Les biocapteurs (ou capteurs biologiques) 

La modification de surfaces constitue un domaine de recherche important en termes de publications et d’activités industrielles. Elle permet la fonctionnalisation de surfaces et ouvre des perspectives intéressantes pour de nouvelles applications dans différents domaines médical [1-5], environnement [6-9] et agro-alimentaire [10-13], …. Plusieurs chercheurs s’intéressent à la modification de surface pour la préparation de biocapteurs. Ce domaine a connu un développement remarquable, différentes stratégies ont été suivies afin d’obtenir un dispositif fiable, performant etspécifique à la cible [14]. La préoccupation croissante dans le monde entier pour limiter les contaminants des produits alimentaires et l’accumulation de métaux lourds dans les sols et des eaux de mer, a créé un besoin pour le développement des méthodes rapides, sensibles permettant de détecter des composés biologiques et chimiques. À cet effet, les techniques électrochimiques peuvent fournir un outil peu coûteux et sensible basé sur des dispositifs portables capables de détecter rapidement un ensemble d’analytes avec une sensibilité et une spécificité élevées, permettant la transformation d’un signal biochimique en un signal électrique facilement exploitable. L’élaboration et les applications de nouveaux biocapteurs électrochimiques, particulièrement ceux à détection ampérométrique, ont fait l’objet d’une intense activité de recherche, la quête d’améliorer leurs performances analytiques, en maîtrisant les propriétés physiques et chimiques de l’interface électrode/solution, est toujours d’actualité. Dans ce contexte, les travaux de thèse présentés, visent le développement des biocapteurs électrochimiques utilisant différents récepteurs (les champignons filamenteux sous forme de biomasse et l’enzyme cholinestérase).

Généralités sur les capteurs

Historique

Depuis l’invention du premier biocapteur adapté à la mesure de la concentration de glucose dans le sang par Clark et Lyons en 1962 [1], des efforts considérables ont été faits pour mettre au point d’autres biocapteurs dans l’objectif de réaliser des dosages rapides, sensibles et spécifiques de molécules présentant un intérêt dans le domaine médical, agroalimentaire, ou environnemental. Dans les années qui ont suivi, de nombreuses études ont été réalisées afin de mieux comprendre le fonctionnement de ce premier biocapteur à glucose ou dans le but d’appliquer son principe au développement d’autres biocapteurs enzymatiques. Cinq années plus tard, Updike et Hickson ont élaboré une électrode enzymatique permettant de doser le glucose dans des solutions biologiques [2]. A la fin des années 70 (1969), George Guilbault et Montalvo ont créé un biocapteur potentiométrique pour doser l’urée dans le sang et l’urine [3]. Mais ce n’est qu’en 1975 que le premier biocapteur à glucose basé sur la détection ampérométrique du peroxyde d’hydrogène (H2O2) fut commercialisé par la société Yellow Springs Instrument (Ohio, Amérique). Plus récemment, Di Gleria et al. (1986) ont décrit un biocapteur électrochimique utilisant le ferrocène au lieu du dioxygène pour alléger les interférences des espèces électro actives telles que les acides urique et ascorbique [4]. Ce développement a été à l’origine du succès de la commercialisation d’un stylo à glucose par Medisense. En 1987, Vo-Dinh et al ont montré que les anticorps pourraient être utilisés in situ pour la détection d’un agent cancérogène chimique par un immunocapteur à fibre optique [5]. Depuis, l’engouement pour ce type d’outil n’a cessé de croître, et des biocapteurs se basant sur d’autres types d’éléments de reconnaissance (les bactéries, les anti corps, ADN) ou de transducteurs sont destinés à des applications dans le domaine de la santé, de l’environnement ou encore de l’agroalimentaire ont vu le jour.

Définition

Un capteur est défini comme un outil analytique associant un composant chimique ou biochimique à une électrode qui transforme la reconnaissance moléculaire en un signal électrique mesurable. Les capteurs constituent une nouvelle classe de dispositifs analytiques plus spécifiques, rapides et sensibles que les méthodes traditionnelles. Le champ d’application de ces dispositifs n’a cessé de s’étendre, ce succès vient probablement du caractère interdisciplinaire de ce domaine de recherche, situé entre biologie, chimie et physique. En effet, les réactions de détection en utilisant des électrodes conventionnelles sont limitées par un certain nombre de facteurs, les plus importants d’entre eux sont d’une part, la dégradation de la surface de l’électrode consécutive à des processus de précipitation ou d’adsorption non désirés et d’autre part, l’extrême lenteur de certaines transformations électrochimiques pour lesquelles une forte surtension doit être appliquée.

Les capteurs chimiques 

C’est un système qui utilise des interactions chimiques pour détecter un composé à analyser. Il est constitué d’une couche sensible chimiosélective chargée de reconnaître sélectivement l’espèce chimique qu’on désire analyser (analyte) et un transducteur représentant le mode de détection en convertissant les interactions ou les reconnaissances physico-chimiques en un signal exploitable [6]. Un capteur chimique repose sur les propriétés d’une couche sensible qui fait preuve de sélectivité, sensibilité et réversibilité. La sélectivité consiste à retenir un seul composé par rapport aux autres composés présents dans le milieu. La sensibilité se traduit par la capacité de la couche à modifier une de ses propriétés en présence de l’analyte [7]. Le principe de fonctionnement de la plupart des capteurs chimiques repose sur une interaction physique et/ou chimique entre un matériau sensible et l’espèce chimique cible. Ces matériaux sont choisis pour l’interaction spécifique avec une espèce chimique afin d’assurer ainsi une bonne sélectivité.

Les biocapteurs (ou capteurs biologiques) 

Le biorécepteur constitue le premier maillon du biocapteur. Il permet l’identification de l’espèce à détecter grâce à son site particulièrement sélectif. Le biocapteur assure ainsi la reconnaissance moléculaire, associée ou non à la transformation de l’espèce à mesurer. Cette modification très localisée de l’espèce, se fait généralement par l’intermédiaire d’une molécule active (Enzyme, anticorps, ADN…) immobilisée (Figure I.1). En fonction du mode de transduction utilisé, on distingue ainsi quatre grandes classes de biocapteurs : optiques, gravimétriques, calorimétriques et électrochimiques. C’est à ce dernier type de capteur que nous nous sommes intéressés particulièrement.

Les transducteurs électrochimiques peuvent être divisés en trois catégories selon la mesure effectuée :

❖ Les biocapteurs potentiométriques reposent sur la mesure de la différence de potentiel entre le transducteur et une électrode de référence. Ces transducteurs sont soit des électrodes sélectives à ions (ISE) ou des transistors à effet de champ (FET-Field-Effect Transistor). En milieu aqueux, les électrodes de références les plus utilisées sont l’électrode au calomel saturé (ECS) ou l’électrode argent/chlorure argent (Ag/AgCl).
❖ Les biocapteurs conductimétriques sont basés sur la mesure de variation de concentration en espèces chargées générées au cours des bio-réactions.
❖ Les biocapteurs ampérométriques reposent sur la mesure de l’intensité de courant obtenu lors d’une réaction d’oxydoréduction se produisant à un potentiel donné. Le courant enregistré est proportionnel à la concentration de l’espèce électro-active générée au cours d’une réaction enzymatique, comme exemple.

Les électrodes modifiées 

La modification de surfaces conductrices ou isolantes constitue un domaine de recherche qui suscite un intérêt grandissant depuis plusieurs décennies. Elle permet la fonctionnalisation des surfaces et ouvre des perspectives intéressantes. Elle permet aussi de créer à la surface du support des fonctions chimiques réactives, c’est-à-dire des fonctions utilisables pour la fixation par liaison covalente d’une autre molécule (Figure I.2). Les surfaces modifiées trouvent de nombreuses applications dans le domaine des sciences de la vie, et dans le développement de nouveaux matériaux composites [8]. Le contrôle de la fonctionnalisation d’un substrat permet ainsi d’ajuster les propriétés de l’interface solide/liquide pour induire une réactivité spécifique selon les applications (stockage de l’énergie, anticorrosion [9], adhérence [10], capteur [11], biomédical [12] ou catalyse [13].

Table des matières

Introduction Générale
Chapitre I : Etude bibliographique
I.1. Généralités sur les capteurs
I.1.1. Historique
I.1.2. Définition
I.1.3. Les capteurs chimiques
I.1.4. Les biocapteurs (ou capteurs biologiques)
I.2. Les électrodes modifiées
I.2.1. Les différentes méthodes de modification des électrodes
I.2.2.1. Méthodes physiques
I.2.2.2. Méthodes chimiques
I.2.2.2.1. Modification par adsorption chimique
I.2.2.2.2. Modification par des monocouches auto-assemblées
I.2.2.2.3. Modification par la technique sol-gel
I.2.2.2.4. Modification par la technique couche par couche (LBL)
I.2.2.3. Méthodes électrochimiques
I.3. Matériaux utilisés pour la modification des électrodes
I.3.1. Les nanomatériaux
I.3.1.1. Les nanoparticules
I.3.1.2. Les nanoparticules d’or
I.3.1.3. Les nanotubes de carbone
I.3.1.3.1. Fonctionnalisation covalente
I.3.1.3.2. Fonctionnalisation non covalente
I.4. Les enzymes
I.4.1. Site actif
I.4.2. Les biocapteurs enzymatiques
I.4.2.1. Biocapteurs Potentiométriques
I.4.2.2. Biocapteurs Ampérométriques
I.4.3. Biocapteur à base d’acétylcholinestérase (AChE)
I.4.3.1. Rôle de l’AChE
I.4.3.2. Description structurale de l’Acétylcholinestérase
I.4.3.3. Mécanisme d’inhibition
I.4.4. Les différentes techniques d’immobilisation d’enzyme sur la surface du transducteur
I.4.4.1. Les méthodes physiques d’immobilisation
I.4.4.1.1. L’adsorption
I.4.4.1.2. Le piégeage
I.4.4.2. Les méthodes chimiques d’immobilisation
I.4.4.2.1. Liaison covalente
I.4.4.2.2. Réticulation et Co-réticulation
I.5. Les champignons filamenteux
I.5.1. Réponse extracellulaire de la cellule fongique
I.6. Identification des polysaccharides issus des algues brunes
I.6.1. Généralités sur les algues
Classification des algues
I.6.2. Généralités sur les polysaccharides
I.6.2.1. Classification des polysaccharides
I.6.2.2. Les polysaccharides d’origine algale
Les Alginates
a). Définition et structure
b). Propriétés physico-chimiques
c). Les applications des alginates
I.7. L’Aflatoxine B1 : molécule cible étudiée
I.7.1. Définition et structure chimique
I.7.2. Propriétés physico-chimiques des Aflatoxines
I.7.3. Contamination des aliments
I.8. Généralités sur les métaux lourds et leurs effets sur l’environnement
I.8.1. Origine des métaux lourds
I.8.1.1. Origine naturelle
I.8.1.2. Origine anthropique
I.8.2. Procèdes d’élimination des métaux Lourds
I.8.2.1. Adsorption
I.8.2.2. Filtration par membrane
I.8.2.3. Les résines d’échanges
I.8.2.4. Electrocoagulation- floculation
I.8.2.5. Fixation biologique
I.8.2.6. Précipitation chimique
I.8.3. Eléments traces étudiés
I.8.3.1. Cadmium
I.8.3.1.1. Propriétés
I.8.3.1.2. Toxicité et Persistance
I.8.3.1.3. L’utilisation du Cd par l’homme dans les cycles biologiques
I.8.3.2. Plomb
I.8.3.2.1. Propriétés
I.8.3.2.2. Toxicité et Persistance
I.8.3.2.3. L’utilisation du Pb par l’homme dans les cycles biologiques
Références bibliographiques
Chapitre II : Méthodes et matériels
II.1. Introduction
II.2 Dispositifs expérimentaux
II.2.1. Appareillage et montage électrochimique
II.2.2. Cellule électrochimique
II.3. Méthodes électrochimiques utilisées
II.3.1. Voltammétrie
II.3.1.1. Voltammétrie cyclique
II.3.1.1.1. Système réversible (Système rapide)
II.3.1.1.2. Système quasi-réversible (système quasi-rapide)
II.3.1.1.3. Système irréversible (système lent)
II.3.1.2. Voltammétrie en redissolution anodique à impulsions différentielle (DPASV)
II.3.1.2.1. Étape de préparation des électrodes à film métalliques
II.3.1.2.2. Étape de Préconcentration du métal à déterminer
II.3.1.2.3. Étape de redissolution
II.3.1.3. Voltampérométrie à ondes carrées (SWV)
II.3.2. Spectroscopie d’impédance
II.3.2.1. Principe de la spectroscopie d’impédance
II.3.2.2. Représentation graphique de l’impédance
II.3.2.2.1. Diagramme de Bode
II.3.2.2.2. Diagramme de Nyquist
II.3.2.2.3. Circuit électrique équivalent : Circuit de Randles
II.3.2.3. Impédance de différents phénomènes électrochimiques
II.3.2.3.1. Résistance de transfert de charge
II.3.2.3.2. Résistance de la solution Rs
II.3.2.3.3. Capacité de la double couche
II.3.2.3.4. Impédance de Warburg
II.4. Techniques d’analyse de surface
II.4.1. Caractérisation par microscopie électronique à balayage (MEB)
II.4.1.1. Principe de fonctionnement
II.4.2. Spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie (EDX)
II.4.3. Spectroscopie infrarouge
II.5. Méthodes et conditions expérimentales
II.5.1. Produits chimiques et réactifs
II.5.2. Elaboration D’un Biocapteur ECV/SWCNTs-CO/Biomasse
II.5.2.1. Protocole de préparation de la biomasse
II.5.2.2. Nettoyage de la surface de l’électrode de carbone vitreux
II.5.2.3. Dépôt de (SWCNTs-CO/Biomasse) sur l’électrode de carbone vitreux
II.5.3. Elaboration d’un biocapteur Or/ AS /AChE
II.5.3.1. Extraction et identification des polysaccharides issus des algues brunes
II.5.3.1.1. Récolte de la matière algale
II.5.3.1.2. Extracteur Soxhlet
II.5.3.1.3. Préparation de la matière algale
II.5.3.1.4. Extraction des polysaccharides à partir des algues brunes
II.5.3.2. Développement d’un biocapteur à électrode modifié par Alginate de sodium
II.5.3.3. Immobilisation de l’Achée par réticulation Glutaraldéhyde
II.6. Conclusion
Références bibliographiques
Chapitre III : Résultats et discussion
Partie A Biocapteur chimique à base de biomasse pour la détection des métaux lourds
III.A.1. Introduction
III.A.2. Caractérisations des champignons filamenteux
III.A.2.1. Observations macro et microscopiques
III.A.2.2. Analyse des spectres FTIR
III.A.3. Caractérisations électrochimiques des électrodes modifiées
III.A.3.1. Procédure et test électrochimique sur des électrodes modifiées
III.A.3.2. Choix de la quantité de SWCNTs déposée sur une électrode de carbone vitreux
III.A.3.3. Aspects morphologiques des électrodes modifiées -Caractérisation par MEB
III.A.3.4. Caractérisation par voltammétrie cyclique
III.A.3.5. Caractérisation par spectroscopie d’impédance
III.A.3.6. Calcul du taux de recouvrement
III.A.4. Application d’électrode modifiée (ECV/SWCNTs-CO/Biomasse) pour l’analyse des cations métalliques
III.A.4.1. Optimisation des conditions de détection
III.A.4.1.1. Effet de pH
III.A.4.1.2. Potentiel de préconcentration
III.A.4.1.3. Temps d’accumulation
III.A.4.1.4. Temps de réduction
III.A.4.2. Principe de détection
III.A.4.3. Détection des métaux lourds par (DPASV)
III.A.4.4. Étude d’interférence
III.A.4.5. Répétabilité de l’électrode
III.A.4.6. Analyse d’un échantillon réel
III.A.5. Conclusion
Partie B Biocapteur ampérométrique à acétylcholinestérase pour la détermination d’aflatoxine B1
III.B.1. Introduction
III.B.2. Choix de bio récepteur et de transducteur
III.B.3. Caractérisation des algues brunes étudiées
III.B.3.1. Rendements de l’extraction des fucoïdes et des alginates
III.B.3.2. Analyse des échantillons extraits par IRTF
III.B.4. Caractérisations électrochimiques des électrodes modifiées
III.B.4.1. Caractérisation par Microscopie Electronique à Balayage (MEB)
III.B.4.2. Caractérisation électrochimique des interfaces électrodes / électrolytes modifiées
III.B.4.2.1. Caractérisation par voltammétrie cyclique
III.B.4.2.2. Caractérisation par spectroscopie d’impédance électrochimique (SIE)
III.B.5. Réponse du biocapteur en présence de l’Aflatoxine
III.B.5.1. Détection du Thiocholine par l’enzyme acétylcholinestérase
III.B.5.2. Principe d’inhibition de l’aflatoxine B1 par l’enzyme acétylcholinestérase
III.B.5.3. Réponse du Biocapteur en présence du substrat Thiocholine Détection d’AFB1 par la voltampérométrie à ondes carrées (SWV)
III.B.5.4. Calibrage du biocapteur AFB1
III.B.5.5 Comparaison des performances de notre biocapteur a des travaux antérieurs
III.B.5.6. Sensibilité et reproductibilité du biocapteur
III.B.5.7. Sélectivité du biocapteur pour l’aflatoxine B1
III.B.5.8. Détection de l’Aflatoxine B1 dans un échantillon de lait
III.B.6. Conclusion
Références bibliographiques
Conclusion générale
Annexe

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