Les bacilles a gram négatif non fermentaires

Taxonomie et classification

La taxonomie est l’ensemble des principes et théories qui permettent de classer et de valider le classementdes micro-organismes ou taxons.
La famille des Enterobacteriaceae comprend à l’heure actuelle une centaine d’espèces dont les plus isolées en pathologie clinique appartiennent à 12 genres qui sont : Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia.
Leur classification figure dans le tableau suivant :

habitat

Les Entérobactéries sont des hôtes du tube digestif de l’homme et de nombreux animaux où ils sont soient des pathogènes ou des commensaux.
Elles sont souvent responsables d’infections sévères : gastro-entérites, dysenteries,…
Mais cette localisation digestive n’est pas exclusive. En effet, elles sont fréquemment isolées de différents prélèvements : urines, pus, prélèvements génitaux…
On les retrouve également dans l’environnement (sols, eau) ou elles participent à la dégradation des matières organiques, à l’altération des plantes suite à des nécroses, dégénérescence ou ramollissement tissulaire[2].

ESCHERICHIA COLI ET KLEBSIELLA PNEUMONIAE

caractères bactériologiques

Escherichia coli

Caractères morphologiques et culturaux

Escherichia coli ou colibacille est une bactérie asporulée mesurant 2 à 4 μ de longsur 0,4 à 0,6 μde large.
C’est une bactérie fine et allongée à extrémités arrondies, mobile grâce à une ciliature péritriche.
Ce germe non exigeant, sur gélose ordinaire donne des colonies lisses, brillantes et homogènes[26].

Caractères biochimiques

E.coli possède une catalase mais est dépourvu d’oxydase.
L’étude d’activités enzymatiques et de la fermentation des sucres est réalisée à l’aide de micro-méthodes validées disponibles dans le commerce sous forme de galeries.
Ces dernières permettent l’identification de cette bactérie ainsi que le diagnostic différentiel avec les autres bactéries de la même famille.
Ces caractères sont regroupés dans le tableau II :

Klebsiella pneumoniae

Klebsiella pneumoniae est le chef de file du groupedes entérobactéries pathogènes opportunistes très incriminé dans les infections nosocomiales[10].
IL est également retrouvé dans les affections des voies respiratoires, dans les selles où il est très fréquentd’où le non d’indicateur de souillures fécales qu’on lui prête[2].
Ces germes sont aussi responsables de proliférations sur de nombreuses plantes, feuilles, arbres, céréales, sols eaux, etc. …

LES BACILLES A GRAM NEGATIF NON FERMENTAIRES

définition

Ce sont des bacilles à gram négatif qui contrairement aux entérobactéries ne fermentent pas les sucres. Ces bactéries aérobies strictes sont le plus souvent oxydase positive et de culture très facile sur les milieux usuels. Iles sont soient mobiles soient immobiles par une ciliature polaire.

historique

En 1857, le genre Pseudomonas anciennement appelé genre pléthorique fut répertorié avec 160 espèces à son actif.
L’édition du BERGERY’S MANUEL de 1974 retenait 29 espèces d’intérêt médical.
En 1984 30 espèces furent retenues ; mais c’est seulement avec l’événement de la génétique que denouvelles espèces et genres ont vu le jour.

taxonomie et classification

La taxonomie des bacilles à gram négatif est en perpétuelle modification et les genres couramment isolés au laboratoire sont: Pseudomonas,
Stenotrophomonas, Acinetobacter,Flavobacterium, Alteromonas.
Ces genres regroupent plusieurs espèces appartenant au grand ensemble des bactéries pathogènes opportunistes responsables d’infections nosocomiales.
La classification des bacilles à gram négatif non fermentaires repose aujourd’hui essentiellement sur la génétique (études ADN-ADN et ADN-ARN) et dans une moindre mesure sur l’étude des caractères biochimiques ce qui a permis de découvrirde nouveaux genres [15].

POUVOIR PATHOGENE

Pseudomonas aeruginosa

Ce germe est rencontré dans divers prélèvements effectués chez des malades aux systèmes de défense déficients (immunodéprimés, VIH, greffés, cancéreux, leucémiques,…..) qui sont beaucoup plus réceptifs; mais également chez les patients des services de réanimation ou de soins intensifs.[35]
L’émergence de cette bactérie à l’heure actuelle est liée à sa grande fréquence dans les infections nosocomiales; mais surtout du fait de sa multi résistance aux antibiotiques. C’est ce qui est à l’origine de la difficulté de son isolement et de son identification. [15]
La virulence de Pseudomonas est en grande partie liée à la présence de slime.
IL est également responsable de cystites, de plaie, de septicémies, de diverses suppurations, d’infections génitales etc.…

Acinetobacter.sp

C’est un germe très incriminé dans les infections nosocomiales, cutanées et dans d’autres pathologies diverses et variées à l’ímage de Pseudomonas.

RAPPELS SUR LA CROISSANCE BACTERIENNE

DEFINITION

L’étude de la croissance bactérienne consiste en la détermination des paramètres physiologiques de croissance pour une souche bactérienne donnée.
Cette croissance est rendue possible grâce aux divisions cellulaires qui se produisent lorsque les bactéries se trouvent dans un milieu favorable à leur développement.
On définit par ailleurs, la croissance comme étant l’accroissement ordonné de tous les composants de la bactériequi aboutit à l’augmentation de leur nombre. Pendant cette phase, il se produit un appauvrissement du milieu en nutriments d’une part et un enrichissement en sous produits du métabolisme, éventuellement toxiques d’autre part.
L’étude de la croissance peut se faire en milieu liquide comme en milieu solide. Cependant, dans le cadre de notre étude nous nous limiterons à la croissance bactérienne en milieu liquide à l’aide de méthodes biométriques conventionnelles.
Les méthodes biométriques sont un ensemble de techniques mathématiques utilisant les lois de la probabilité et de la statistique pour mesurer la croissance bactérienne dans un milieu de culture donné.[53]
Ces méthodes ont pour but deprévoir le comportement des micro-organismes en développement dans le milieu de culture afin de mieux cerner les problèmes liés à leur conservation.
En outre, on définit labiométrie ou biométrique comme étant une discipline de la biologie qui utilise ces méthodes mathématiques dites quantitatives pour l’étude des phénomènes biologiques.

COURBE DE CROISSANCE ET DIFFERENTES PHASES DE LA CROISSANCE

L’étude de la cinétique de la croissance des bactéries nous a permis d’établir un certain nombre de données qui sont à l’origine d’une courbe d’allure sigmoïde décrivant 6 phases au totale.
Cette croissance se déroule en milieu liquide et dans un milieu non renouvelé c’est-à-dire que les constituants du milieu nesont pas apportés de façon continue et leur épuisement entraîne l’arrêt de celle-ci.

LA METHODE D’INFERENCE BAYESIENNE

Les méthodes classiques de modélisation présentent beaucoup de difficultés qui limitent leurapplication. C’est pourquoi, de plus en plus, la microbiologie prédictive a recours à l’inférence bayesienne qui découle du théorème de Bayes. Elle a pour but deprévoir le comportement des microorganismes dans un milieu donné.
L’inférence de Bayes est ici utilisée dans la prédiction du temps de seuil critique qui dans cette étude correspond au début de la phase stationnaire et à la fin de celle exponentielle ; autrement dit au temps où on obtient le taux de croissance maximal. Dés lors, sa détermination devient nécessaire pour une bonne interprétation des résultats.
Le théorème de BAYES est issu des travaux du révérend THOMAS BAYES (1702-1761) présentés et édités à titre posthume par son ami Sir Richard Price. Il repose essentiellement sur l’utilisation de la loi binomiale mathématique des probabilités totales.
En biostatistique, cette loi nommée probabilité conditionnelle ou probabilité des causes peut être présentée sous cette formule :

APPLICATIONS

L ‘étude de la croissance bactérienne qui repose essentiellement sur l’utilisation des méthodes biométriques est utilisée dans de nombreux domaines.
-en microbiologie alimentaire surtout dans la détermination de la DLC (date limite de conservation) des produits de conserve. C’est ce qui a ouvert la voie a une nouvelle discipline : la Microbiologie prévisionnelle ou prédictive.
-dans l’analyse microbiologique de l’eau de boisson, eau à usage médicale [9]
-dans le contrôle microbiologique des produits pharmaceutiques et sanitaires notamment à l’échelle l’industrielle.
-en cosmétologie
-dans la conservation des produits biologiques notammentles souches de micro-organismes
-en gyneco-obsetrique
-en apiculture
-dans la recherche d’empreintes digitales pour l’identification des individus.

CADRE D’ETUDE

LABORATOIRE DE BACTERIOLOGIE &VIROLOGIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE DE L’UCAD II SALLE 215.

Cette étude porte uniquement sur des souches de références qui ont été déjà identifiées et conservées au laboratoire.

MATERIEL ET REACTIFS

MATERIEL DE LABORATOIRE

-Autoclave
-Agitateur magnétique
-Balance de précision
-Bain marie
-Becher
-Embouts stériles
-Eprouvettes
-Erlen Meyer
-Filtres millipores
-Flacons en verre avec bouchon rodé
-Micropipettes
-ph-mètre
-Tubes à essais stériles
-Agitateur magnétique
-Dessiccateur
-Etuve
-Four micro-onde
-Ecouvillons

Pour l’enrichissement et l’isolement

-Bec bunsen
-Autoclave
-Anse de platine
-Boite de pétri
-Etuve

METHODES

ISOLEMENT ET IDENTIFICATION

Isolement

En vue d’obtenir des colonies des germes à identifier, les souches conservées à -20°C ou à – 80°C sontrégénérées dans un bouillon d’enrichissement (BT), puis ensemencées sur la gélose EMB. L’incubation se fait à l’étuve à 37°C pendant 24 heures.

L’IDENTIFICATION

EXAMEN MACROSCOPIQUE

– E.colisur EMB ou MH donne de grosses colonies sèches, lactose positive à contour irrégulier.
-K.pneumoniae: grosses colonies muqueuses, lactose + ayant un aspect de goutte de miel, avec une tendance à la confluence.
-P.aeruginosadonne sur MH colonies rappelant « un œuf sur le plat » avec un pigment bleu-vert à odeur caractéristique (acacia ou seringa)
-Acinetobactersur MH donne colonies des lisses à bordure nettes.

EXAMEN MICROSCOPIQUE

ETAT FRAIS

PRINCIPE ET TECHNIQUE

C’est un examen de mise en œuvre très simple et qui a lieu au microscope optique à l’objectif x 40. ILpermet d’apprécier la morphologie des bactéries, leur mode de groupement, leur abondance et leur mobilité.
Sur une lame porte objet stérile ,déposer une goutte d’eau physiologique et une goutte de colonie. Homogénéiser et recouvrir d’une lamelle en évitant d’emprisonner les bulles d’air, lire au microscope.

RESULTATS

E.coli: bacilles polymorphes mobiles péritriches K.pneumoniae: donne des bacilles immobiles courts Acinetobacter: bacilles courts et trapus groupés en diplobacilles qui sont immobiles. Pseudomonas aeruginosa : bacilles longs et fins à mobilité polaire

COLORATION DE GRAM

PRINCIPE

C’est la coloration de base en Bactériologie et elle permet une classification des bactéries selon leur structure. Elle est l’un des caractères essentiels de la classification des bactéries. Plusieurs facteurs vont intervenir dans cette coloration :
– la différence de composition chimique de bactéries
– la différence de perméabilité de la paroi bactérienne.

TECHNIQUE

La coloration de Gram se déroule en plusieurs étapes qui se succèdent et consistent à :
– fixer le frottis à la flamme d’un bec bensen
– recouvrir le frottis de la solution de cristal violet, laisser agir une minute (violet de gentiane.

RECHERCHE D’OXYDASE

PRINCIPE

Cette réaction est recherchée sur des cultures en milieu gélosé exemptes de sucres fermentes cibles ou de sang. Les bactéries possédant des oxydases en présence de sucres donnent des métabolites qui se combinent avec le réactif utilisé pour donner une coloration variable selon la bactérie.

TECHNIQUE

La réaction des oxydases se fait à l’aide de disques de commerce prêts à l’emploi, imprégnés d’eau distillée sur lequel on dépose une colonie.

RESULTAT

Une réaction positive se traduit par l’apparition d’une coloration violette à l’endroit où on a déposé la colonie, soit immédiatement, soit quelques secondes après.
En fonction du délai d’apparition de la coloration, on a :
– Entérobactéries (Oxydase négative)
-Acinetobacter(Oxydase négative)
– Pseudomonas aeruginosa(Oxydase positive après 20 à 30 secondes)

MILIEUX MINIMUN D’IDENTIFICATION

MILIEU MANNITOL MOBILITE

C’est une gélose molle conditionnée en tubes et qui permet d’étudier la fermentation du mannitol et la mobilité des germes.
Elle est ensemencée par piqûre centrale jusqu’au fond des tubes à l’aide d’une anse de platine.
La fermentation du mannitol se matérialise par un virage du milieu au jaune (E.coli ; K.pneumoniae).

Table des matières
LISTE DES ABREVIATIONS
RESUME
INTRODUCTION 
PPREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
I /RAPPELS SUR LES BACILLES A GRAM NEGATIF
1-1 /DEFINITION
1-2 /CLASSIFICATION
1-3 /LES ENTEROBACTERIES
1-3-1/ définition
1-3-2/ historique
1-3-3 /taxonomie et classification
1-3-4/habitat
1-4 / ESCHERICHIA COLI ET KLEBSIELLA PNEUMONIAE
1-4-1 / caractères bactériologiques
1-4-1-1 /Escherichia coli
1-4-1-2 / Klebsiella pneumoniae
1-4-2 / Pouvoir pathogène
1-4-2-1 / Escherichia coli
1-4-2-2/Klebsiella pneumoniae
1-5 /LES BACILLES A GRAM NEGATIF NON FERMENTAIRES
1-5-1 /définition
1-5-2 /historique
1-5-3 /taxonomie et classification
1-5-4/habitat
1-6 /PSEUDOMONAS ET ACINETOBACTER
1-6-1 /caractères bactériologiques
1-6-1-1 /Pseudomonas aeruginosa
1-6-1-2/ Acinetobacter.sp
1-6-2 /Pouvoir pathogène
1-6-2-1/Pseudomonas aeruginosa
1-6-2-2/Acinetobacter.sp
II /RAPPELS SUR LA CROISSANCE BACTERIENNE
2-1/ DEFINITION
2-2 / CONDITIONS DE CROISSANCE
2-2-1/ Reproduction et nutrition
2-2-2 / Facteurs physicochimiques
2-3/ COURBE DE CROISSANCE ET DIFFERENTES PHASES DE LA CROISSANCE
2-4/ LES METHODES DE MESURE
2-4-1/dénombrement bactérien
2-4-2/ détermination de la biomasse
2-5/ CONDITIONS DE CROISSANCE DES BACTERIES ETUDIEES
III / MODELISATION DE LA CROISSANCE
3-1/LES TYPES DE MODELISATION
3-1-1 / La modélisation primaire
3-1-2/ La modélisation secondaire
3-2/ LA METHODE D’INFERENCE BAYESIENNE
3-3/ APPLICATIONS
DEUXIEME PARTIE: TRAVAIL PERSONNEL
I / CADRE D’ETUDE
II / MATERIEL ET REACTIFS
2-1 / MATERIEL DE LABORATOIRE
2-1-1/ Pour l’enrichissement et l’isolement
2-1-2/ Pour l’identification
2-1-3/ Pour l’étude de la croissance
2-2 / REACTIFS
2-2-1/ Pour l’enrichissement et l’isolement
2-2-2/ Pour l’identification
2-2-3 / Réactifs de révélation
2-2-4 / Pour l’étude de la croissance
III / METHODES
3 -1/ISOLEMENT ET IDENTIFICATION
3 -1-1 / isolement
3 -1-2/ identification
3 -1-2-1/ examen macroscopique
3 -1-2-2/ examen microscopique
3 -1-2-3/ recherche d’oxydase
3 -1-2-4 /milieu minimum d’identification
3 -2/ETUDE DE LA CROISSANCE ET RECHERCHE DE L’EFFET INOCULUM SUR L’IDENTIFICATION PAR LES GALERIES MICRO- CSB
3 -2-1/étude de la croissance par dénombrement bactérien
3-2-2/ recherche de l’effet inoculum sur l’identification par les galeries Micro-CSB
TROISIEME PARTIE: RESULTATS
I/ EXPLOITATION DES RESULTATS DU DENOMBREMENT ET DES GALERIES MICRO-CSB
1-1 / Escherichia coli
1 -1-1/Résultats du dénombrement des colonies
1 -1-2 /Courbe de croissance
1 -1-3/détermination des paramètres de la croissance
1 -1-4/résultats de la galerie micro- CSB BGN
1 -2/Klebsiella pneumoniae
1-2-1/Résultats du dénombrement des colonies
1 -2-2 /Courbe de croissance
1-2-3/détermination des paramètres
1-3/Pseudomonas aeruginosa
1-3-1/Résultats du dénombrement des colonies
1-3-2 /Courbe de croissance
1-3-3/détermination des paramètres
1-3-4/résultats de la galerie micro- CSB BGNNF
1-4/Acinetobacter.sp
1-4-1/Résultats du dénombrement
1-4-2 /Courbe de croissance
1-4-3/détermination des paramètres
1-4-4/résultats de la galerie micro- CSB BGNNF
II/ AJUSTEMENT DES PARAMETRES DES RESULTATS DU DENOMBREMENT ET PREDICTION DU TEMPS DE SEUIL
2-1/ Escherichia coli
2-1-1 / Ajustement de la taille de l’inoculum
2-1-2 / Prédiction du temps de seuil
2-2/ Klebsiella pneumoniae
2-2-1/ Ajustement de la taille de l’inoculum
2-2-2/ Prédiction du temps de seuil
2-3/Pseudomonas aeruginosa
2-3-1/ Ajustement de la taille de l’inoculum
2-3-2 / Prédiction du temps de seuil
2-4/ Acinetobacter.sp
QUATRIEME PARTIE: DISCUSSION
I / LES SOUCHES
II / ETUDE DE LA CROISSANCE PAR LA METHODE DU DENOMBREMENT
III / METHODE D’AJUSTEMENT DES PARAMETRES DE LA CROISSANCE
IV / EFFET INOCULUM SUR L’IDENTIFICATION DES BACILLES A GRAM NEGATIF AVEC LESGALERIES MICRO-CSB
V / PREDICTION DU TEMPS DE SEUIL ET APPLICATION AUX GALERIES MICRO-CSB
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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