LES ATPASES DU PROTEASOME ARCHEOBACTERIEN OU RPT-LIKE : PAN 

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Reconnaissance et liaison du substrat

Les protéases ne dégradent pas n’importe quelle protéine. La dégradation est spécifique et cette spécificité est assurée parslesignaux de dégradation. Ainsi, les protéases ATP-dépendantes identifient leur cible par l’intermédiaire de leurs partenaires AAA+ grâce à des signaux de dégradation appelés degrons contenusdans les protéines.
Les signaux de dégradation se classent en deux catégories : les signaux de dégradation primaires qui sont essentiellement situés au sein de la structure elle-même. Ce sont généralement des régions hydrophobes non structuréeou des motifs de quelques acides aminés localisés en N-terminal ou en C-terminal ou dans des localisations variables à l’intérieur de la séquence (Varshavskyet al., 2005).
Les signaux de dégradation secondaires sont apportés en trans sur les protéines. Ce sont des modifications post-traductionnelles qui peuvent être des phosphorylations ou l’addition co-traductionnelle de signaux peptidiques. Ces modifications permettent la régulation fine et spécifique de l’activité de larotéolysep.

Signaux de dégradation

A Chez les bactéries

Le mécanisme d’adressage des protéines à la destruction chez les bactéries commence à être élucidé, et révèle des éléments à la foismplessi et complexes. L’adressage des protéines à la destruction chez les bactéries se fait par l’intermédiaire d’un ensemble très divers de signaux peptidiques non structurés. L’existence d’un nombre variable de signaux de dégradation permet de réguler différentiellement slesubstrats selon le besoin physiologique.
La plupart des substrats du système Clp sont des protéines clefs impliquées dans de processus régulateurs dans la cellule, le rôle du système protéolytique Clp serait de réajuster la composition du protéome (Henggeet al., 2003 ; Gottesman et al., 2003).
L’exemple le mieux étudié d’adressage des protéinesà la protéolyse chez les bactéries est le système ssrA qui cible les polypeptides issus d’une traduction défectueuse vers la protéolyse (Keiler et al., 1996). Les protéines défectueuses au niveau des ibosomesr sont reconnues par les protéases grâce à une séquence peptide AAANDENYALAA dans leur région C-terminale qui est codée par un tmARN stable (10S RNA) ou ssrA.
D’autres motifs impliqués dans la dégradation des protéines chez les bactéries ont été identifiés par une expérience élégante du laboratoire de Baker (Flynn et al., 2003). L’utilisation d’un mutant ClpXP inactif, agissant c omme une cage pour piéger les protéines substrats, a montré l’existence de cinq classes de signaux de dégradation au niveau des 60 protéines piégées par le complexe. Ces protéines iquincluent des facteurs de transcription, des enzymes métaboliques et des protéines de stress possèdent des signaux de dégradation qui sont localisés aux extrémités de la protéine soitansd la région N-terminale, soit dans le C-terminal de la protéine et sont riches en résidus ydrophobes et basiques. Les signaux de dégradation en C-terminal se rapprochent de leur composition du peptide ssrA avec la présence d’une séquence LAA en C-terminale, alors que les peptides en N-terminal sont plus riches en résidus basiques.
La présence des signaux de dégradation n’est pas limitée aux extrémités N-terminale de la protéine, car d’autres motifs de dégradation sont itués à l’intérieur de la séquence. Ainsi le répresseur de la transcription LexA qui régule la éponser SOS aux endommagements de l’ADN chez les bactéries possède un signal de dégradation à l’intérieur de la séquence qui n’est exposé que lors d’une réponse aux endommagements d’ADN (Neher et al., 2003). Certains substrats nécessitent pour leur interaction avec les complexes AAA+ la présence d’autres protéines nommées protéines adaptatrices(Dougan et al., 2002 ; Mogk et al., 2004). Les protéines adaptatrices forment une nouvelle classe de protéines qui ont pour fonction de moduler la liaison du substrat à la protéine AAA+, mais elles sont capables aussi de moduler l’activité des protéines AAA+. Les protéines adaptricesa ont été découvertes chez un grand nombre d’organismes jusqu’à présent. Les mieux caractérisés sont les protéines adaptatrices du système Clp : ClpS, RssB, SspB, UmuD, MecA (Dougan et al., 2002), mais il existe aussi d’autres protéines adaptatrices qui fonctionnent avec d’autres protéines AAA+ qui ne sont pas des partenaires de protéases. L’exemple de la protéine adaptatrice p47 qui interagit avec la protéine AAA+ p97 et est impliquée dans la fusion omotypiqueh des membranes (Hetzer et al., 2001). Les protéines adaptatrices découvertes jusqu’à présent ne s’apparentent ni par la séquence, ni par la structure, et leur taille est variable mais ce sont en général de protéines de petit poids moléculaire. Le seul point commun est qu’elles utilisent le même site de liaison au niveau des AAA+ qui est le domaine N-terminal (Zeth et al., 2002). Ainsi la protéine adaptatrice ClpS lie ClpA via son domaine N-terminal, de même que la liaison de la protéine adaptatrice SspB à ClpX se fait via le domaine N-te rminal (Wojtyra et al., 2003).

Chez les eucaryotes

L’un des mécanismes les plus élégants d’adressage esd protéines eucaryotes à la protéolyse est l’attachement de multiples chaînes d’ubiquitine. L’ubiquitine est une chaîne de 76 résidus qui est ajoutéeen trans sur les résidus lysines de substrats protéiques dans une réaction énergie dépendante (Hershkoet al.,1988).La réaction d’ubiquitination est médiée par une série d’enzymes qui comprennent les E1 ou les enzymes d’activation de l’ubiquitine responsables de la formation d’une liaison thioester avec l’ubiquitine en présence de l’ATP. L’ubiquitine est ensuite transférée par les enzymesde conjugaison de l’ubiquitine ou E2 via une réaction de transthiolation. Les E2 sont souvent liées à des ubiquitines ligases ou E3, les enzymes clefs dans la sélection des substrats pour l’ubiquitination. Les E3s peuvent aussi faciliter l’interaction directe du complexe E3 substrat avec le protéasome 26S (Xie et al., 2000).
L’ubiquitination ne constitue pas le seul moyen d’a dressage des protéines à la protéolyse par le protéasome 26S. Il existe à cette date un nombre d’exemples des protéines dont la dégradation se passe indépendamment de l’ubiquitination comme l’ornithine décarboxylase impliquée dans la synthèse des polyamines (Coffinoet al., 2004) et la protéine p21 inhibitrice des cyclines kinases dépendant (Chenet al., 2004).

Chez les archéobactéries

Pour l’instant, les signaux de dégradation n’ont pas été encore identifiés chez les archéobactéries. Les archéobactéries sont des procaryotes qui possèdent des protéasomes de type eucaryote. Aucune protéine apparentée à l’ubiquitine n’a été retrouvée dans les génomes séquencés jusqu’à présent, ni un système homologueà la ssrA. Le mécanisme pour la reconnaissance des substrats se rapproche plus probablement des mécanismes retrouvés chez les procaryotes, via des régions ou des peptides non structurées dans les substrats destinés à être dégradés.

Sites de reconnaissance des substrats

Quels sont les domaines au niveau des complexes AAA+ qui assurent la reconnaissance du substrat pour sa dégradation. Les données à ce sujet sont assez contradictoires et proviennent essentiellement des études faites sur les systèmes procaryotiques Clp à cause de la simplicité de leur organisation.
Les détails moléculaires concernant la reconnaissance du substrat par les AAA+ ne sont pas encore bien définis. Certaines publications évoquent le rôle du domaine N-terminal dans la liaison au substrat ou aux adaptateurs (Guo et al., 2002 ; Kim and Kim, 2003 ; Pak et al., 1999 ; Rockel et al., 1999). Le domaine N-terminal comporte des motifs coiled-coil qui sont supposés agir comme des sites primaires de reconnaissance de substrat. Ces motifs coiled-coil occupent en général une position distale par rapport au pore du complexe ATPasique. Dans certaines ATPases, ces motifs coiled-coil sont en position axiale par rapport à l’anneau hexamérique, c’est le cas de HslU (Botchler et al., 2000). Dans d’autres cas, les motifs coiled-coil sont en position équatorielle par rapport à l’anneau hexamérique cas de p97 et de Clp/Hsp100 (Dreveney et al., 2004 ; Li et al., 2002). Les protéines AAA+ sont comparées à ce sujet à d’autres chaperonnes notamm ent les chaperonnes de la famille des Hsp60 qui possèdent les mêmes motifs en coiled-coilet agissent dans la reconnaissance du substrat (Martin et al., 2004). Cependant, dans la plupart des cas, la délétion de la région N-terminale n’avait pas d’effet ni sur la liaison au substrat, ni sur l’activité de l’enzyme (Babst et al., 1998 ; Beinker et al., 2002, Zhang et al., 2004). Certaines des protéines de la famille Clp notamment ClpA et ClpB ont une forme délétéein vivo dans la région N-terminale provenant de l’utilisation d’un deuxième site Shine-Dalgarno. Cette forme est toujours active et capable d’exercer les mêmes fonctions que la protéine entière (Park et al., 1993 ; Zolkiewski et al., 1999). D’autres publications évoquent le rôle du domaine C-terminal ou SSD comme important pour la liaison au substrat (Hoskins et al., 2000) ou dans l’engagement initial du substrat (Joshi et al., 2003).

Dépliement et « translocation » dans la cavité protéolytique

L’une des fonctions des protéases ATP-dépendantes ste de détruire sélectivement des protéines régulatrices, la plupart de ces protéinesont des protéines fonctionnelles, donc ce sont des protéines bien repliées. Ces protéines doivent être préalablement dépliées avant qu’elles ne soient dégradées pour qu’elles puissentrentrer dans le pore communiquant avec le pore du complexe protéolytique .

Mécanisme de dépliement

L’activité de dépliement ou « unfolding » a été enpremier décrite pour le système Clp (Weber-ban et al.,1999). L’expérience très élégante se sert des caractéristiques de la GFP : une protéine globulaire très stable dont la fluorescence intrinsèque disparaît lorsque la protéine n’est pas correctement repliée. Il est donc facile de suivre le dépliement de la protéine en mesurant sa fluorescence. Lorsque la protéine GFP est étiquetée en C-terminal avec la ssrA, elle devient particulièrement sensible à l’action de ClpA qui catalyse dès lors son dépliement, et une perte de fluorescence est observée. Le dépliement requiert de l’ATP et du Mg++.

Hydrolyse et relâchement des produits

Une fois que le substrat est déplié et séquestré nsda la chambre protéolytique, il est alors exposé aux sites catalytiques des protéases.Cette étape est ATP-indépendante, et les protéases libèrent des produits dont la taille varie de 3 à 30 acides aminés.

Fonction chaperonne des protéases ATP-dépendantes

Plusieurs études montrent que l’activité chaperonneest une propriété commune et universelle des protéases ATP-dépendantes. Il a étédémontré que plusieurs protéases ATP-dépendantes participent via leurs protéines AAA+ auremodelage des substrats. L’activité chaperonne semble être contradictoire avec l’activité prédite de ces complexes dans le dépliement et l’élimination définitive d’un substrat, cependant les mécanismes qui gouvernent les deux activités semblent être similaires. Dans esl deux types d’activité, les complexes AAA+ utilisent l’énergie de l’ATP pour provoquer des changements conformationnels au niveau de leur substrat qui peut être une protéineou un complexe protéique. Les complexes AAA+ se situent entre la vie et la mort d’une protéine (Zwickl et al., 1999), et les mécanismes qui permettent aux AAA+ de décider entre le repliement d’une protéine, son remodelage ou sa destruction ne sont pas encore connus.
L’idée que les protéines AAA+ peuvent porter des onctionsf de type chaperonne est venue d’une homologie entre les complexes AAA+ bactériens ClpX et ClpA avec d’autres protéines chaperonnes notamment la protéine Hsp104de la levure et une autre protéine ClpB, qui elle ne s’associe pas à de complexes protéolytiques (Pak et al., 1999). L’implication des protéines ClpX et ClpA dans une fonction chaperonnea été démontrée dans leur participation en deux processus : la transposition du phage Mu (Mhammedi-Alaoui et al., 1994 ; Levchneko et al., 1995), et la réplication du phage P1 (Wickneret al., 1994).
D’autres études plus récentesin vitro chez les eucaryotes ont montré une activité chaperonne des protéases ATP-dépendantes; notamment la protéase mitochondriale i-AAA/Yme1 (Leonhard et al.,1999) et le protéasome eucaryote (Braun et al., 1999 ; Strickland et al., 2000). Dans le cas du protéasome, l’activité chaperonne est localisée dans la base du complexe régulateur 19S qui est capable de lier et replier la citrate synthase dénaturée et non ubiquitinylée dans une réaction ATP-dépendante.

Les ATP ases du protéasome eucaryote : les rpt

L’activité du complexe protéolytique 20 S dans lescellules eucaryotes est régulée par son association au complexe 19S pour former le complexe macromoléculaire de 2,7 MDa. ou 26 S (Peters et al.,1994 ; DeMartino et al.,1994 , Armon et al.,1990 ; Hoffman et al.,1994). Le complexe 19 S contient six sous-unités ATPasiques nommées rpt (Regulatory Particle Triple A protein) qui sont en contact direct avec le protéasome 20 S tels qu’ils ont montré les images par microscopie électronique (Glickmanet al., 1998 ; Gray et al., 1994 ; Walz et al., 1998).
Plusieurs rôles ont été attribués à ces sous-unitésATPasiques notamment via leur capacité à utiliser l’énergie de l’ATP pour induire des changements conformationnels. Il a été proposé que ces ATPases puissent utiliser le même mode d’action des autres AAA+ notamment en ce qui concerne leur oligomérisation en un complexe hexamérique (Glickman et al., 1998), la liaison au protéasome 20 S (Peters et al.,1994 ; DeMartino et al.,1994 , Armon et al.,1990 ; Hoffman et al.,1997), la reconnaissance et la liaison des substrats (Pickart, 1997 ; Beal et al., 1998, Fu et al., 1999 ; Young et al.,1998 ) et leur dépliement des substrats (Braun et al., 1999 ; Strickland et al., 2000). Les rpt peuvent assister dans la translocation de substrats protéiques dépliés dans la chambre centrale catalytique du protéasome (Larsen et al., 1997). Les ATPases peuvent utiliser l’énergie de l’ATP pour induire un changement conformationnel au niveau de l’ouverture de la chambre protéolytique qui est complètement fermée chez la levure (Groll et al.,1997) et y contrôler l’accès.
Les sous-unités ATPasiques sont distribuées dans toutes les cellules eucaryotes : levure, mammifères, plantes (Glickman et al., 1998 ; Fu et al., 1999). Les sous-unités ATPasiques présentent toutes des homologies entre elles, et elles sont plus proches de leurs homologues d’une autre espèce qu’au sein d’une mêmeespèce. Il est possible de les classer en 6 groupes : rpt 1 à 6 (Finley et al., 1998).
Les protéines rpt sont composées d’un domaine ATPasique qui contient les deux motifs Walker A et Walker B. Ils contiennent aussi dans leur région N-terminale une région variable qui peut contenir des motifs coiled-coil : boite hachurée (Extrait de Glickman et al., 1998).
Les différentes rpt se ressemblent essentiellement au niveau de leur domaine central ATPasique formés par le motif Walker A et le WalkerB. Elles présentent une divergence au niveau de leur région N-terminale (Figure 8). Il existe cependant un domaine coiled-coil chez toutes les rpt à l’exception de la rpt2 qui présente un « stretch inhabituel » de lysine auquel on a attribué un signal d’adressage au noyau (Glickman et al., 1998). La région N-terminale est importante pour la liaison des sous-unités entre eles et avec les substrats (Gorbea et al., 2000 ; Richmond et al, 1997).

Rôle et Fonction

Les rpt constituent des gènes essentiels comme l’a montré la délétion des gènes chez la levure (Gordon et al.,1993 ; Russell et al.,1996 ; Swaffield et al., 1992 ; Ghislain et al.,1993 ; Schnall et al.,1994). Les mutants sont létaux et ne sont pas restaurés par la surexpression par les autres ATPases. Les sous-unités ATPasiques semblent exercer des fonctions non redondantes dans la cellule (Rubin et al., 1998 ; Russell et al., 2001) car des mutations au niveau du domaine ATPasique chez les différentes sous-unités ATPasiques entraîne des phénotypes différents . Il existe cependant une copérativité dans les sous-unités ATPasiques du 19 S pour la dégradation des substrats, car la dégradation d’un substrat spécifique peut être inhibée par des mutations au niveau des différentes19 S ATPases (Rubin et al., 1998). L’activité peptidasique du protéasome 20 S est stimulée lorsqu’il s’associe à son complexe régulateur indiquant que même les peptides qui n’ont pas besoin d’être dépliés sont aussii régulés par le complexe 19 S et une seule mutationprovoque une inhibition de l’activité peptidasique (Rubin et al., 1998). La mutation au niveau du domaine ATPasique de rpt2 a montré une inhibition dramatique dans l’activité peptidasique du protéasome, ce qui suggère que cette sous-unité se situe sur la porte d’entréede la cavité centrale protéolytique (Kohleret al., 2001).

Interaction des sous-unités entre elles et avec d’autres protéines

Interaction des sous-unités entre elles

Des études biochimiques et génétiques détaillées nsdadifférents organismes ont montré des interactions spécifiques entre les différentes ATPases. Ces différentes études suggèrent que ces sous-unités ATPasiques s’associent probablement en un complexe hexamérique typique des membres de la famille des AAA-Atpases (Glickman et al., 1998). Les études biochimiques et génétiques ont indiquéueq l’interaction protéine-protéine entre les différentes ATPases se passe via la région N-terminale qui porte des domaines coiled-coils. L’interaction se fait par paire : la rpt2 lie la rpt1, et la rpt3 lie la rpt6 et la rpt 5 lie la Rpt4. (Richmond et al., 1997 ; Gorbea et al.,2000)
Il n’existe pas pour l’instant de preuve directe pa r quelle sous-unité ou domaine se fait la liaison avec le protéasome. Une étude génétiquemontre une interaction entre l’une des sous ATPasiques la rpt6 et l’une des sous-unité alpha du protéasome alpha 1 (Gerlinger et al., 1997). Une autre étude chez la drosophile montre que les ATPases sont susceptibles à la dégradation protéolytique lorsqu’elles sont sous forme de 19S non associé, mais elles sont protégées de la dégradation lorsqu’elles sont associées au complexe 20 S (Haracska et al.,1996).

Interaction avec d’autres protéines

D’une facon générale chez la levure, il existe un grand nombre de protéines qui sont faiblement associés avec le complexe 19S dans la cellule (Verma et al., 2000). La recherche de protéines susceptibles d’interagir avec les sous-unités ATPasiques du protéasome a été effectuée par plusieurs types d’études génétiques,le système double hybride et le « pull-down » assays. Les rptases sont capables d’interagir avec un grand nombre de protéines cellulaires, ce sont essentiellement des activateurs transcriptionnels, des protéines virales, et des récepteurs hormonaux (revue Kerrelet al., 2000, Verma et al., 2000).
La liaison des sous-unités ATPasiques à la transcription n’est pas encore bien comprise, il a été proposé que les sous-unités ATPasiques du complexe 19 S puissent former un complexe indépendant au niveau de la protéolyse (nommé APISpour AAA Proteins Independent of 20 S) (Ottosen et al., 2002). Ce complexe est recruté au niveau de promoteurs de gènes activés, et participe à la régulation de la transcription dont le mécanisme reste encore à définir (Ferdous et al., 2002). Le complexe semble jouer un rôle indépendant de la protéolyse dans le nucléotide excision repair L’inactivation sélectivedes sous-unités ATPasiques de la base du 19 S et non l’inhibition du protéasome entraîne une sensibilité aux irradiations par les rayons UltraViolets et affecte la réparation de l’ADN par le nucleotide excision repair (Russell et al., 2001).

Les ATPases du protéasome archéobactérien ou rpt- like : PAN

Découverte de PAN

La plupart des données structurales et fonctionnelles sur les protéasomes proviennent des études faites sur les protéasomes des archéobactéries en vue de leur simplicité. La recherche de complexes ATPasiques susceptibles de réguler la protéolyse chez les archéobactéries a révélé l’existence chezMéthanocaldococcus janaschii d’une AAA-ATPase homologue aux sous-unités ATPasiques régulatrices ud protéasome eucaryote. La protéine de 50 kda partage une homologie autour de 40% avec les six sous-unités ATPasiques de la base du complexe régulateur du protéasome. Lorsque PAN ed Méthanocaldococcus janaschii est cloné et surexprimé dansE. coli forme un complexe oligomérique de haut poids moléculaire (550- 650 Kda). Il n’existe pas de données claires sur la nature du complexe et son mode d’assemblage, mais ce complexe résulte probablement de la formation d’un double hexamère en anneau (Zwickl et al., 1999). In vitro, le complexe est capable de catalyser une gamme assez large de nucléotides d’ATP, de CTP et à un degré moindre le GTP et l’UTP (Zwickl et al., 1999). Lorsque le complexe est incubé avec le protéasome de Thermoplasma acidophilum et en présence de l’ATP, il est capable de stimuler la dégradation des protéines, mais non pas celle de tétrapeptides qui peuvent difuser librement à travers le pore du protéasome, ce qui suggère que PAN agit pour régulel’hydrolyse des protéines et non pas celle des peptides. Le complexe a été nommé PAN pour Proteasome Activating Nucleotidase (Zwickl et al., 1999). PAN a été proposé comme étant le précurseévolutif des  ATPases de la base du complexe régulateur le 19S.

Distribution de PAN au sein des archéobactéries

Le séquençage des génomes d’archéobactéries séquencés jusqu’à présent a révélé la présence de 23 protéines homologues et annotées come étant des sous-unités atpasiques régulatrices du protéasome. PAN est complètement absent du génome de certaines archéobactéries telles les thermoplasmales et les erroplasmalesf. Et Parmi les archéobactéries, seules les archéobactéries halophiles et les méthanosarcinacées possèdent deux PANs.

VAT : homologue fonctionnel de PAN chez Thermoplasma acidophilum

PAN n’est pas présent dans les génomes de toutes les archéobactéries notamment chez Thermoplasma acidophilum ou chez Pyrobaculum aerophilum. Il a été proposé qu’une autre AAA-ATPase archéobactérienne de la famille des AAAhomologue à la protéine cdc48 nommée (VAT ou VCP ou p97) pourrait faciliter la dégradation des protéines par le protéasome. Les protéines cdc48 sont des protéinesAAA à deux domaines ATPasiques fonctionnels qui sont répartis dans les trois domaines du vivant. Les protéines cdc48 se présentent sous forme d’un double hexamère (Rockel et al., 1999) et possèdent aussi une activité chaperone-like (Golbiket al., 1999).

Rôle et caractéristiques biochimiques de PAN

PAN étant capable de réguler l’activité du protéasome in vitro sur des substrats protéiques telle la caséine, il était intéressante dtester si PAN tout comme les sous-unités ATPasiques du système Clp pouvait agir comme une « unfoldase » qui déplie les protéines en vue de leur dégradation. Pour tester l’activité dedépliement de PAN in vitro, PAN a été incubé avec le substrat de ClpA, la GFP-ssrA. Mêmesi la ssrA n’est pas identifiée au niveau des génomes des archéobactéries, PAN a catalysé rapidement la perte de la fluorescence de la GFP-ssrA et cette réaction nécessitait l’hydrolysede l’ATP (Benaroudj et al.,2000).
PAN peut aussi agir comme une chaperonne moléculaire. Son action comme une chaperonne moléculaire a été démontrée par son action à réduire la formation des agrégats, de même qu’à aider les protéines dépliées à retrouverleur conformation native (Benaroudj et al., 2000). En effet, PAN réduit significativement l’agrégation des protéines dépliées par la température ou par des traitements chimiques. PAN a la capacité aussi de promouvoir le repliement de protéines dénaturées. Ainsi, PAN facilite le repliement de la glucose déshydrogénase dénaturée par la guanidine. La liaison de PAN aux nucléotides affecte sa capacité à réduire les agrégats, cependant elle n’affecte pas sa stimulation de l’aide au repliement des protéines (Benaroudjet al., 2000). Du fait de sa facilité d’expression et sa capacitéà réguler le protéasome in vitro, le complexe PAN a permis la compréhension de certains aspects des mécanismes de régulation du protéasome eucaryote et du protéasome archéobactérien (Benaroudj et al., 2003 ; Navon et al., 2001 ; Ogura et al., 2003). Le complexe PAN est capable de réguler l’activité du protéasome d’une manière très similaire à celle de l’action des protéines Clp/hsp100. Le mécanisme comporte les mêmes grandes lignes notamment la reconnaissance du substrat, son dépliement et la séquestration du substrat dans lachambre protéolytique (Navon et al., 2001 ; Ogura et al., 2003). Et dans le cas du protéasome eucaryote, PAN est capable de provoquer l’ouverture de la porte d’entrée dans la chambre protéolytique qui est fermée par les extrémités N-terminaux des sous-unités alpha.

Table des matières

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
I LES PROTEASES ATP-DEPENDANTES 
I.1 Distribution
I.2 Caractéristiques
II LE SYSTEME PROTEASOME 
II.1 Le protéasome 20 S
II.1.1 Historique et Découverte
II.1.2 Distribution
II.1.3 Architecture du protéasome 20 S
II.1.4 Activité du protéasome 20 S
II.1.5 Rôle biologique du protéasome 20 S chez les archéobactéries
II.2 Les régulateurs du protéasome
III LES AAA+ REGULATEURS DE LA PROTEOLYSE 
III.1 Caractéristiques de la superfamille des AAA+
III.2 Mode d’action des AAA+ dans la protéolyse ATP-dépendante
III.2.1 Oligomérisation des AAA +
III.2.2 Liaison des AAA+ à leurs partenaires protéolytiques
III.2.3 Reconnaissance et liaison du substrat
III.2.3.1 Signaux de dégradation
III.2.3.1.A Chez les bactéries
III.2.3.1.B Chez les eucaryotes
III.2.3.1.C Chez les archéobactéries
III.2.3.2 Sites de reconnaissance des substrats
III.2.4 Dépliement et « translocation » dans la cavité protéolytique
III.2.4.1 Mécanisme de dépliement
III.2.5 Hydrolyse et relâchement des produits
III.3 Fonction chaperonne des protéases ATP-dépendantes
IV LES ATPASES DU PROTEASOME EUCARYOTE : LES RPT 
IV.1 Rôle et Fonction
IV.2 Interaction des sous-unités entre elles et avec d’autres protéines
IV.2.1 Interaction des sous-unités entre elles
IV.2.2 Interaction avec d’autres protéines
V LES ATPASES DU PROTEASOME ARCHEOBACTERIEN OU RPT-LIKE : PAN 
V.1 Découverte de PAN
V.2 Distribution de PAN au sein des archéobactéries
V.2.1 VAT : homologue fonctionnel de PAN chez Thermoplasma acidophilum
V.3 Rôle et caractéristiques biochimiques de PAN
VI DESCRIPTION DU SYSTEME D’ETUDE : HALOBACTERIUM SALINARIUM44
VI.1 Taxonomie et Habitat
VI.2 Caractéristiques
VI.3 Organisation du génome
VI.4 Équipements de survie
VII OBJECTIFS DE LA THESE 
MATERIELS ET METHODES 
I MATERIELS 
I.1 Souches
I.2 Plasmides
II TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE 
II.1 Manipulation de l’ADN recombinant
II.1.1 Extraction de l’ADN génomique d’Halobacterium salinarium
II.1.2 Amplification par PCR
II.1.3 Précipitation de l’ADN
II.1.4 Séparation et purification des fragments d’ADN
II.1.5 Transformation
II.1.6 Préparation de l’ADN plasmidiqu
II.2 Manipulation de l’ARN
II.2.1 Extraction de l’ARNm d’Halobacterium salinarium
II.2.2 Northern Blot
II.2.3 Construction des sondes et marquage des sondes au 32P radioactif
II.2.4 Transcription des sondes in vitro et marquage au 32 P radioactif
II.2.5 Hybridation et détection par autoradiographie
II.3 Ribonuclease Protection Assay
II.3.1 Extraction de l’ARNm d’intérêt
II.3.2 Construction, clonage de la sonde d’intérêt et transcription in vitro
II.3.3 Hybridation de l’ARN contre la sonde et digestion à la ribonucléase
II.4 Extension d’amorce ou Primer extension
III TECHNIQUES DE BIOCHIMIE ET DE BIOLOGIE CELLULAIRE 
III.1 Culture et Expériences de stress
III.2 Immunodétection
III.2.1 Purification des anticorps sur colonne d’affinité
III.2.2 Préparation des extraits protéiques et détermination de la concentration protéique
III.2.3 Séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide
III.2.4 Coloration des gels au bleu de Coomassie
III.2.5 Technique de Western Blot
III.2.5.1 Electrotransfert des protéines sur membrane
III.2.5.2 Coloration de la membrane de PVDF
III.2.5.3 Immunodétection des protéines sur la membrane
III.3 Immunoprécipitation
III.4 Techniques de Purification
III.4.1 Purification du complexe natif
III.4.1.1 Clarification des extraits
III.4.1.2 Chromatographie d’interaction hydrophobe
III.4.1.3 Chromatographie échangeuse des ions
III.4.1.4 Hydroxylapatite
III.4.1.5 Chromatographie sur Gel-filtration
III.4.2 Expression et Purification des protéines PAN recombinantes
III.4.2.1 Clonage des protéines recombinantes
III.4.2.2 Expression des protéines recombinantes
III.4.2.3 Essais de Purification des protéines recombinantes
III.5 Séparation sur Gradient de sucrose
III.6 Gels Bidimensionnels
III.6.1 Extraction et solubilisation de l’échantillon protéique
III.6.2 Première dimension
III.6.3 Deuxième dimension
III.6.4 Coloration du gel au nitrate d’argent
•OUTILS DE BIOINFORMATIQUE
CHAPITRE I : LES DEUX PANS D’HALOBACTERIUM SALINARIUM 
I ANALYSE DES SEQUENCES PROTEIQUES DES DEUX PANS D’HALOBACTERIUM SALINARIUM 
I.1 Comparaison des deux PANs au niveau de la séquence
I.2 Comparaison des protéines PANs halophiles par rapport à leurs homologues
I.2.1 Homologie des protéines PANs halophiles à leurs orthologues halophiles
I.2.2 Homologie des protéines PANs à leurs homologues archaéobactériens et eucaryotes
II LES DEUX PROTEINES PAN A ET PAN B SONT EXPRIMEES DANS HALOBACTERIUM ET EXISTENT SOUS DEUX FORMES DIFFERENTES 
II.1 Immunodétection des PANs dans les extraits totaux d’Halobacterium salinarium
III LES DEUX PANS EXISTENT SOUS DEUX ISOFORMES DANS LES EXTRAITS D’HALOBACTERIUM SALINARIUM TRONQUEES DANS LEUR REGION N-TERMINALE 
i. Gel bidimensionnel sur un extrait protéique partiellement purifié
ii. Immunoprécipitation
iii. Purification totale ou partielle des PANs et de leurs isoformes à partir d’extraits protéiques totaux d’Halobacterium
III.1 Mécanismes responsables de l’hétérogénéité en N-terminale chez les PANs
III.1.1 Utilisation alternée de deux départs de traduction
III.6.4.1 Deux départs de transcription des PANs
III.2 Discussion sur l’hétérogénéité N-terminale des protéines PANs
CHAPITRE II : OLIGOMERISATION ET INTERACTION DES PANS 
I ETUDES DES PANS RECOMBINANTES IN VITRO 
II TENTATIVES DE PURIFICATION DU (DES) COMPLEXE(S) PANS A PARTIR DES EXTRAITS D’HALOBACTERIUM 
III OLIGOMERISATION ET INTERACTION DES PANS IN VIVO 
III.1 Localisation cellulaire des PANs dans les cellules
III.2 Etat d’oligomérisation des PANs et association au protéasome
III.3 Les PANs sont capables d’interagir pour former un complexe hétérooligomérique
III.4 Discusssion sur l’oligomérisation et l’interaction des PANs
CHAPITRE III : ROLE CELLULAIRE DES PANS 
I CO- REGULATION DES PANS AU COURS DE LA CROISSANCE 
I.1 Introduction
I.2 Etude d’expression des PANs au cours de la croissance
I.2.1 Régulation au niveau transcriptionnel
I.2.2 Régulation au niveau protéique
I.3 Signification physiologique de la co-régulation des PANs en fonction de la croissance
II REGULATION DES PANS EN FONCTION DU STRESS 
II.1 Introduction
II.2 Régulation du protéasome et des PANs après un choc thermique et salin
II.2.1 Réponse au niveau transcriptionnel
II.2.2 Régulation au niveau post-transcriptionnel
II.2.3 Discussion sur la réponse des PANs au stress
II.3 Co-transcription de PAN B avec d’autres gènes en conditions de stress
II.4 Réponse cellulaire des archéobactéries halophiles dans l’adaptation à de faibles concentrations salines
III.5 Réponse cellulaire des archéobactéries halophiles après inhibition du protéasome par la drogue NLVS
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 

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