs basés sur biorécepteurs ADN ne peuvent pas actuellement être utilisés sur un champ opérationnel militaire. Selon les experts scientifiques des laboratoires militaires américains, cette catégorie de biocapteurs n’est pas prête à fournir des solutions de protection individuelles et portables efficaces. Par contre, leur intérêt demeure important à travers divers biocapteurs de laboratoire permettant l’identification infaillible de l’agent de guerre biologique utilisé. Enfin, il est essentiel de souligner que des biocapteurs utilisant des brins d’ADN ont été prouvés efficaces pour la détection d’organismes biologiques inconnus ou génétiquement modifiés. Ceci a été réalisé par Higgins et al en procédant à la reconnaissance d’un agent biologique modifié grâce à une partie de l’ADN non modifié par rapport à l’original [49]. En ce sens, les biocapteurs d’AGB utilisant la reconnaissance de brins d’ADN complémentaires, sont une voie royale pour le développement et la commercialisation de biocapteurs dits « detect-to-treat » aux performances d’identification exceptionnelles.
|
Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE I : Introduction à la sécurité biologique et présentation des bioMEMS comme solution à la problématique
I.1.Introduction à la menace bactériologique
I.1.1. Historique
I.1.2. Agents pathogènes concernés
I.1.3. Stratégies publiques
I.1.4. Dispositifs actuellement déployés
I.2. Les BioMEMS : Solution idoine à la problématique de bio-défense
I.2.1. Introduction aux biocapteurs
I.2.1.1. Définition
I.2.1.2. Les biorécepteurs
I.2.1.3. Les techniques d’immobilisation
I.2.1.4. Méthodes de transduction
I.2.2. Les bioMEMS : solution idoine à la problématique de bio-défense
I.2.2.1. Définition, avantages et inconvénients
I.2.2.2. BioMEMS statiques
I.2.2.3. BioMEMS résonants
Références
CHAPITRE II : Design et fabrication de micromembranes à actionnement piézoélectrique et détection piézorésistive
II.1. Dimmensionnement des micromembranes
II.1.1. Contexte et pré-acquis
II.1.2. Etude du comportement dynamique des micromembranes : Détermination de la sensibilité massique
II.1.3. Optimisation du mode de fonctionnement
II.1.3.1. Analyse modale par élements finis
II.1.3.2. Avantages d’une opération des membranes sur des modes supérieurs au fondamental
II.1.4. Remarques sur la théorie de l’actionnement
II.1.5. Optimisation de la détection piézorésistive
II.1.5.1. Eléments de théorie, optimisation du dimensionnement des piézorésistances
II.1.5.2. Choix des modes de résonance
II.1.6. Vibrations dans un fluide, modélisation théorique associée
II.2. Fabrication, et conditionnement des micromembranes résonantes
II.2.1. Présentation du contexte général
II.2.2. Module de détection piézorésistive
II.2.3. Module d’actionnement piézoélectrique
II.2.3. Fin du processus de fabrication face avant
II.2.4. Libération des membranes
II.3. Intégration des microsystèmes
II.3.1.Packaging des microsystèmes
II.3.2. Electronique de détection
II.3.2.1.Objectifs
II.3.2.2. Principe et fabrication
II.3.3. Cellule fluidique associée
II.4. Conclusion
Références
CHAPITRE III : Caractérisation dynamique des micromembranes résonantes dans l’air et dans le liquide
III.1. Comportement dynamique des membranes dans l’air
III.1.1. Caractérisation des modes de résonance des membranes dans l’air
III.1.2. Détection piézorésistive et spectre de résonance dans l’air
III. 1.3. Suivi multiplexé des fréquences de résonance dans l’air
III. 2. Détection piézorésistive et suivi de la résonance du mode (0,1) dans le fluide
III.2.1 Effet de la présence de fluide sur la résonance
III.2.2. Amélioration du facteur de qualité grâce à la boucle de rétroaction
III.2.3. Suivi multiplexé, de la fréquence de résonances des membranes oscillant dans le fluide en temps réel
III.2.4. Retour sur le modèle théorique : validation du modèle Lamb étendu au mode (0,1)
III.3. Conclusion
Références
CHAPITRE IV : Détection d’agents pathogènes simulant la menace biologique par une matrice de micromembranes
IV.1. Objectifs
IV.2. Optimisation d’un protocole biochimique de détection d’agents pathogènes simulant la menace
IV.2.1. Greffage d’anticorps sur de surfaces de dioxyde de silicium
IV.2.2. Greffage d’anticorps sur des surfaces d’or
IV.2.3. Détection spécifique d’agents pathogènes grâce à la microbalance à quartz
IV.3. Détection spécifique d’agents pathogènes simulant la menace par une matrice de micromembranes à détection piézorésistive
IV.3.1. Contexte, objectifs et sélection des puces
IV.3.2. Fonctionnalisation des micromembranes et protocole de biodétection d’agents simulant menace
IV.3.3. Résultats et discussion
IV.3.4. Conclusion
Références
CONCLUSION GENERALE
