Les bactéries intracellulaires obligatoires

Les bactéries intracellulaires obligatoires

Signalisation cellulaire, survie dans la vacuole intracytoplamique et lyse cellulaire

Les protéines à répétition ankyrines ou ankyrin-repeated proteins

Les motifs ankyrines sont des structures protéiques bien connues chez les eucaryotes pour leurs implications dans les connexions des membranes cellulaires au cytosquelette. Ils sont constitués de deux hélices alpha séparées par une boucle et peuvent être répétés en tandem plusieurs fois. Même s’ils sont relativement rares chez les procaryotes on retrouve des protéines présentant ces mêmes motifs ankyrines (notamment chez E. chaffeensis).

Introduction

Pseudomonas aeruginosa et les Rickettsiales en général) (Wakeel et al., 2010). La fonction de ces protéines atypiques chez les bactéries est encore largement inconnue mais elles sont fortement suspectées de participer aux interactions des bactéries avec leurs hôtes, notamment via la modulation transcriptionnelle des gènes de la cellule hôte en se fixant directement à la chromatine. Elles sont impliquées dans le cycle cellulaire, l’organisation du cytosquelette, la toxicité ou encore la réponse inflammatoire (Wakeel et al., 2010). Les Rickettsiales séquencées posséderaient au moins deux protéines à motifs Ankyrines dans leur génome, par exemple les orthologues Ank200 et AnkA chez E. chaffeensis et A. phagocytophilum, qui sont secrétées par le SST4 (Rikihisa and Lin, 2010). Chez Ehrlichia ruminantium l’analyse du génome a pu révéler la présence de quatre protéines à motifs ankyrines, dont les deux CDS orthologues ERGA 04060 / ERWE 04110 et ERGA 06440 / ERWE 06530 chez les souches Gardel et Welgevonden respectivement.

Inhibition de la fusion phagosome-lysosome

Semblable au modèle Chlamydia, les bactéries du genre Ehrlichia modifient leur phagosome infectieux, appelé aussi inclusion ou vacuole, en exprimant très tôt leurs propres protéines à la surface des phagosomes afin d’éviter l’apoptose des cellules. Les bactéries survivent en position intracellulaire dans les vacuoles infestées en inhibant la fusion phagolysosomiale.
Les premières études réalisées sur ce phénomène d’échappement supposaient que l’inhibition de la fusion phagosome-lysosome était étroitement liée à l’activité métabolique de la bactérie (Brouqui, 1997; Wells and Rikihisa, 1988). Ainsi, chez E. risticii et E. sennetsu, en bloquant la synthèse des protéines bactériennes par l’action des tétracyclines, on restaure la fusion phagolysosomiale (Wells and Rikihisa, 1988; Brouqui, 1997). Bien que le mécanisme précis ne soit pas clair, il est probable que les protéines bactériennes exprimées à la surface de ces phagosomes infectieux soient responsables du blocage de la fusion avec les compartiments d’endocytose. Dans les cellules eucaryotes, la fusion des membranes intracellulaires est provoquée par des membres de la famille des protéines SNARE. Ces protéines sont conservées chez tous les eucaryotes et sont présentes à la surface de tous les compartiments de sécrétion. Lors de la fusion membranaire, des t-SNARE (t pour target) présents sur les organites cibles vont interagir spécifiquement avec les V-SNARE présents sur les vésicules

Introduction

plasmiques. Au cours des dernières années, un nombre croissant de SNARE-like protéines ont été identifiées notamment chez Chlamydia et Legionella (Paumet et al., 2009). Ces protéines existent chez Ehrlichia et sont responsables de l’inhibition de la fusion phagolysosomiale car elles inhibent directement l’action des protéines SNARE eucaryotes.

L’échappement au stress oxydatif

Lorsqu’une cellule eucaryote (monocytes, macrophages, neutrophiles) est infectée par une bactérie, elle augmente sa consommation en oxygène (poussée respiratoire) produisant ainsi des dérivés oxygénés, les anions superoxydes (O2-), les peroxydes d’hydrogène (H2O2) (ROS, Reactive Oxygen Species) en réponse à l’agression. La formation du H2O2 se fait par dismutation spontanée ou par le biais d’enzymes, superoxydes dismutases (SOD). L’H2O2 etO2- ne sont pas des antibactériens puissants mais ils peuvent se transformer en radicaux libres qui vont agir sur l’intégrité de la membrane cellulaire ou bactérienne. Les anions superoxydes en association avec des produits de dégradation de la L-arginine (autre mécanisme antibactérien) vont former des peroxynitrites qui sont hautement toxiques et ont une action antimicrobienne importante.
Les pathogènes intracellulaires possèdent des systèmes anti-oxydants qui vont être capables de détecter une modification de l’homéostasie redox, puis de mettre en place la réponse la plus appropriée pour la corriger. Le mécanisme de défense contre les superoxydes, composé de superoxyde dismutases (SOD) existe chez les bactéries. Les Rickettsiales y compris Ehrlichia ruminantium possèdent la superoxyde dismutase (SodB) qui est une enzyme antioxydante majeure. Leur expression est induite en présence de H2O2 (Barloy-Hubler et al., 2004). Chez E. coli, la lutte contre les peroxydes, les anions superoxydes et les composés non radicalaires implique deux régulons différents : le régulon OxyR et le régulon SoxR. Le régulon OxyR contrôle la plupart des anti-oxydants en réponse aux peroxydes et à l’oxyde nitrique et SoxR contrôle la réponse aux anions superoxydes. OxyR, est un régulateur transcriptionnel de la famille de LysR, et un senseur du stress oxydatif grâce à deux protéines particulières (Trx1 et Trx2), qui peuvent être oxydées par H2O2. La forme oxydée d’OxyR induit l’expression de ses gènes cibles et réprime sa propre expression. OxyR peut donc être soit un activateur, soit un répresseur, selon son état oxydatif (Zeller and Klug, 2006).

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Table des matières

Résumé
Liste des figures
Liste des tableaux
CHAPITRE I. Introduction
1. Les bactéries intracellulaires obligatoires
2. Notre modèle Ehrlichia ruminantium
2.1. Caractéristiques génomiques d’Ehrlichia ruminantium
2.1.1. Souches d’E. ruminantium Gardel et Welgevonden virulentes
2.1.2. Souche d’E. ruminantium Gardel atténuée
2.2. Morphologie et cycle de développement d’Ehrlichia ruminantium
3. Etude des mécanismes connus intervenants dans la pathogenèse des bactéries intracellulaires
3.1. Internalisation, invasion et mobilité par polymérisation d’actine
3.2. Systèmes de sécrétions (SSTs)
3.2.1. Les systèmes de sécrétion Sec-dépendant
3.2.2. Les systèmes de sécrétion Sec-indépendant
3.3. Signalisation cellulaire, survie dans la vacuole intracytoplamique et lyse cellulaire
3.3.1. Les protéines à répétition ankyrines ou ankyrin-repeated proteins
3.3.2. Inhibition de la fusion phagosome-lysosome
3.3.3. L’échappement au stress oxydatif
3.3.4. Le stress osmotique
3.3.5. Système d’acquisition du fer, régulation et homéostasie
3.4. Autres effecteurs
4. L’aire de la post-génomique: Profil d’expression des Rickettsiales
4.1. Innovations scientifiques : caractérisation des agents pathogènes intracellulaires
4.2. La technique d’expression in vivo ou In Vivo Expression Technique (IVET)
4.3. La mutagenèse à l’aide de transposon portant un marqueur-signature ou Signature tagged
mutagenesis (STM)
4.4. Hybridation soustractive suppressive (SSH)
4.5. Selective Capture of Transcribed Sequences (SCOTS)
4.6. Puces à ADN
4.6.1. Principe
4.6.2. Les limites pour l’analyse de l’expression de gènes de bactéries intracellulaires
obligatoires
5. Etude de l’expression des gènes de la famille multi-génique map d’Ehrlichia ruminantium
chez l’hôte et le vecteur
6. Présentation de la Cowdriose
6.1. La Cowdriose et agent pathogène
6.2. Répartition géographique
6.3. Les espèces affectées
6.4. Transmission
6.5. La maladie : symptômes et pathologie
6.5.1. Symptômes
6.5.2. Pathologie : les lésions
6.6. Diagnostics.
6.7. L’immunité
6.8. Contrôle de la maladie
7. Problématique et objectifs
CHAPITRE II. Protocole expérimental et stratégies d’étude: Etapes préalables nécessaire à l’analyse du transcriptome d’Ehrlichia ruminantium
1. Préparation du matériel biologique : Les souches Ehrlichia ruminantium Gardel virulente et atténuée en culture
1.1. Contexte
1.2. Matériels et Méthodes
1.2.1. Production des échantillons biologiques et obtentions des ADN bactériens et ARN totaux
1.2.2. Synchronisation de l’infection et protocole de collecte des ARNs
1.2.3. Viabilité et quantification bactérienne par qPCR
1.2.4. Colorations et observations
1.3. Résultats
1.3.1. Viabilité et quantification bactérienne par qPCR
1.3.2. Colorations et observations par microscopie
1.4. Conclusion
2. Vérification expérimentale de la virulence et de l’atténuation des souches Gardel in vivo
2.1. Contexte
2.2. Matériels et méthodes
2.3. Résultats
2.4. Conclusion
3. Evaluation de la stabilité des gènes constitutifs d’Ehrlichia ruminantium : Recherche de gènes normalisateurs pour la validation par PCR en temps réel des gènes d’intérêt détectés en
microarrays
3.1. Contexte
3.2. Matériels et méthodes
3.2.1. Les gènes sélectionnés
3.2.2. Dessin des amorces
3.2.3. Extraction d’ARN puis conversion en ADN-complémentaire (cDNA)
3.2.4. Test des amorces et efficacité de la qPCR
3.2.5. Quantification du nombre de copies d’ADN d’ER par qPCR Taqman map1
3.2.6. Mesure du niveau d’expression des gènes candidats
3.3. Résultats
3.3.1. Conditions optimales de qPCR et efficacité
3.3.2. Quantification du nombre de copies d’ADN d’ER par qPCR Taqman map1
3.3.3. Evaluation de la stabilité des gènes constitutifs par qRTPCR
3.4. Conclusion
4. Adaptation de la méthode SCOTS à la bactérie Ehrlichia ruminantium et validation sur puces
à ADN pour l’analyse du transcriptome
4.1. Contexte
4.2. Validation de la méthode SCOTS
4.3. Résultats complémentaires : Hybridation de l’ADN génomique des souches Gardel et Sénégal
(virulente et atténuée) sur les puces à ADN
5. Conclusion
CHAPITRE III. Analyse du transcriptome de la bactérie Ehrlichia ruminantium
1. Contexte
2. Matériels et méthodes
2.1. Production des échantillons biologiques in vitro: souches Gardel virulente et Gardel atténuée
2.2. Capture sélective des transcrits d’Ehrlichia ruminantium par SCOTS
2.3. Puces à ADN pangénomique d’Ehrlichia ruminantium: description et analyse statistique
2.4. Acquisition et analyse de l’image
2.5. Analyse statistique des résultats
2.6. Annotation des CDS différentiellement exprimés
2.7. Validation des gènes d’intérêt par qRTPCR
3. Résultats
3.1. Comparaison des cinétiques de croissance bactérienne pour l’analyse du transcriptome
3.2. Analyse du transcriptome d’E. ruminantium par microarrays
3.2.1. Analyse globale et répartition des catégories de gènes
3.2.2. Identification des gènes différentiellement exprimés par Ehrlichia ruminantium au cours
des différentes phases du cycle de développement
3.2.3. La famille multigénique map
3.2.4. Le cluster recB
3.2.5. Transcriptome d’E. ruminantium à partir des transcrits SCOTS 0x à T3
3.3. Validation des CDS d’intérêts par qRTPCR
CHAPITRE IV. Discussion générale
1. Expression des gènes impliqués dans les fonctions métaboliques
1.1. Biogénèse des ribosomes et la traduction
1.2. La production d’énergie
1.3. Réparation et réplication de l’ADN
2. Expression des gènes impliqués dans la survie intracellulaire : échappement aux systèmes de défense de l’hôte
2.1. Les stress oxydatifs, thermiques et osmotiques
2.2. Acquisition de fer, magnésium et autres éléments
2.3. Transporteurs ABC: SST1
2.4. Inhibition de la fusion phagolysosomiale
2.5. Résistance aux antibiotiques
3. La famille multigénique map
4. Le cluster recB
5. Virulence bactérienne
6. Les gènes de fonction inconnue
CHAPITRE V. Conclusions et perspectives
ANNEXES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Posters présentés dans les congrès internationaux au cours de la thèse