Soutenance mémoire
Les barrières au transfert de gène
L’acide nucléique doit franchir de nombreuses barrières biologiques (extracellulaires et intracellulaires) pour atteindre le noyau des cellules cibles. Brièvement, l’acide nucléique doit passer la peau, première barrière biologique, puis être véhiculé jusqu’au tissu cible, passer la barrière vasculaire et les tissus conjonctifs pour enfin arriver aux cellules cibles et là passer la membrane plasmique délimitant la cellule, traverser le cytosol (en évitant les nucléases) et enfin franchir l’enveloppe nucléaire. C’est donc un parcours semé d’embûches. Pour y parvenir il est donc indispensable de disposer de moyens permettant de surmonter ces multiples barrières, et ce n’est à l’heure actuelle que grâce au développement de tels moyens que de réelles réussites en thérapie génique verront le jour. Dans ce but, différentes techniques ont été mises au point pour permettre ce transfert de gène. La maladie à traiter, la nature du gène à transférer, son mode d’action, la durée d’expression recherchée, les cellules ou tissus cibles sont autant de paramètres qui en déterminent le choix. Le vecteur idéal au transfert de gène (figure 2) devra avoir les critères suivants : (1) spécifique vis-à-vis des cellules cibles, (2) sans dissémination du gène dans tout l’organisme, (3) résistant aux dégradations métaboliques et/ou aux attaques par le système immunitaire, (4) sûr, c’est-àdire avoir le moins d’effets secondaires, et (5) capable d’exprimer de manière régulable le gène d’intérêt thérapeutique aussi longtemps que nécessaire [9]. Les méthodes de transfert de gène sont en général divisées en deux : (a) le transfert par des vecteurs biologiques viraux, (b) le transfert par des approches chimiques ou physiques qualifiées de non virales.
Les vecteurs viraux
Parmi les différentes techniques de transfert de gène dans les cellules cibles d’un organisme, une première technique consiste à transporter l’acide nucléique d’intérêt grâce à des vecteurs viraux, utilisant la capacité des virus à pénétrer dans les cellules hôtes pour y transférer leur génome [10–12]. Les rétrovirus, adénovirus et AAV sont les vecteurs viraux les plus utilisés, et ont déjà été testés lors d’essais cliniques (voir figure 2). De façon simplifiée, le principe du transfert de gène par des vecteurs viraux est le suivant : (1) les virus sont rendus inaptes à la réplication par déletion de la partie du génome essentielle à cette réplication, (2) la cassette d’expression contenant un promoteur et le gène d’intérêt est insérée au niveau de cette délétion (la taille maximale de la cassette d’expression dépend du virus considéré), (3) ce virus recombinant est transfecté dans une lignée cellulaire d’encapsidation qui contient les gènes viraux indispensables, (4) les cellules d’encapsidation permettent ainsi la production de virus recombinants incapables de se répliquer ensuite dans les cellules cibles.
Rétrovirus
Les rétrovirus (virus à ARN, capacité d’insert ≤8kb) ont été les premiers virus testés, dès 1981 [13]. Ils sont capables de transduire une grande fraction de cellules cibles en mitose et de permettre une intégration stable du matériel génétique dans le génome des cellules cibles. Les gènes transférés sont ainsi transmis aux générations successives de cellules filles, permettant ainsi une expression stable à long terme. Cependant leur emploi reste limité au transfert de gène dans des cellules en division et également à des cellules facilement prélevables pour des stratégies ex vivo. En effet ils sont rapidement inactivés par le système du complément lorsqu’ils sont injectés par voie systémique. Les essais menés in vivo ont montré une efficacité de transfection réduite. De plus l’obtention des quantités de virus nécessaires à des essais cliniques est difficile et coûteuse. Mais la principale restriction à l’utilisation clinique de ces vecteurs est le risque de mutation insertionnelle [14, 15]. Actuellement de gros progrès sont faits pour développer d’autres vecteurs rétrovirus : les lentivirus (virus à ARN, capacité d’insert ≤8kb) et plus particulièrement le virus de l’immunodéficience humaine (HIV). Ils ont eux, la capacité de transduire des cellules qui ne se divisent pas [16]. Leur supériorité pour l’application directe in vivo (cerveau, rétine, muscle, foie) a été démontrée [16, 17].
Adénovirus
Les adénovirus (virus à ADNdb, capacité d’insert ≤8kb) sont également largement utilisés. Ils sont capables d’infecter de nombreux types de cellules quiescentes ou en division [18]. Ils ont un tropisme naturel pour les voies aériennes supérieures. L’expression du transgène est transitoire ce qui peut être à la fois un avantage et un inconvénient. Leur principal défaut est leur forte immunogénicité due à l’expression résiduelle de protéines virales : des adénovirus plus récents sont donc développés en délétant toute la séquence codante sauf les ITR (Inversed Terminal Repeat) permettant ainsi une moins forte immunogénicité [19]. Des vecteurs adénovirus sont actuellement testés en phase II et III d’essais cliniques pour des applications angiogéniques et pour le cancer [20].
«Adeno Associated Virus» (AAV)
Les vecteurs issus de virus associés aux adénovirus, nommés AAV (capacité d’insert ≤8kb) tirent leur nom du fait qu’ils ont besoin de l’aide d’un autre virus (adénovirus ou HSV) pour accomplir leur cycle complet de réplication. Ils sont capables d’infecter un large spectre de cellules cibles quiescentes ou en division. Les vecteurs AAV semblent conjuguer les avantages des rétrovirus et de adénovirus. Le virus sauvage ne présente aucune toxicité pour l’homme mais une contamination potentielle par le virus helper est possible pendant la préparation. Malgré les problèmes d’immunogénicité qu’ils entraînent, les vecteurs AAV semblent très prometteurs de part leur efficacité de transfection in vivo. En effet, les premiers essais in vivo ont montré une expression stable pendant plusieurs années chez la souris [21] et plusieurs mois chez les gros animaux [22] après injection et même après administration orale [23]. L’inconvénient majeur des vecteurs AAV est la difficulté de produire de tels vecteurs en lots cliniques et en grandes quantités.
HSV
Les vecteurs Herpes simplex virus (HSV) (virus à ADNdb, capacité d’insert ≤40kb) sont des virus pathogènes humains ayant déjà probablement infecté 80% de la population. Le principal avantage de ces virus est leur grande capacité d’insert. Les vecteurs dérivés du virus de l’herpès simplex (HSV-1), après injection directe, ont la capacité d’infecter les neurones [24,25] et offrent un espoir de transfert de gène dans le cas des neuroblastomes [26]. Les principaux inconvénients des différents vecteurs viraux sont : la réponse immune qu’ils peuvent induire, les risques potentiels associés aux virus réplicatifs, et le manque de spécificité.
Les vecteurs non viraux
En parallèle de ces vecteurs viraux, des techniques de transfert de gène non virales sont développées : elles doivent conserver les avantages des vecteurs viraux (efficacité de transfection) tout en évitant leurs inconvénients (immunogénicité, insertion mutationnelle).
ADN nu
Cette technique consiste à transférer l’ADN thérapeutique nu sous forme de plasmide [27]. C’est la technique la plus directe de transfert de gène, elle est en particulier efficace dans la peau [28] et le muscle squelettique [29]. Wolff et al. ont montré que l’expression du transgène porté par un plasmide injecté seul dans le muscle squelettique de souris peut durer plusieurs mois [30]. On ne connaît encore pas à ce jour le mécanisme d’entrée de l’ADN nu dans les cellules de l’organe injecté in vivo. Cette technique peut être utilisée dans le domaine de la production de protéines sécrétées [31] et de la vaccination. Depuis 1990, il a été montré dans de nombreux modèles animaux de maladies infectieuses ou de cancer que l’injection directe d’ADN plasmidique dans le muscle ou la peau permet la production d’antigènes protéiques in situ et l’induction de réponses immunitaires protectrices, humorales et cellulaires, sans l’aide d’adjuvants ( [32] et voir paragraphe Vaccination). La vaccination constitue ainsi une des applications majeures de l’injection d’ADN nu. Bien que l’ADN nu, en tant que molécule, ne provoque pas de réponse immunitaire spécifique, la présence sur les plasmides de séquences bactériennes riches en motifs CpG non méthylés favorise in vivo les réponses inflammatoires et immunitaires [33]. Ceci représente un avantage pour les applications de vaccination mais un inconvénient pour les traitements de maladies par thérapie génique. Alors que l’injection d’ADN nu est une approche très prometteuse de transfert de gène dans le muscle ou la peau, elle ne peut être envisagée pour des approches systémiques (administration par voie intraveineuse) car l’ADN plasmidique nu, s’il n’est pas protégé des protéines du sérum subit une dégradation très rapide [34] et a une demie-vie plasmatique très courte [35]. De plus, malgré les résultats positifs de transfert de gène observés par injection d’ADN nu dans la peau ou le muscle les niveaux d’expression obtenus sont trop faibles pour produire un effet thérapeutique [36] pour des applications autres que vaccinales. C’est pourquoi, afin d’augmenter l’efficacité de transfection (in vitro ou in vivo), l’administration d’ADN nu est généralement assistée soit par des vecteurs chimiques soit par des techniques physiques.
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Table des matières
Introduction
1 Introduction au transfert de gène
1.1 Principe
1.2 Les stratégies
1.3 Les cellules cibles
1.4 Les barrières au transfert de gène
1.5 Les vecteurs viraux
1.6 Les vecteurs non viraux
2 Electrotransfert
2.1 Historique
2.2 Mécanisme de l’électrotransfert à l’échelle de la cellule
2.3 Mécanisme de l’électrotransfert in vivo
2.4 Réalisation pratique
2.5 Tissus cibles
3 Applications thérapeutiques de l’électrotransfert
3.1 Sécrétion ectopique de protéines
3.2 Maladies musculaires
3.3 Production d’anticorps par immunisation génétique
3.4 Cancers
3.5 Electrotransfert comme un outil
4 Régulation temporelle de l’expression des gènes
4.1 Une large étendue d’applications
4.2 Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
4.3 Régulation par neutralisation du gène ou de son ARN messager
4.4 Régulation par un contrôle de l’initiation de la transcription
5 Description du projet de thèse
Matériel et Méthodes
1 Vecteurs plasmidiques
1.1 Plasmides courants
1.2 Plasmides pour la construction du système de régulation
1.3 Plasmides utilisés pour l’imagerie
1.4 Plasmides pour l’obtention d’antiserum
1.5 Purification des plasmides
2 Microbiologie
2.1 Génotypes et caractéristiques des souches d’E. coli
2.2 Milieux de culture
2.3 Préparation de bactéries compétentes
2.4 Transformation de bactéries compétentes par choc thermique
2.5 Transformation de bactéries compétentes par électroporation
3 Biologie moléculaire
3.1 Electrophorèse analytique et préparative des acides nucléiques
3.2 Extraction d’ADN
3.3 Extraction d’ARN
3.4 Traitement à la DNAse des ARN
3.5 Quantification de l’ARN et de l’ADN
3.6 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
3.7 RT-PCR
3.8 PCR en temps réel
3.9 Traitement au bisulfite
3.10 PCR nichée après traitement au bisulfite
3.11 RAIC PCR (Repeat-Anchored Integration Capture)
3.12 Séquençage
4 Biologie cellulaire
4.1 Culture cellulaire
4.2 Transfection in vitro
5 Biochimie
5.1 Dosages biochimiques
5.2 Dosages ELISA (Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay)
5.3 Immunofluorescence
5.4 Western-Blot
6 Expérimentation animale
6.1 Animaux
6.2 Anesthésie
6.3 Transfert de gènes in vivo dans le muscle squelettique de souris
6.4 Transfert de gènes in vivo en intradermique chez la souris
6.5 Transfert de gènes in vivo dans le muscle chez le lapin
6.6 Prélèvements
6.7 Histologie
6.8 Test de neutralisation
7 Imagerie du petit animal
7.1 Préparation de l’animal
7.2 Caméra CCD
8 Statistiques
Résultats
Conclusion
