LES BACTÉRIES ENTÉROPATHOGÈNES : SALMONELLA ET SHIGELLA

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L’épidémiologie

Les infections à Salmonella représentent une cause majeure de gastro-entérites aiguës dans le monde entier avec une incidence évaluée à 2.8 milliards de cas de diarrhées chaque année. L’épidémiologie des infections à NTS diffère tout à fait de celle de la fièvre typhoïde et paratyphoïde.

Les Salmonellanon-typhoïdales

Les infections à salmonelles non-typhoïdales sont une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde entier tant chez les enfants que chez les adultes. Les données épidémiologiques de pays en voie de développement sont difficiles à établir du fait de systèmes de surveillance insuffisants dans beaucoup de ces pays. Selon une étude réalisée par Crump et Mintz en 2010 (28), les infections à NTS causeraient plus de 90 millions de maladies et environ 155 000 décès chaque année dans le monde entier. En Afrique, l’incidence annuelle est évaluée à 175 à 388 cas pour 100000 enfants âgés de 3 à 5 ans (29,30)et 2000 à 7500 cas pour100 000 adultes infectés par le VIH(31-33). Aux Etats-Unis, des études montrent que l’incidence des infections à NTS est de 17.6 cas pour 100 000 personnes et que les enfants de moins de 5 ans ont un taux d’incidence quatre fois plus élevé, de 69.5 cas d’infections pour 100 000 enfants (34).
Dans les pays développés, les épidémies d’infections à NTS sont généralement associées aux volailles et sont transmises par des produits alimentaires contaminés (des oeufs crus ou insuffisamment cuits, de la viande, du lait et d’autres produits frais, comme des légumes). A l’inverse, dans les pays en voie de développement (par exemple les pays d’Afrique et d’Asie), ces infections semblent être plutôt associées aux contaminations d’eau. La transmission peut également se faire par contact avec des animaux domestiques (et même par la manipulation de leur nourriture) tels que des chats et des chiens, des rongeurs (des souris, des rats), ainsi que des reptiles et des amphibiens (le plus généralement des tortues, des grenouilles et des serpents)(18).
Les symptômes des infections à NTS dépendent du nombre de bactéries ingérées. Il faut 106 à 108 de bactéries pour qu’un hôte humain sain développe une maladie symptomatique. Les patients
présentent souvent des nausées, de la fièvre, des vomissements, des diarrhées aqueuses et des douleurs abdominales. Chez les enfants en bas âge ou immunodéprimés, la maladie peut être causée par l’ingestion d’un inoculum bactérien plus faible. Dans ces cas, les patients immunodéprimés peuvent développer aussi des signes cliniques non spécifiques (par exemple une pneumonie, une splénomégalie, une hépatomégalie et autres) (35). Après l’infection et sans traitement antimicrobien, les bactéries sont excrétées pendant environ 4 à 6 semaines. L’immunodépression et la thérapie antimicrobienne peuvent prolonger l’excrétion fécale des bactéries(18).

Les Salmonella typhoïdales

L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime à 16 à 33 millions les cas de fièvres typhoïdes et paratyphoïdes causant 500 000 à 600 000 décès annuellement dans le monde (18,36). L’Asie Centrale, l’Asie du Sud-Est et l’Afrique du Sud sont les régions les plus touchées par les fièvres typhoïdes et paratyphoïdes (plus de 100 cas pour 100 000 personnes par an)(37,38). Cette incidence est plus faible (10-100 cas pour 100 000 personnes par an) en Amérique latine, le reste de l’Asie et de l’Afrique. En Europe et en Amérique du Nord, l’incidence est la plus basse (0.2 pour 100 000 personnes en France) et cette baisse est attribuée à la disposition d’eau propre et de systèmes d’eaux usées plus sophistiqués (22,39). Globalement, l’incidence des fièvres paratyphoïdes est considérablement plus faible que celle des fièvres typhoïdes. Par exemple, en Inde, la prévalence de la fièvre paratyphoïde est au moins 10 fois plus faible que celle de la fièvre typhoïde (40).
L’homme est le seul hôte naturel et le réservoir pour Salmonella Typhi et Paratyphi, qui sont capables de survivre dans n’importe quel type d’eau pendant des jours ainsi que dans les oeufs et les huîtres pendant des mois. L’infection arrive souvent par l’ingestion de nourriture ou d’eau contaminées avec des excréments humains (103 à 106 de bactéries sont suffisantes pour provoquer une infection chez l’homme par S. Typhi). Celle-ci provoque des signes cliniques comme la fièvre plus ou moins associée à des signes digestifs (diarrhées, constipation, hémorragies intestinales et perforations, maux de tête, etc.) et des signes biologiques (une leucopénie). La transmission s’effectue par contact avec des gens infectés, malades ou porteurs sains, ayant une hygiène corporelle limitée (en particulier absence de lavages de mains) (18).

LE GENRE SHIGELLA

Définition et nomenclature

Les Shigella spp. appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae et sont des bactéries Gramnégatif, non-sporulées, non-capsulées, immobiles, anaérobies facultatifs, en forme de tige (Figure 2).
Elles sont des pathogènes intracellulaires facultatifs qui montrent une grande spécificité pour les primates et l’homme. Le premier rapport sur l’isolement et la caractérisation des bactéries causant la dysenterie bacillaire, nommées plus tard Shigella, a été publié par Kiyoshi Shiga à la fin du 19èmesiècle. Dans des études d’hybridation de l’ADN, les espèces d’E. coli et de Shigella, qui sont extrêmement proches, ne peuvent pas être différenciées au niveau polynucléotidique mais que par la présence du plasmide de virulence chez Shigella(41). Afin de distinguer les souches pathogènes de celles moins pathogènes ou non-pathogènes, le genre Shigella est défini sur la base des caractéristiques biochimiques, sérologiques et cliniques(42). On distingue quatre espèces de Shigella : S. dysenteriae (séro-groupe A), S. flexneri (séro-groupe B), S. boydii (séro-groupe C) et S. sonnei (séro-groupe D). Dans les pays en voie de développement,S. flexneri et, dans une moindre mesure, S. sonnei sont endémiques et causent la majorité de toutes les shigelloses. Quant à S. dysenteriae, elle est épidémique et représente la forme la plus sévère responsable de la majorité des cas mortels de shigellose (43). En Europe, S. sonnei est responsablede 61% des shigelloses observées (44).
Figure 2 : Shigella flexneri vue au microscope électronique. Adaptée de(45).

L’épidémiologie

La shigellose reste un vrai problème de santé publique, particulièrement dans les pays en voie de développement à niveau d’hygièneinsuffisant (46). A l’échelle mondiale, l’incidence des shigelloses est la plus élevée chez les enfants de 1 à 4 ans. Dans les cas d’épidémies de S. dysenteriae,dans les pays en développement, toutes les tranches d’âge sont affectées et sont responsables d’approximativement 5% de tous les épisodes diarrhéiques chez les enfants de moins de 5 ans et jusqu’à 75% de décès(47).Le nombre d’épisodes annuels de Shigella a été évalué à 164.7 millions dans le monde entier, dont 163.2 millions dans les pays en voie de développement (avec 1.1 millions de décès) et 1.5 millions dans les pays industrialisés(5, 43, 47).
Les shigelles sonttransmises par voie oro-fécale soit par l’intermédiaire de personnes malades soit
par l’ingestion de nourriture et d’eau contaminées. Ces bactéries sont extrêmement infectieuses puisque seulement 10 à 100 micro-organismes ingérés par voie orale sont suffisants pour causer la maladie chez l’Homme (48).
La shigellose, appelée aussi dysenterie bacillaire, est une infection invasive intestinale aiguë, dont les signes cliniques peuvent s’étendre d’une diarrhée aqueuse modérée ou sévère à une rectocolite
infectieuse. Ces signes cliniques varient selon l’espèce de shigelle, l’âge et le statut immunitaire de l’hôte, et la présence de facteurs de risque. La période d’incubation est en moyenne de 1 à 4 jours et jusqu’à 8 jours avec S. dysenteriae(49). Les symptômes commencent à apparaître dans les 24-48 heures après l’ingestion des bactéries. Les sujets atteints se plaignent de crampes abdominales parfois accompagnées de vomissements, de selles très importantes, sanglantes, purulentes glaireuses, et parfois hémorragiques ainsi que de fièvre, de fatigue, de malaise et d’anorexie(50). Dans beaucoup de pays en voie de développement, l’immunodéficience associée au VIH est responsable des manifestations cliniques les plus sévères de Shigella, comprenant une maladie intestinale persistante ou récurrente et une bactériémie(51). L’infection à Shigellapeut devenir mortelle chez ces patients immunodéprimés ou si des soins médicaux adéquats ne sont pas mis en place chez les sujets atteints.

LES FACTEURS DE VIRULENCE ET LA PATHOGÉNICITÉ

Les gènes et les îlots de pathogénicité de Salmonella

Le séquençage du génome entier de Salmonellaa permis l’identification et la caractérisation de beaucoup de gènes impliqués dans la pathogénèse de la bactérie. Ceci a révélé que Salmonella a acquis certains îlots de pathogénicité par transfert génétique horizontal. Les protéines codées par ces îlots de pathogénicité aident la bactérie à envahir, se reproduire et disséminer à l’intérieur de son hôte (Figure 3). L’invasion de la bactérie ainsi que sa survie intracellulaire sont gouvernées par au moins 60 gènes de virulence répartis sur plusieurs îlots de pathogénicité du chromosome bactérien.

Le plasmide de virulence et les toxines de Shigella

Les informations génétiques constituant les génotypes de Shigella spp. sont portées par un chromosome bactérien et un grand plasmide de virulence de 230kb appelé pWR100 qui code pour une machinerie moléculaire nécessaire à l’invasion et à la survie intracellulaire de la bactérie. L’élément central des facteurs de virulence est le SST3 qui permet aux bactéries de transférer un ensemble d’environ 25 protéines du cytoplasme bactérien directement dans la cellule eucaryote, où ces protéines effectrices vont interférer avec des processus cellulaires divers (57)(les caractéristiques du SST3 seront décrites dans la partie suivante). Les gènes indispensables pour l’entrée des bactéries dans les cellules sont tous regroupés sur la région 31 kb appelée « entry region » du plasmide pWR100 (Figure 5). Cette région code pour les composants et les substrats du SST3de Shigella (ou Mxi-Spa T3SS) (58).
Figure 5 : Région 31 kb ou « entry region » du plasmide de virulence pWR100 de 230 kb codant pour les composants et les protéines effectrices du SST3 de S. flexneri (ou Mxi-Spa T3SS : Type 3 Secretion System) (59).
L’évolution rapide des Shigella spp. pathogènes à partir d’E. colinon-invasives, leurs ancêtres non-pathogènes, est liée aussi bien au transfert génétique horizontal qu’à l’incorporation chromosomique de grandes entités génétiques mobiles portant un ou des gènes de virulence nommés PAI ou îlots de pathogénicité et qui sont portés par le plasmide de virulence. D’autres îlots de pathogénicité appelés SHI pour « Shigella pathogenicity islands » ont été identifiés sur le chromosome bactérien (SHI-1, 2 et 3). La présence et la localisation de ces SHI diffèrent entre les souches de Shigella et peuvent contribuer à la variation des phénotypes de virulence. On distingue aussi la présence de SHI-O contenant des gènes modifiant la structure des antigènes O du lipopolysaccharide bactérien (LPS) qui est un facteur de virulence crucial dans l’infection à Shigella. D’autres gènes de résistance aux antibiotiques sont également identifiés dans le génome de Shigella (58,60).
Pour compléter, tous les gènes de virulence sont sous le contrôle d’un réseau de régulation qui répond aux changements environnementaux suite à l’entrée des bactéries dans les cellules hôtes. Le facteur majeur induisant l’expression des gènes du plasmide de virulence est le changement de température (passage à 37°C) après l’ingestion par l’hôte. Les facteurs supplémentaires qui peuvent influencer aussi l’expression du plasmide de virulence sont le pH, l’osmolarité et la concentration des ions (61).
Enfin, certaines souches de Shigella peuvent produire des entéro-toxines intervenant dans leurs mécanismes d’infection : SHET-1(pour Shigella enterotoxin 1) présente uniquement chez S. flexneri
2a, SHET-2 (pour Shigella enterotoxin 2) présente chez plusieurs sérotypes de Shigella et la Shigatoxine (Stx)sécrétée exclusivement par S. dysenteriae. Cette dernière est neurotoxique, cytotoxique et entéro-toxique (62).
ShigellacommeSalmonellaet d’autres bactéries pathogènes Gram (-) profitent des processus cellulaires de l’hôte afin d’établir l’infection. Les bactéries ciblent directement les voies de signalisation intracellulaires de la cellule hôte en transportant des protéines effectrices à travers trois membranes : la membrane interne bactérienne (IM), la membrane externe bactérienne (OM) et la membrane cytoplasmique de l’hôte (HM). Le SST3 de S. flexneri ou Mxi-Spa T3SS et les deux SST3 de S. Typhimurium codés par SPI-1 ou SPI-2 sont des représentants sophistiqués des machines moléculaires d’exportation qui transfèrent des protéines dans le cytoplasme cellulaire de l’hôte en une seule étape(63).
Le SST3 appelé aussi injectisome est composé de plus de 20 protéines dont la plupart est incorporée dans la membrane bactérienne et forme des oligomères.L’architecture du SST3 de différents genres bactériensmontre une certaine adaptation spécifique de l’hôte mais partage une structure principale conservée qui est étroitement semblable au flagelle (64).

L’architecture du SST3

L’injectisome de S. flexneri (Figure 6, partie gauche) et celui de S. Typhimurium codé par SPI-1 (Figure 6, partie droite) sont très similaires et jouent un rôle primordial dans la pathogénicité de ces
bactéries. Le SST3 est composé de 3 parties principales : (i) une aiguille de sécrétion (extracellulaire) avec une coiffe à son extrémité, (ii) un corps basal inséré dans les membranes bactériennes IM et OM, et (iii) un compartiment intracellulaire nommé « C ring » (pour Cytoplasmic ring).
Figure 6 : Vue structurale du SST3 ou injectisome de S. flexneri (à gauche) et de S. Typhimurium (à
droite). Adaptée de(58,65).
Le complexe de l’aiguille (ou Needle Complex NC) consiste en une structure cylindrique semblable au corps basal du flagelle. Il est composé de deux paires d’anneaux qui recouvrent les membranes bactériennes IM et OM aboutissant à une tige appelée aiguille de sécrétion. Le corps basal assure l’ancrage de l’aiguille aux membranes bactériennes internes et externes en traversant le périplasme (66).

Table des matières

INTRODUCTION GÉNÉRALE
CHAPITRE I : LES BACTÉRIES ENTÉROPATHOGÈNES : SALMONELLA ET SHIGELLA
A. GÉNÉRALITÉS
B. LE GENRE SALMONELLA
1. Définition et nomenclature
2. L’épidémiologie
a. Les Salmonella non-typhoïdales
b. Les Salmonella typhoïdales
C. LE GENRE SHIGELLA
1. Définition et nomenclature
2. L’épidémiologie
D. LES FACTEURS DE VIRULENCE ET LA PATHOGÉNICITÉ
1. Les gènes et les îlots de pathogénicité de Salmonella
2. Le plasmide de virulence et les toxines de Shigella
E. LE SYSTÈME DE SÉCRÉTION DE TYPE 3
1. L’architecture du SST3
2. L’assemblage du SST3
F. L’INTERACTION BACTÉRIE – CELLULE HÔTE
1. L’adhésion
2. L’invasion cellulaire
3. La survie intracellulaire
CHAPITRE II : LES RÉPONSES IMMUNITAIRES INDUITES SUITE AUX INFECTIONS À SALMONELLA ET SHIGELLA
A. RAPPEL SUR LES INFECTIONS BACTÉRIENNES
1. L’immunité innée et adaptative
2. La réponse immunitaire de l’intestin contre les infections entériques
B. LES DÉFENSES IMMUNITAIRES CONTRE SALMONELLA
1. La réponse immunitaire innée
2. La réponse immunitaire cellulaire adaptative
C. LES DÉFENSES IMMUNITAIRES CONTRE SHIGELLA
1. La réponse immunitaire innée
2. La réponse immunitaire adaptative humorale et cellulaire
CHAPITRE III : L’ÉTAT DES LIEUX DES APPROCHES VACCINALES DÉVELOPPÉES CONTRE SALMONELLA ET SHIGELLA
A. LES VACCINS CONTRE SALMONELLA
1. Les vaccins du passé et présents
2. Les vaccins du futur
B. LES VACCINS CONTRE SHIGELLA
1. Les vaccins vivants de virulence atténuée
2. Les vaccins à base de sous-unités
C. LA VACCINATION PAR VOIE ORALE
CHAPITRE IV : LES ANTICORPS THÉRAPEUTIQUES
A. LES ANTICORPS MONOCLONAUX
1. Définition et structure
2. Les différents types d’AcM
B. LES MÉCANISMES D’ACTION
C. L’ÉVOLUTION DES ANTICORPS THÉRAPEUTIQUES ET LES MALADIES INFECTIEUSES
D. LES ANTICORPS DIRIGÉS CONTRE LE SST3
E. LES LIMITES DE L’UTILISATION D’ANTICORPS MONOCLONAUX OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THÈSE
MATÉRIEL ET MÉTHODES
I.LE MATÉRIEL BIOLOGIQUE UTILISÉ
1. Les bactéries
2. Les protéines recombinantes
3. Les anticorps monoclonaux
II. LE CLONAGE DES GÈNES CODANT LES PROTÉINES DA LA COIFFE ET L’AIGUILLE
1. L’extraction de l’ADN plasmidique
2. L’amplification de l’ADN par PCR
3. La purification des produits PCR
4. Le clonage dans le vecteur pET-22b (+)
5. La transformation des bactéries compétentes
6. Le criblage des clones de bactéries recombinantes
7. La purification et la vérification des plasmides recombinants
III. LA PRODUCTION DES PROTÉINES RECOMBINANTES
1. Le test d’expression des protéines en corps d’inclusion avec induction à l’IPTG
2. La purification des protéines recombinantes par chromatographie d’affinité sur colonne de nickel
IV.LA PRODUCTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX
1. L’immunisation des souris avec les immunogènes
2. L’obtention des hybridomes par fusion des lymphocytes B avec un myélome
3. L’obtention des anticorps monoclonaux dans le liquide d’ascite et isotypage
4. La purification des anticorps monoclonaux par chromatographie d’affinité sur protéine A
V.LES ANALYSES BIOCHIMIQUES
1. L’électrophorèse et la coloration au bleu de Coomassie
2. L’immuno-empreinte (« Western-Blot »)
3. La détermination des épitopes de reconnaissance des anticorps
VI.LES DOSAGES IMMUNOMÉTRIQUES
1. La préparation du matériel pour les tests EIA
a. Les tampons utilisés
b. La préparation des phases solides ou le « coating »
c. Les traceurs
d. Le réactif d’Ellman
2. Les tests immuno-enzymatiques ou EIA
a. Le test ELISA indirect pour le dosage d’immunoglobulines
b. Le test ELISA indirect
c. Le test ELISA sandwich
d. Les quantifications et les analyses statistiques
3. Le test ELISPOT ou « Enzyme-Linked ImmunoSPOT »
VII.L’EXPÉRIMENTATION ANIMALE
1. Les tests in vivo
a. La détermination des doses létales 50 des bactéries utilisées pour les infections
b. Les immunisations pour les protections contre les infections à Salmonella et Shigella
c. L’efficacité de protection des anticorps monoclonaux dirigés contre IpaD/SipD contre des infections à Salmonella et Shigella (immunothérapie passive)
2. Les prélèvements d’organes et de cellules sanguines
a. Les ponctions sanguines
b. Les prélèvements des poumons
RÉSULTATS
PARTIE A : LA VACCINATION AVEC DES PROTÉINES DU SYSTÈME DE SÉCRÉTION DE TYPE III DE SALMONELLA ET SHIGELLA
I. LA VACCINATION CONTRE SALMONELLA TYPHIMURIUM ET SHIGELLA FLEXNERI
1. La production et la purification des protéines recombinantes du SST3
2. Les immunisations avec les protéines du SST3 de S. Typhimurium
a. La cinétique de la réponse humorale en IgG et IgA dans les sérums
i. Les réponses Ig(G+M)
ii. Les réponses IgA
iii. Les réponses IgG1 et IgG2(a+b)
b. La DL 50 de Salmonella Typhimurium
c. L’effet de protection après une infection avec Salmonella Typhimurium
3. Les immunisations avec les protéines du SST3 de S. flexneri
a. La cinétique de la réponse humorale en IgG et IgA dans les sérums
i. Les réponses Ig(G+M)
ii. Les réponses IgA
iii. Les réponses IgG1 et IgG2(a+b)
b. La DL 50 de Shigella flexneri 2a
c. L’effet de protection après une infection avec Shigella flexneri 2a
4. Discussion et Perspectives
II. L’EXPLORATION DE L’INDUCTION DE LA RÉPONSE TH1 DANS LE CADRE DE LA VACCINATION CONTRE S. TYPHIMURIUM
1. Le dosage des cytokines spécifiques (IL-4 et IFN-γ) sécrétées par les cellules immunitaires du sang périphérique
2. L’efficacité de protection après l’infection avec S. Typhimurium
3. Discussion et Perspectives
III. LA PROTECTION CROISÉE SALMONELLA-SHIGELLA
1. La réponse humorale en Ig(G+M)dans le sérum
2. L’efficacité de protection croisée après les infections
3. Discussion et Perspectives
PARTIE B : L’IMMUNOTHÉRAPIE PASSIVE POUR LA PRÉVENTION ET LE TRAITEMENT DES INFECTIONS À SALMONELLA ET SHIGELLA
I. LA PRODUCTION ET LA CARACTÉRISATION DES ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGÉS CONTRE LE SST3
1. Le choix des antigènes
2. La production et la sélection des anticorps monoclonaux
a. L’immunisation et la fusion
b. La sélection des hybridomes
c. Le clonage des hybridomes
d. L’obtention des anticorps monoclonaux
3. La caractérisation des AcMs produits
a. Par immunoblot avec les protéines recombinantes
b. La sélection des AcMs neutralisantsin vivo
c. La caractérisation des épitopes de reconnaissance des AcMs
4. Les analyses combinatoires
II. L’UTILISATION DES ANTICORPS MONOCLONAUX EN PROPHYLAXIE
1. L’infection avec S. Typhimurium
2. L’infection avec S. flexneri 2a
III. LES ANTICORPS MONOCLONAUX ET L’IMMUNOTHÉRAPIE
1. L’infection avec S. Typhimurium
2. L’infection avec S. flexneri 2a
IV. L’IMMUNOTHÉRAPIE « PASSIVE/VACCINANTE »
V. DISCUSSION ET PERSPECTIVES
CONCLUSION GÉNÉRALE
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE

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