Les Bactériophages

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Structure du bactériophage T5

Le laboratoire dans lequel j’ai effectué ma thèse étudie le bactériophage T5 (Figure 3) qui infecte la bactérie à Gram négatif Escherichia coli. Ce phage appartient à l’ordre des Caudovirales et à la famille des Siphoviridae (voir section I.1.3 page 4). Il est composé d’une capside de forme icosaédrique de grande taille (90 nm de diamètre) renfermant un ADN double brin linéaire de 121 752 paires de bases et d’une longue queue non contractile. Les protéines de structure de T5 sont dénommées selon leur position sur gel de polyacrylamide. Les lettres « pb » (pour « protein band ») sont suivies d’un numéro allant de 1 à 11 de la protéine la plus grande à la plus petite [23]. Figure 3 : Le bactériophage T5.
A. Image de microscopie électronique. B. Reconstruction de la particule virale à partir de données de cryo-microscopie électronique. La tête et la queue sont respectivement à 19 Å et à 30 Å de résolution. Les parties non résolues sont symbolisées en jaune (figure adaptée de [24]).
Les 16 gènes connus codant pour les protéines de structure sont regroupés dans un même module sur le génome de T5 (Figure 4) [25].
Figure 4 : Gènes codant pour les protéines de structure du phage T5.
Les gènes des protéines de capside sont colorés en bleu, ceux des protéines de queue en rouge, ceux de l’encapsidation de l’ADN en vert et les autres gènes sont en gris. Figure reproduite de [25].

Structure de la tête de T5

La tête d’un bactériophage à queue désigne la capside protéique avec son ADN.

Les capsides icosaédriques

La capside est la coquille protéique qui protège le génome du virus. Comme celle de nombreux autres virus, procaryotes et eucaryotes, la capside de T5 est icosaédrique. Un icosaèdre est un polyèdre à 20 faces triangulaires et 12 sommets (Figure 5-A) et comporte 3 sortes d’axes de symétrie : les axes d’ordre 5 passant au niveau des sommets, les axes d’ordre 3 passant au centre des faces, et les axes d’ordre 2 passant au milieu des arrêtes. En faisant tourner l’icosaèdre de (360/5)°, (360/3)° et (360/2)° respectivement selon ces axes, on retrouve la même image (Figure 5-C). Dans une symétrie icosaédrique, on peut placer 60 sous-unités ayant des positions équivalentes (symbolisées par une apostrophe noire sur la Figure 5-B) [26].
Figure 5 : La symétrie icosaédrique.
A. Un icosaèdre dont les arêtes visibles sont représentées en trait plein et les arrêtes situées de l’autre côté de la figure sont en pointillés. B. Un icosaèdre dont les positions équivalentes sont représentées par une apostrophe noire. C. Vues d’un icosaèdre selon les axes d’ordre 5, 3 et 2. Les axes de symétrie d’ordres 5, 3 et 2 sont représentés respectivement par un pentagone, un triangle et un ovale. Figures B et C adaptées de [26].
Les capsides icosaédriques sont généralement constituées de multiples copies d’une ou deux protéines principales. Il existe des virus de petite taille ayant des capsides formées uniquement de 60 copies d’une protéine majeure de capside formant 12 pentamères, mais la plupart des capsides sont composées d’un plus grand nombre de sous-unités. Les protéines sont alors généralement assemblées en capsomères : hexamères sur les faces de l’icosaèdre et pentamères sur les sommets (Figure 6-A). Les sous-unités n’occupent plus des positions équivalentes car elles ont des interactions différentes avec les sous-unités voisines en fonction de leur position. On parle alors de « quasi-équivalence » : sur la Figure 6-B, les sous-unités occupent 4 positions quasi-équivalentes représentées par 4 couleurs différentes, les sous-unités d’une même couleur occupent des position équivalentes [26]. Le nombre de triangulation T a été introduit par Caspar et Klug en 1962 [27] pour décrire ce type de capside dont les faces sont divisées en plusieurs triangles plus petits. Le nombre de triangulation est un indicateur de la taille de la capside et se calcule à partir du nombre de capsomères selon la formule suivante : T = h² + k² + h x k où h et k sont les nombres de capsomères séparant deux pentamères proches (voir Figure 6-C).
Figure 6 : Organisation des capsides.
A. Carte de densité électronique de la capside du phage HK97 à 3.65 Å de résolution. Les hexamères sont représentés en jaune et bleu et les pentamères en rouge. Les structures d’un hexamère et d’un pentamère sont représentées sur la droite. Figure reproduite de [28]. B. Un icosaèdre de taille T=4 (H=2, K=0) composé de 240 sous-unités représentées par des apostrophes colorées selon leur position : les sous-unités ayant des positions équivalentes sont colorées d’une même couleur. Les centres des pentamères et des hexamères sont représentés respectivement par des pentagones et des hexagones. Figure reproduite de [26]. C. Icosaèdres avec différents nombres de triangulation. Les hexamères sont représentés en blanc et les pentamères en noir. Figure reproduite de [29].
Dans les capsides ayant un nombre de triangulation supérieur à 1, il existe des axes de symétrie locaux : sur la Figure 6-B il y a des axes de quasi-symétrie d’ordre 3 au centre de chaque triangle, mais seuls les triangles noirs possèdent de véritables axes de symétrie 3. De même, il y a des axes de quasi-symétrie d’ordre 2 entre deux triangles adjacents [26].

La capside de T5

La capside du bactériophage T5 (Figure 7) a un nombre de triangulation T = 13, soit 120 hexamères sur les faces et 11 pentamères sur 11 des 12 sommets. Elle mesure environ 90 nm de diamètre [30]. Elle est composée des protéines suivantes :
– 775 copies de la protéine majeure de capside pb8 assemblées en hexamères et pentamères et formant la structure de la capside (en bleu sur la Figure 7)
– 120 copies de la protéine de décoration pb10 (en rouge sur la Figure 7) situées au centre de chaque hexamère et dont la fonction est inconnue
– 12 copies de la protéine portale pb7 assemblées en anneau sur un sommet unique et formant un pore (ou canal) d’entrée et de sortie pour l’ADN
– la protéine p144 formant un bouchon qui ferme le pore et permet de connecter la queue, le nombre de copies n’est pas connu mais il est probable qu’elle s’assemble en dodécamère comme c’est le cas pour d’autres phages [31].
Figure 7 : Reconstruction à 19 Å de résolution de la capside du phage T5 à partir d’images de microscopie électronique. La protéine majeure de capside pb8 est représentée en bleu et la protéine de décoration pb10 en rouge.
La protéine majeure de capside pb8 adopte un repliement de type HK97 (du nom de la première structure de protéine de capside résolue : protéine gp5 du phage HK97 [32]). Ce repliement est très répandu pour les protéines de capside icosaédrique. Un modèle de la structure de pb8 basé sur la structure de gp5 est présenté sur la Figure 8 [33]. Le domaine A (pour « axial ») est situé au centre des capsomères et le domaine P (pour « périphérique ») permet des contacts entre capsomères (Figure 8-D).
Figure 8 : pb8 a un repliement de type HK97.
A. Structure de la protéine de capside gp5 du phage HK97. Figure adaptée de [28]. B. Modèle de structure de la protéine pb8 de T5 obtenu par homologie avec la protéine gp5 de HK97 et généré à partir du serveur PHYRE. C. Alignement des séquences protéiques de pb8 et gp5. Les éléments de structure secondaire de gp5 sont indiqués par des flèches (brins bêta) et des cylindres (hélices alpha). Figures B et C adaptées de [33]. D. Modèle d’un hexamère de pb8 de T5, une sous-unité est colorée en rouge.

L’ADN de T5

Le génome de T5 est formé d’une unique molécule d’ADN double brin linéaire de 121 752 bp [34] enroulée dans la capside en couches successives espacées d’environ 24.4 Å [24] (Figure 9). L’ADN est fortement compacté dans la capside (à environ 500 mg/mL [35]) et exerce une pression interne de plusieurs Mégapascals (MPa). La force interne générée par l’ADN compacté dans la capside a été déterminée chez le phage φ29 par Smith et al. [36]. Lorsque le génome complet de φ29 est dans la capside, la force interne est d’environ 57 picoNewtons (pN). La pression interne qui en résulte est estimée à environ 6 MPa [36].
Figure 9 : Image de cryo-EM en coupe de la tête de T5 montrant les couches successives d’ADN à l’intérieur de la capside. Figure adaptée de [24].
Les gènes de T5 sont classés en 3 groupes en fonction du moment auquel ils sont exprimés au cours du cycle viral : les gènes très précoces (« pre-early » en anglais) sont exprimés au tout début de l’infection, les gènes précoces (« early » en anglais) sont exprimés après la prise de contrôle des machineries de biosynthèse bactériennes et permettent, entre autres, la réplication de l’ADN phagique et les gènes tardifs (« late » en anglais) sont exprimés en fin de cycle et codent principalement pour les protéines de structure. La portion d’ADN codant pour les gènes précoces (environ 10 kbp, soit 8 % du génome) est répétée aux deux extrémités de la molécule d’ADN. La majorité des gènes de T5 est codée sur le brin anti-sens.
L’ADN de T5 est interrompu en plusieurs positions sur le brin sens uniquement. Certaines de ces interruptions sont présentes sur le génome de chaque phage T5, alors que d’autres ne sont présentes que dans l’ADN de certains phages. Toutes ces interruptions sont précédées d’une courte séquence riche en cytosines et guanines qui semble être le signal reconnu par l’endonucléase responsable de ces coupures, qui a été récemment identifiée [25], [37]. Cette nucléase est codée par un gène localisé dans la région du génome codant pour les protéines de structure et d’assemblage de la capside de T5 (gène p149 : « nicking-endonuclease » sur la Figure 4 page 9 et la Figure 11-A page 19). La présence de ces interruptions n’est pas indispensable au phage car certains mutants de T5 qui sont dépourvus de cette nucléase sont infectieux. Malgré de nombreuses études menées dans les années 1970-1980, le rôle de ces interruptions, ou l’avantage qu’elles pourraient apporter au phage n’est toujours pas connu [37].
Le génome de T5 contient des gènes codant pour 24 ARN de transfert qui peuvent être délétés sans affecter le cycle viral dans des conditions de laboratoire (mutant T5st0).

Structure de la queue de T5

La queue permet la reconnaissance de la cellule hôte et le transfert de l’ADN phagique dans le cytoplasme de la bactérie. Chez T5, la queue mesure environ 200 nm et est constituée de 10 protéines différentes (Figure 10) [25]. 120 copies de la protéine de tube pb6 forment la structure principale de la queue. La « tape-measure protein » (TMP) pb2 fixe la longueur de la queue et est située dans le tube. 9 copies de la protéine pb1 forment 3 fibres longues trimériques permettant l’adsorption du phage à la surface de certaines souches de E. coli, par fixation réversible de pb1 au lipopolysaccharide (LPS) de la membrane externe [38], [39]. La protéine p132 est associée aux fibres longues et pourrait former le collier d’ancrage de ces fibres à la base du tube. La structure cristallographique de la protéine distale pb9 a été résolue. Pb9 s’assemble en un anneau hexamèrique qui fait la jonction entre le tube et la partie conique [40]. La protéine pb3 forme la partie supérieure du cône, et la protéine pb4 constitue la fibre droite à l’extrémité distale de la queue. Le nombre de copies pour chacune de ces deux protéines est estimé à 3. Une seule copie de pb5, la protéine de fixation au récepteur (RBP : « receptor binding protein » en anglais) reconnaît spécifiquement le récepteur FhuA à la surface de la bactérie hôte. Deux protéines p142 et p143 sont situées à l’extrémité proximale de la queue qui fait la jonction avec la capside. Par analogie avec des protéines équivalentes caractérisées chez d’autres phages comme la protéine gpU du phage lambda (λ) [41], on peut prédire qu’elles sont présentes au nombre de 6 copies et forment un anneau hexamérique.
Figure 10 : Schéma de la queue du phage T5. Figure reproduite de [25].

Le cycle infectieux du bactériophage T5

Il existe chez les phages deux types de cycles infectieux :
– le cycle lytique : après infection de la cellule hôte, de nouveaux virions sont assemblés et libérés rapidement par lyse de la cellule hôte.
– le cycle lysogénique : après infection, le génome du phage peut s’insérer dans le chromosome bactérien (formant ainsi un prophage) ou former un plasmide, se répliquant en même temps que l’ADN bactérien et se propageant dans les cellules filles. Le phage peut ainsi rester en dormance pendant des années jusqu’à ce que des conditions particulières le fassent entrer en cycle lytique. Les phages virulents ne peuvent infecter que par la voie lytique alors que les phages tempérés peuvent emprunter les deux voies.
T5 est un phage virulent incapable d’entrer en lysogénie. Son cycle infectieux comprend l’infection (reconnaissance de la bactérie hôte, injection de l’ADN dans le cytoplasme et détournement des machineries de biosynthèse), la production de nouveaux virions (réplication de l’ADN phagique, production des protéines de structure, assemblage des têtes et des queues) et la lyse cellulaire (éclatement de la bactérie hôte pour libérer les virions nouvellement formés).

L’infection

L’adsorption

L’adsorption désigne la fixation du phage sur sa cellule hôte. Dans un premier temps, T5 se lie de manière réversible sur le lipopolysaccharide (LPS) de la bactérie E. coli via ses fibres longues (voir section I.2.2 page 15) [42]. L’extrémité distale des fibres formées par la protéine pb1 interagit spécifiquement avec la partie antigène O du LPS de certaines souches d’E. coli, permettant ainsi au phage de se déplacer sur la surface de la cellule jusqu’à ce qu’il entre en contact avec son récepteur FhuA. FhuA est une protéine de la membrane externe d’Escherichia coli structurée en tonneau β. C’est un transporteur des ions Fe3+ complexés au Ferrichrome [43], [44]. La protéine pb5, située à l’extrémité de la fibre centrale de la queue de T5 (Figure 10 page 15) reconnait spécifiquement la protéine FhuA et s’y fixe de manière irréversible [45].

Le transfert d’ADN dans la cellule hôte

Passage à travers la paroi bactérienne

Après s’être fixée sur le récepteur FhuA, la protéine pb5 subit un changement conformationnel servant de signal pour l’éjection de l’ADN [46]. Le signal est propagé le long de la queue jusqu’au connecteur tête-queue. Celui-ci s’ouvre permettant d’initier l’éjection de l’ADN sous l’effet de la pression interne de la tête du phage. Les mécanismes moléculaires permettant le passage de l’ADN à travers la paroi bactérienne ne sont pas connus. Toutefois, l’interaction pb5 – FhuA provoque l’ouverture du cône et l’éjection de la « tape measure protein » pb2 (voir section I.2.2 page 15). Celle-ci, avec la protéine de la fibre droite pb4, pourrait être responsable de la perforation de la paroi bactérienne. [25], [47], [48].

Transfert de l’ADN en deux étapes

Le phage T5 a la particularité de transférer son ADN dans la bactérie hôte en deux étapes [49]. La première partie de l’ADN à être transférée est l’ADN FST (pour « first step transfer ») qui comprend les gènes très précoces et représente environ 8 % du génome de T5. Lorsque l’ADN FST est entré dans le cytoplasme de l’hôte, le transfert est interrompu et le reste de la molécule d’ADN reste dans le phage encore adsorbé sur la cellule. Cette interruption dure quelques minutes pendant lesquelles les gènes très précoces codés par l’ADN FST sont exprimés. Les produits de ces gènes prennent le contrôle des fonctions cellulaires de l’hôte en détournant les machineries de biosynthèse et en neutralisant les mécanismes de défenses : l’ADN bactérien est massivement dégradé, la transcription des gènes bactériens est inactivée et l’ARN polymérase est redirigée vers la transcription des gènes viraux, les systèmes de restriction/modification et de réparation de l’ADN sont inactivés. Deux gènes précoces, A1 et A2, sont requis pour la reprise du transfert de l’ADN permettant le déroulement complet du processus infectieux : réplication de l’ADN viral, synthèse des protéines de structure et assemblage de nouveaux virus, puis lyse de la cellule hôte. Les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’arrêt et la reprise du transfert de l’ADN ne sont pas connus [49], [50].

La production de nouveaux virions

Lorsque l’intégralité du génome est entrée dans la bactérie hôte, les gènes précoces (souvent appelés gènes intermédiaires chez les autres phages) sont exprimés pendant 8 minutes environ. Ceux-ci sont principalement responsables de la réplication de l’ADN viral. Enfin, les gènes tardifs, codant principalement pour les protéines de structure, sont exprimés environ 12 minutes après l’infection [50]. La tête et la queue sont assemblées séparément. Les différentes étapes d’assemblage de la tête ont été décrites par Huet et al. [33], mais le processus d’assemblage de la queue est encore mal compris.

La réplication de l’ADN phagique

L’ADN de T5 est répliqué par une ADN polymérase codée par un gène précoce [34] mais le mécanisme de réplication n’a pas encore été élucidé. La présence de concatémères formés de plusieurs unités de génome répétées dans une même molécule d’ADN a été démontrée [51]. Cependant la voie de formation de ces concatémères n’est pas connue. In vitro, l’ADN polymérase de T5 est capable de répliquer à la fois l’ADN circulaire par « rolling circle » et l’ADN linéaire en structures branchées en utilisant des interruption simple brin comme point de départ, l’ADN en amont de l’interruption servant d’amorce [37]. In vivo, les deux formes d’ADN, linéaire et circulaire, ont été  observées à différentes étapes du cycle de T5. Les deux voies de réplications sont donc possibles, et aucune n’a pu être écartée [52].

L’assemblage de la tête

Le processus d’assemblage de la tête de T5 est similaire à celui de nombreux autres phages et virus eucaryotes de type herpès. Il consiste en l’assemblage d’une procapside compacte vide qui est ensuite remplie avec l’ADN viral, ce qui provoque l’expansion de la capside [53].

Assemblage de la procapside

Le processus d’assemblage de la tête de T5 est illustré par la Figure 11 (page 19) [33]. La première étape est l’assemblage d’une capside compacte appelée procapside, ou « prohead ». Cet assemblage implique trois protéines : la protéine portale pb7 (représentée en bleu sur la Figure 11), la protéine majeure de capside sous sa forme précurseur pb8p (en violet) et la protéase de maturation pb11 (en jaune). La protéine portale pb7 s’assemble en dodécamère et forme un anneau. La protéine pb8p s’auto-assemble grâce à son domaine d’échafaudage, aussi appelé « Δ-domain » (symbolisé par un triangle gris). Chez certains autres phages (par exemple P22, T7 ou φ29) et virus eucaryotes (HSV-1), c’est une protéine d’échafaudage indépendante qui permet l’assemblage de la protéine majeure de capside. Ce premier intermédiaire d’assemblage est appelé « prohead I ». La protéase de maturation pb11 se clive elle-même et clive le domaine d’échafaudage de pb8p libérant l’espace intérieur. La régulation de cette maturation protéolytique n’est pas connue, ni le nombre de copies de pb11 impliquées, mais on sait que quelques copies de pb11 clivée à ses deux extrémités restent associées à la capside. Cette procapside vide est appelée « prohead II ».

Table des matières

Partie I : Introduction
I.1. Les Bactériophages
I.1.1. Histoire : découverte des bactériophages
I.1.2. Utilisation des bactériophages en médecine : la phagothérapie
I.1.3. Les bactériophages et la biologie moléculaire
I.1.4. Morphologies et classification des bactériophages
I.2. Structure du bactériophage T5
I.2.1. Structure de la tête de T5
I.2.1.1. Les capsides icosaédriques
I.2.1.2. La capside de T5
I.2.1.3. L’ADN de T5
I.2.2. Structure de la queue de T5
I.3. Le cycle infectieux du bactériophage T5
I.3.1. L’infection
I.3.1.1. L’adsorption
I.3.1.2. Le transfert d’ADN dans la cellule hôte
I.3.1.2.1. Passage à travers la paroi bactérienne
I.3.1.2.2. Transfert de l’ADN en deux étapes
I.3.2. La production de nouveaux virions
I.3.2.1. La réplication de l’ADN phagique
I.3.2.2. L’assemblage de la tête
I.3.2.2.1. Assemblage de la procapside
I.3.2.2.2. Encapsidation de l’ADN et expansion
I.3.2.3. L’assemblage de la queue
I.3.3. La lyse cellulaire
I.4. Les protéines auxiliaires de capside
I.4.1. Les protéines-ciment
I.4.2. Les protéines de décoration
I.4.2.1. Structures connues des protéines de décoration
I.4.2.2. Fonctions des protéines de décoration
I.4.2.2.1. Cas de la double fonction de Psu : stabilisation de la capside et suppression de polarité
I.4.2.2.2. Adhésion réversible à la surface des bactéries grâce aux domaines Ig-like
I.4.2.2.3. Adhésion au mucus de mammifères grâce aux domaines Ig-like
I.5. Utilisation de capsides modifiées : « capsid engineering »
I.5.1. Fonctionnalisation interne et externe de la capside du phage P22
I.5.1.1. Internalisation de composés d’intérêt
I.5.1.1.1. Internalisation de protéines par fusion à la protéine d’échafaudage
I.5.1.1.2. Internalisation de composés chimiques
I.5.1.2. Fonctionnalisation de la surface externe de la capside de P22
I.5.2. Exemple de fonctionnalisation multiple de la capside de T4
I.5.3. Immobilisation d’antigènes sur des capsides de phage
I.6. Sujet de thèse : étude de la protéine de décoration pb10 et de la protéine de fermeture p144 du bactériophage
I.6.1. Capsides vides expansées pour des études in vitro
I.6.2. Travaux préliminaires sur la protéine de décoration pb10
I.6.2.1. pb10 est une protéine monomérique à deux domaines
I.6.2.2. pb10 se fixe à la capside par son domaine N-terminal
I.6.3. La protéine de fermeture p144
I.6.4. Objectifs de thèse
Partie II : Résultats
II.1. Structure de pb10
II.1.1. Tentatives de cristallisation de pb10
II.1.2. Résolution de la structure de pb10 en solution par résonance magnétique nucléaire (RMN)
II.1.2.1. Structures des domaines N- et C-terminaux isolés
II.1.2.2. Structure de la protéine pb10 entière
II.1.3. Comparaison avec les autres protéines de décoration des phages de la famille de T5 61
II.1.4. Homologies avec des protéines de structure connue
II.2. Interaction pb10 – capside
II.2.1. La protéine de décoration pb10 se fixe sur les capsides de T5 avec une très forte affinité
II.2.1.1. Expériences de retard sur gel (EMSA)
II.2.1.2. Détermination de l’affinité par résonance plasmonique de surface (SPR)
II.2.1.2.1. Préparation de la surface et du matériel
II.2.1.2.2. Les cycles de SPR
II.2.1.2.3. Régénération de la surface
II.2.1.2.4. Analyse qualitative des courbes d’association et dissociation
II.2.1.2.5. Analyse cinétique
II.2.1.3. Etude de l’effet coopératif de la décoration des capsides de T5
II.2.2. Exploration de l’interface d’interaction entre pb10 et la capside de T5
II.2.2.1. Interaction pb10-capside en présence de fortes concentrations en NaCl
II.2.2.2. Affinité des mutants pour la capside de T5
II.2.2.3. Vérification du repliement correct des mutants
II.2.2.4. Une autre approche : la mutagenèse aléatoire
II.2.2.5. Bilan des mutations
II.3. Fonction de pb10
II.3.1. Rôle dans l’adsorption sur l’hôte
II.3.2. Stabilisation de la capside
II.3.2.1. Stabilisation des capsides vides : expériences de DSC
II.3.2.2. Influence de pb10 sur la résistance des phages T5 à la chaleur : mesure de la perte d’ADN par fluorescen
II.3.2.3. Mécanisme de sortie de l’ADN des phages chauffés
II.4. Applications : « capsid engineering »
II.4.1. La fusion n’affecte pas le repliement
II.4.2. La fusion n’affecte pas l’affinité pour la capside
II.5. Production et purification de la protéine de fermeture
II.5.1. Clonages avec HisTag et site de protéolyse
II.5.2. Optimisation des conditions de production
II.5.3. Optimisation des conditions de purification
Conclusions
Perspectives
Partie III : Matériels et Méthodes
III.1. Bactéries et phages utilisés
III.1.1. Souches bactériennes d’Escherichia coli utilisées
III.1.2. Phages T5 utilisés
III.1.3. Mutations ambre et souches suppressives
III.2. Tampons
III.3. Clonages et mutagenèses
III.3.1. Clonage conventionnel avec enzymes de restriction
III.3.2. Clonage par PCR (« FastCloning ») : protéines de fusion avec pb10
III.3.3. Mutagenèse dirigée
III.3.4. Mutagenèse aléatoire
III.4. Surproduction de protéines
III.4.1. Culture en milieu riche
III.4.2. Culture en milieu minimum
III.5. Purification de protéines
III.5.1. Cassage des bactéries
III.5.2. Chromatographie d’affinité sur colonne de métal immobilisé (IMAC)
III.5.3. Chromatographie d’échange d’ion
III.5.4. Chromatographie d’exclusion de taille (SEC)
III.6. Production et purification de phages et de particules phagiques
III.6.1. Production de phages : infection à faible multiplicité d’infection
III.6.2. Production de particules phagiques : infection à forte MOI
III.6.3. Purification des phages et particules phagiques
III.6.3.1. Purification des phages et capsides pleines d’ADN sur gradient de CsCl
III.6.3.2. Purification des procapsides vides
III.6.3.3. Expansion des capsides vides
III.7. Décoration de capsides in vitro
III.8. Diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS)
III.9. Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
III.10. Calorimétrie Différentielle à balayage (DSC)
III.11. Dichroïsme circulaire (CD)
III.12. Résonance plasmonique de surface (SPR)
III.13. Microscopie électronique à coloration négative
III.14. Tests d’adsorption
III.15. Thermo-fluorescence (FTSA)
III.16. Ultracentrifugation analytique (UCA)
Annexes
A. Séquences nucléotidiques et protéiques
A.1. Le plasmide pET28 (Novagen)
A.2. Constructions de pb10 et des domaines N- et C-terminaux
A.2.1. Plasmide pET28b-pb10
A.2.2. Séquences protéiques de pb10 entière et des domaines N- et C-terminaux
A.3. Protéines de fusion pb10 + mCherry
A.4. Constructions de p144
B. Propriétés des protéines et capsides utilisées
B.1. Propriétés des protéines utilisées
B.2. Masses molaires des capsides vides et pleines
C. Propriétés des tampons utilisés
D. Article
Références bibliographiques

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