Les antibiotiques : un outil thérapeutique 

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Les antibiotiques : un outil thérapeutique

La sédentarisation de l’espèce humaine a eu pour conséquence une augmentation de la densité des populations. Ce nouveau mode de vie fut propice à la propagation des premiers fléaux imputables à des maladies infectieuses pouvant même aboutir à l’effondrement de certaines civilisations (13–15). La lutte contre les infections a été depuis un enjeu majeur, et l’utilisation des antibiotiques le moyen de lutte le plus efficace à ce jour.
Ce n’est qu’au 19ème siècle qu’un lien entre apparition de maladies infectieuses et présence de microorganismes est fait suite aux travaux de Louis Pasteur (1822-1895) et de Robert Koch (1843-1910) dont les postulats éponymes, ci-dessous au nombre de quatre, permettent de vérifier ce lien de cause à effet :
✓ L’agent responsable doit être présent lors de l’infection mais absent chez un individu sain
✓ Il doit être isolable et amplifiable en culture pure
✓ Inoculé à un individu sain, il doit déclencher les mêmes symptômes
✓ L’agent doit être le même après isolement sur le nouvel hôte
Cette approche a, par la suite, orienté la recherche médicale vers l’identification des agents infectieux ainsi que leur élimination et le contrôle de leur propagation avec principalement l’utilisation des antibiotiques.
Les antibiotiques, terme proposé par Dubos en 1940 (du grec anti, contre et bios, la vie), peuvent être classés en fonction de leur mode d’action (bactériostatique ou bactéricide), leur spectre d’activité (large spectre ou spectre étroit), leur voie d’administration (orale ou parentérale), leur cible thérapeutique ou leur structure chimique.
De nos jours, le terme « antibiotiques » englobent les composés naturels, synthétiques et hémi-synthétiques. Depuis la mise en évidence de leur action (16), ils ont été utilisés en santé humaine, animale et végétale comme protection contre les pathogènes. En agriculture, ils sont également employés en prophylaxie pour limiter l’apparition et la dissémination de maladies, mais aussi comme facteurs de croissance à des doses sub-thérapeutiques, pour une longue durée et sur un grand nombre d’animaux (17).
L’efficacité des antibiotiques et leur utilisation ont augmenté l’espérance et la qualité de vie des êtres humains. Plus de 7000 substances antibiotiques ont été découvertes mais du fait de la toxicité de certaines molécules seulement une centaine est utilisée pour traiter les humains et les animaux (1).
Les antibiotiques ciblent des fonctions essentielles à la croissance des bactéries, notamment en inhibant la synthèse de la paroi cellulaire, des acides nucléiques, des protéines ou en inhibant des voies métaboliques.
Figure 1 : Cibles thérapeutiques des antibiotiques
Lewis K. 2013. Platforms for antibiotic discovery. Nat Rev Drug Discov 12:371–387
Par la suite nous ne présenterons que quelques exemples d’antibiotiques pour chaque cible thérapeutique.

Antibiotiques qui inhibent la synthèse protéique

Les aminosides

Les aminoglycosides ou aminosides sont les premiers antibiotiques découverts après un criblage systématique de l’activité biologique de produits issus des cultures de Streptomyces spp par Selman Waksman (1888-1973). La streptomycine est la première molécule découverte de cette famille et sera introduite en thérapie en 1944. Ce sont des antibiotiques à large spectre avec une activité contre les bactéries à Gram négatif (Gram-) et les Mycobactéries.
Figure 2 : Structure de la Streptomycine
D’après Kwiatkowska B. et al. 2013. Immune system as a new therapeutic target for antibiotics. Adv Biosci Biotechnol 4:91–101
Les aminoglycosides se composent de sucres aminés reliés par des ponts glycosidiques à un noyau central aminocyclitol ou streptamine. Ils se fixent à la sous-unité 30S du ribosome, inhibant ainsi la synthèse protéique. Toutefois, l’action bactéricide rapide laisse à penser que d’autres mécanismes sont impliqués, comme par exemple une désorganisation de la membrane externe (Gram-), comme montrée pour la gentamicine (18), entrainant une fuite du contenu cellulaire et donc un effet bactéricide rapide. Ce sont des molécules dont l’efficacité dépend de la concentration. Elles ont un effet post-antibiotique signifiant que les bactéries continuent de mourir même après retrait de la molécule qui s’est accumulée dans le milieu intracellulaire.
Les aminoglycosides présentent toutefois une ototoxicité et une néphrotoxicité, et sont donc utilisés en monodose quotidienne (19,20).

Les tétracyclines

Les tétracyclines ont été découvertes dans les années 1940. Elles sont produites par Streptomyces spp ou par hémisynthèse et sont des molécules à large spectre couvrant une large variété de bactéries à Gram positif (Gram+) et à Gram- et avec très peu d’effets secondaires.
Figure 3 : Structure générale des tétracyclines
Yeon Seok Kim et al. 2009. Analytica chimica acta 634(2):250-4
Elles sont très efficaces pour lutter contre des agents intracellulaires. Elles sont constituées de quatre cycles accolés, d’où leur nom, auxquels sont fixés des groupements fonctionnels. Le représentant le plus simple est la 6-deoxy-6-déméthyl tétracycline. Ces molécules inhibent la synthèse protéique en empéchant la liaison des aminoacyl ARNt au ribosome bactérien (21), et ont une activité bactériostatique.

Les macrolides

Les macrolides sont des molécules naturelles produites par Streptomyces spp ou obtenues par hémisynthèse. La première molécule isolée en 1950 a été appelée pikromycine à cause de son gout amer (du grec pikro signifiant amer). Ils sont constitués d’un noyau lactonique et sont classés en fonction de la taille de ce cycle sur lequel est fixé un sucre aminé et/ou un sucre neutre. Un des plus connus est l’érythromycine. Ils sont surtout efficaces contre les bactéries aérobies à Gram+. Du fait de l’imperméabilité partielle de la membrane externe des bactéries à Gram- à ces composés hydrophobes, leur concentration dans le cytoplasme est 100 fois plus faible que chez les Gram+ (22). Les macrolides se fixent à la sous-unité 50S des ribosomes procaryotes au niveau du canal de sortie du peptide néo-synthétisé (23). L’inhibition de la synthèse protéique leur confère plutôt une activité bactériostatique.
Figure 4 : Structure de l’érythromycine
D’après Kwiatkowska B. et al. 2013. Immune system as a new therapeutic target for antibiotics. Adv Biosci Biotechnol 4:91–101

Antibiotiques agissant sur les acides nucléiques

La rifampicine

Cette molécule appartient à la famille des ansamycines qui sont des molécules lipophiles traversant facilement les membranes. Elles sont composées de deux cycles aromatiques reliés par une chaîne aliphatique (24). La rifampicine est un dérivé hémi-synthétique de la Ryfamycine B produite par Nocardia mediterranei. C’est une molécule à large spectre qui inhibe la transcription au niveau de son initiation par blocage de l’ARN polymérase ADN dépendante (25). C’est un antibiotique bactéricide avec un effet post-antibiotique du fait de sa liaison irréversible à sa cible.
Figure 5 : Structure de la rifampicine
Agrawal S. et al. 2004. Solid-state characterization of rifampicin samples and its biopharmaceutic relevance. Eur J Pharm Sci 22:127–144

Les quinolones

L’acide nalidixique de la famille des quinolones a été découvert en 1962 et introduit cinq ans plus tard en utilisation clinique pour le traitement des infections urinaires impliquant des entérobactéries (26). Après une perte d’intérêt pour cette molécule, une deuxième génération de quinolones, avec un spectre d’action élargi et ne nécessitant qu’une prise journalière, les fluoroquinolones, a été utilisée à partir de la fin des années 70. Ce sont des antibiotiques synthétiques, concentration dépendants (27), à large spectre et avec une activité bactéricide rapide. Les quinolones agissent sur l’ADN gyrase et la topoisomérase IV conduisant à un défaut de synthèse de l’ADN et à la mort de la bactérie (28).
Figure 6 : Structure générale des quinolones

Antibiotiques avec une action sur la membrane

Les polymyxines sont des antibiotiques produits naturellement par des espèces de Paenibacillus polymyxa. Plusieurs classes (A, B, C, D et E) existent mais seules deux sont utilisées en clinique. Il s’agit de la polymyxine B et de la polymyxine E aussi appelée colistine (29). Ce sont des composés constitués d’un cycle de 7 acides aminés et d’une chaîne latérale sur laquelle est lié un acide gras. Ils ont donc des propriétés hydrophiles et lipophiles (détergent) responsables de leurs modes d’action antibactériens. Le principal consiste en la déstabilisation des membranes bactériennes. Les polymyxines se fixent au lipide A, constituant du lipopolysaccharide (LPS) ce qui aboutit à la perméabilisation de la membrane externe. La membrane interne est à son tour lysée par les polymyxines ayant atteint l’espace périplasmique. Les polymyxines ne sont efficaces que sur les bactéries à Gram-. Elles présentent une néphrotoxicité mais leur utilisation a regagné de l’intérêt pour le traitement d’infections dues à des bactéries à Gram- multi-résistantes (30).
Figure 7 : Structures des Polymyxines B et E
Gallardo-Godoy A et al. 2016. Activity and Predicted Nephrotoxicity of Synthetic Antibiotics Based on Polymyxin B. J Med Chem 59:1068–1077

Antibiotiques qui inhibent une voie métabolique

Le triméthoprime, de la famille des diaminopyrimidines, est un inhibiteur compétitif de la dihydrofolate réductase qui catalyse la réduction de l’acide dihydrofolique en acide tétrahydrofolique.
Figure 8 : Structure du triméthoprime
L’acide tétrahydrofolique est un cofacteur de la synthèse des bases puriques et pyrimidiques. Le triméthoprime est un antibiotique bactériostatique temps dépendant qui inhibe la synthèse de l’ADN (31). Il est utilisé en synergie avec le Sulfaméthoxazole (32), de la famille des sulfamides, et cette association a une action bactéricide dans le cas de cystites, pyélonéphrites ou infections digestives.

Antibiotiques inhibant la synthèse du peptidoglycane

Avant des présenter ces antibiotiques, nous allons présenter la paroi bactérienne et un constituant majeur de cette dernière, le peptidoglycane (PG)

La paroi bactérienne

Du fait de leur environnement hostile et changeant, les cellules bactériennes se sont protégées derrière un rempart. Deux structures de ce rempart sont mises en évidence par Christian Gram en 1884 grâce à un protocole de coloration qui différencie les bactéries : certaines conservent la coloration après rinçage à l’éthanol, alors que d’autres la perdent. On parlera dès lors de bactéries à Gram positif pour les premières et Gram négatif pour les secondes (33).
La paroi des bactéries à Gram négatif se compose de trois couches principales :
✓ la membrane externe
✓ le peptidoglycane (PG) qui permet à la bactérie de résister aux contraintes de son environnement et lui donne sa forme
✓ la membrane interne (ou membrane cytoplasmique).
Les deux membranes délimitent un compartiment appelé espace périplasmique. La paroi des bactéries à Gram positif quant à elle ne possède pas de membrane externe qui chez les bactéries à Gram- a un rôle protecteur contre les molécules toxiques et permet également de stabiliser la structure de la bactérie. Ce manque est donc compensé par une couche de PG plus épaisse.
Figure 9 : Schéma de la paroi des bactéries

Le peptidoglycane, structure et biosynthèse

Le peptidoglycane, aussi appelé muréine, se situe sur la face externe de la membrane plasmique et donne sa forme à la bactérie. Il permet aussi de maintenir l’intégrité cellulaire contre la pression osmotique interne et lors de la division cellulaire. L’absence de cette structure rigide provoque dans la plupart des cas la mort de la bactérie par lyse cellulaire (34). C’est un hétéropolymère composé de chaînes glucidiques reliées entre elles par des chaînes peptidiques ou pentapeptide.
La synthèse du PG (FIGURE 10) commence par la synthèse de son précurseur cytoplasmique sous l’action des enzymes de la famille Mur pour aboutir à la molécule soluble UDP-MurNac-pentapeptide (35). Cette molécule est ensuite associée à la membrane plasmique grâce à la protéine MraY pour donner le Lipide I. La protéine MurG ajoute le groupement UDP-GlcNac pour former le Lipide II. Ce précurseur disaccharidique serait transloqué à la face externe de la membrane plasmique par un transporteur membranaire de type flippase (36).
Dans l’espace périplasmique auront lieu les étapes de polymérisation des unités disaccharidiques par des glycosyltranférases ainsi que la formation des liaisons entre les chaines peptidiques par des transpeptidases. Ces activités sont portées par des protéines appelées protéines liant les pénicillines ou PLP.
La transglycosylation aboutit à la formation d’une liaison β-1,4 entre deux MurNac et GlcNac successifs.
Figure 10 : Biosynthèse du peptidoglycane
Adapté de Ruiz N. 2008. Bioinformatics identification of MurJ (MviN) as the peptidoglycan lipid II flippase in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci 105:15553–15557.
La transpeptidation (37) se déroule en deux étapes. Dans un premier temps, l’attaque nucléophile de la serine active de la PLP conduit à la liaison de l’enzyme à un pentapeptide. Cette réaction libère le D-Ala en position 5 du pentapeptide. Dans un deuxième temps, le groupement muréine-tétrapeptide réagit avec un groupement amine primaire du résidu en position 3 d’une chaîne voisine. Il y a formation d’une liaison amide 4-3 et libération de la PLP avec sa sérine activée (FIGURE 11).
Figure 11 : Les étapes de transpeptidation
Adapté de Lavollay M (cours antibiorésistance 2016)
Plusieurs familles d’antibiotiques ciblent le dipeptide D-Ala-D-Ala et bloquent la deuxième réaction, ce qui inhibe la formation du PG.

Les glycopeptides

Les glycopeptides sont des antibiotiques utilisés contre des infections impliquant des bactéries pathogènes à Gram+ multi résistantes comme Staphylococcus aureus, Enterococcus spp, et Clostridium difficile. Ils sont considérés comme le traitement de dernier recours contre des Staphylococcus aureus résistants à la méthicilline (SARM). Ceux sont des heptapeptides produits par des actinomycètes. La vancomycine introduite en 1958 en clinique et la teicoplanine, en 1988, sont les représentants de la première génération (38).
Les glycopeptides inhibent la synthèse du peptidoglycane (PG) en se liant au dipeptide terminal D-Ala-D-Ala des précurseurs du PG. Cette liaison séquestre le substrat des transpeptidases et des transglycosylases empêchant l’élongation et la polymérisation du PG. Le PG est donc plus fin et la membrane endommagée, la cellule devient sensible à la lyse, ce qui contribue à l’effet bactéricide.
Figure 12 : Les glycopeptides de première génération
D’après Binda et al. 2014. Old and New Glycopeptide Antibiotics: Action and Resistance. Antibiotics 3:572–594.

La fosfomycine

La fosfomycine est une molécule produite par des Streptomyces qui a été découverte en 1969 disponible sous trois formulations, deux pour une administration par voie orale, la fosfomycine trométhamine et la fosfomycine calcique, et une formulation injectable, la fosfomycine sodique (39). La fosfomycine inhibe la synthèse du peptidoglycane dans la phase précoce de sa biosynthèse en se liant à une cystéine du suite actif de MurA (40), enzyme responsable de la formation du précurseur cytoplasmique UDP-MurNac du PG. La fosfomycine est un antibiotique à spectre large (41) capable de pénétrer les biofilms (42).
Figure 13 : Structures moléculaires des formulations de la fosfomycine
A : Fosfomycine trométamine, B : fosfomycine calcique, C : fosfomycine sodique. Falagas et al. 2016. Fosfomycin. Clin Microbiol Rev 29:321–347.

Les bêta-lactamines

En 1929, Alexander Fleming (1881-1955) observe que la croissance d’un champignon, Penicillium notatum, semble avoir une activité antimicrobienne sur ses cultures de Staphylococcus aureus (16).
Figure 14 : Effet de Penicillium notatum sur Staphylococcus aureus
D’après Fleming. 1929
Une molécule libérée par le champignon inhibait dans la zone adjacente à sa pousse la croissance bactérienne (FIGURE 14). Il donnera le nom de pénicilline à cet inhibiteur d’après son organisme d’origine.
L’instabilité de la molécule et sa difficulté d’extraction ne lui permettront pas de poursuivre vers une application thérapeutique. Ce sont les recherches de Ernst Chain et Howard Florey qui rendront cette utilisation possible en 1940 (13). La pénicilline a joué un rôle majeur dans le conflit de la seconde guerre mondiale en diminuant drastiquement le nombre de décès liés aux infections suite à des blessures. La pénicilline a donc été la première molécule thérapeutique naturelle montrant une activité antibactérienne in vivo, non inactivée dans l’organisme, et non toxique pour l’Homme (43).
L’utilisation de la pénicilline marque le début de l’ère des antibiotiques.
De cette molécule découlera la famille des bêta-lactamines (β-lactamines). Ce sont des molécules à large spectre, avec une action temps dépendante et une faible toxicité pour les organismes traités. Leur obtention est facile et engendre de faibles coûts de production (44). Pour ces raisons, elles correspondent à la famille d’antibiotiques la plus fréquemment utilisée en antibiothérapie (45, 46). L’élément structural commun à toutes les molécules de cette famille est le noyau β-lactame. L’environnement électronique de ce noyau est instable et sa structure est contrainte ce qui le rend sensible aux attaques nucléophiles (47) et conditionne son activité antibiotique spécifique.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE 
1. L’origine des antibiotiques
2. Les antibiotiques : un outil thérapeutique
2.1. Antibiotiques qui inhibent la synthèse protéique
2.1.1. Les aminosides
2.1.2. Les tétracyclines
2.1.3. Les macrolides
2.1.4. La rifampicine
2.2. Antibiotiques agissant sur les acides nucléiques
2.3. Antibiotiques avec une action sur la membrane
2.4. Antibiotiques qui inhibent une voie métabolique
2.5. Antibiotiques inhibant la synthèse du peptidoglycane
2.5.1. La paroi bactérienne
2.5.2. Le peptidoglycane, structure et biosynthèse
2.5.3. Les glycopeptides
2.5.4. La fosfomycine
2.5.5. Les bêta-lactamines
2.5.6. Les β-lactamines : les sous familles
3. La résistance aux antibiotiques
3.1. Notions de CMI, résistance et sensibilité aux antibiotiques
3.2. Antibiorésistance : impact économique et sociétal
3.3. Les mécanismes de résistance aux antibiotiques
3.3.1. L’imperméabilité aux antibiotiques
3.3.2. L’efflux des molécules d’antibiotique
3.3.3. La modification de la cible thérapeutique
3.3.4. La modification des molécules d’antibiotique
3.4. Les entérobactéries et les béta-lactamases
3.4.1. Les entérobactéries
3.4.2. Le concept « One health » et l’antibiorésistance
3.5. Les β-lactamases chez les entérobactéries
3.5.1. Les β-lactamases à sérine, classe A de Ambler
3.5.2. Les β-lactamases à spectre étendu, classe A de Ambler
3.5.3. Les carbapénémases à sérine, classe A de Ambler
3.5.4. Les métallo-β-lactamases, classe B de Ambler
3.5.5. Les β-lactamases, classe C de Ambler
3.5.6. Les β-lactamases, classe D de Ambler
3.5.7. Répartition géographique des différentes carbapénémases
4. Détection et identification des E-BLSE
4.1. Détection des entérobactéries produisant des CTX-Ms.
4.1.1. L’antibiogramme
4.1.2. Les milieux sélectifs
4.1.3. Les tests de confirmation
4.1.4. L’identification des CTX-Ms
4.2. Détection des entérobactéries produisant des carbapénémases
4.2.1. Tests de diffusion sur gélose
4.2.2. Méthode d’inhibition des carbapénèmes (MIC)
4.2.3. Tests d’hydrolyse des carbapénèmes
4.2.4. Méthodes de détection moléculaires
4.2.5. Détection avec des tests immunochromatographiques
4.3. Tableau comparatif : temps d’exécution et prix des tests
PROJET DE THESE
MATERIEL ET METHODES 
1. Matériel biologique utilisé
1.1. Les souris
1.2. Les protéines recombinantes
1.3. Les anticorps monoclonaux
1.4. Les bactéries
2. Tampons et réactifs utilisés pour les dosages
2.1. Composition des tampons
2.2. Préparation des plaques CAS
2.3. Préparation des traceurs biotinylés
2.4. Préparation des traceurs AChE
2.4.1. Couplage à l’AChE
2.4.2. Mesure de l’activité enzymatique
2.5. Préparation des anticorps traceurs or colloïdal
3. Obtention des protéines recombinantes
3.1. Clonage des gènes CTX-M-2, CTX-M-14
3.1.1. Amplification par PCR des gènes CTX-M-2 et CTX-M-14
3.1.2. Digestion du produit PCR et du vecteur pET22b (+)
3.1.3. Clonage dans pET22b (+) et transformation d’E. coli DH5α
3.1.4. Criblage des clones recombinants obtenus
3.1.5. Purification et contrôle de la séquence du gène d’intérêt.
3.1.6. Transformation d’E. coli BL21 (DE3) chimio-compétentes
3.2. Clonage du gène CTX-M-15
3.2.1. Purification du vecteur pET9a CTX-M-15
3.2.2. Mutagénèse pour ajouter une étiquette poly-histidine
3.2.3. Digestion du produit PCR par DpnI
3.2.4. Transformation de bactéries E. coli BL21 (DE3)
3.2.5. Criblage des clones de bactéries recombinantes
3.2.6. Digestion du produit PCR par EcoRI
3.2.7. Purification et contrôle de la séquence du gène d’intérêt
3.3. Production et purification des protéines recombinantes
3.3.1. Sélection des conditions d’expression avec induction à IPTG
3.3.2. Préparation des extraits bactériens
3.3.3. Immobilisation des extraits bactériens sur phase solide
3.3.4. Dosage des protéines recombinantes immobilisées
3.3.5. Production en grande quantité des protéines recombinante
3.3.6. Purification des protéines recombinantes
3.3.7. Quantification et analyse SDS-PAGE
4. Obtention des anticorps monoclonaux
4.1. Immunisation des souris
4.2. Evaluation des réponses immunitaires
4.3. Obtention des hybridomes et isotypage des anticorps
4.4. Production et purification des anticorps monoclonaux
4.5. Concentration des anticorps purifiés et analyse SDS-PAGE
4.6. Utilisation des anticorps en Western Blot
5. Les bandelettes pour détecter les β-lactamases
5.1. Description
5.2. Préparation des bandelettes
5.3. Choix du couple d’anticorps pour le dosage
5.3.1. L’analyse combinatoire
5.3.2. La limite de détection avec la protéine recombinante
5.3.3. Limite de détection avec une souche exprimant la β-lactamase
5.3.4. Détermination des épitopes des anticorps
6. Validation des tests au format commercial
6.1. Validation avec le souchier du CNR
6.2. Validation d’une utilisation en routine
7. Détection dans l’urine et les hémocultures des CTX-Ms
7.1. Préparation des bandelettes
7.2. Préparation du traceur or colloïdal
7.3. Préparation et dosage des échantillons en urine
7.4. Préparation et dosage des échantillons en hémoculture
RESULTATS ET DISCUSSIONS 
1. Production des protéines recombinantes
1.1. Bilan des conditions de culture et rendements.
1.2. Analyse SDS-PAGE des protéines recombinantes
1.3. Discussion
2. Obtention des anticorps monoclonaux
2.1. Réponses immunitaires obtenues
2.2. Interprétation des résultats
2.3. Fusions et criblage des anticorps monoclonaux
2.4. Isotypes et classe des anticorps monoclonaux
2.5. Obtention des anticorps monoclonaux purifiés
2.5.1. Production et purification des anticorps
2.5.2. Concentration des anticorps purifiés
2.5.3. Analyse SDS-PAGE des anticorps KPC purifiés
2.5.4. Western blot avec les protéines recombinantes
2.6. Discussion
3. Les étapes de développement et de validation de nos tests
3.1. Les analyses combinatoires
3.2. Les résultats des tests combinatoires
3.3. Les groupes de similarité épitopique
3.4. Sélection du meilleur couple pour chaque β-lactamase
3.5. Préparation des bandelettes au format commercial
3.6. Validation des tests au format commercial
4. Préparation et validation des tests pour la détection des CTX-M
4.1. Préparation du test pour la détection de CTX-M-15
4.1.1. Evaluation des anticorps avec la protéine recombinante
4.1.2. Validation du test CTX-M (G1) avec le souchier « carbapénémases »
4.1.3. Utilisation du mono-test CTX-M (G1) en routine
4.2. Préparation du test pour la détection de CTX-M-2
4.2.1. Evaluation des anticorps avec la protéine recombinante
4.2.2. Détection de CTX-M-2 exprimée par E. coli.
4.3. Préparation du test pour la détection de CTX-M-14
4.3.1. Evaluation des anticorps avec la protéine recombinante
4.3.2. Tests de spécificité de tous les anticorps CTX
4.3.3. Détection de CTX-M-14 exprimée par E. coli
4.4. Identification des épitopes des anticorps choisis
4.5. Détection directe des CTX-Ms dans l’urine et les hémocultures
4.5.1. La bandelette CTX-M 4G : trois lignes test
4.5.2. Détection de souches CTX-M dans l’urine et les hémocultures
4.6. Mise au point et sélection du tampon d’extraction
4.6.1. Caractéristiques du tampon d’extraction
4.6.2. Mise au point d’un tampon d’extraction
4.7. Bilan et discussion
5. Développement et validation des tests pour la détection des carbapénémases
5.1. Préparation du test pour la détection de NDM
5.1.1. Evaluation des anticorps avec la protéine recombinante
5.1.2. Evaluation des anticorps avec des souches NDM
5.1.3. Validation du mono-test NDM avec le souchier « carbapénémases »
5.1.4. Efficacité du tampon d’extraction en fonction de l’espèce bactérienne
5.1.5. Utilisation du mono-test NDM en routine
5.2. Préparation du test pour la détection de OXA-48
5.2.1. Spécifité des anticorps pour des variants d’OXA-48
5.2.2. Evaluation des anticorps avec la protéine recombinante
5.2.3. Evaluation des anticorps avec des souches OXA-48-like
5.2.4. Validation du mono-test OXA-48 avec le souchier « carbapénémases »
5.2.5. Utilisation en routine du mono-test OXA-48
5.3. Préparation du test pour la détection de KPC
5.3.1. Evaluation des anticorps avec la protéine recombinante
5.3.2. Evaluation des anticorps avec des souches KPC
5.4. Détermination des épitopes pour les anticorps NDM, OXA et KPC
5.5. Validation du test multiplex Carba5
5.5.1. Préparation du Carba5
5.5.2. Lecture des cassettes au lecteur
5.5.3. Validation du Carba5 avec le souchier « carbapénémases »
5.5.4. Utilisation du Carba 5 en routine.
5.6. Bilan et discussion
DISCUSSION GENERALE 
CONCLUSION GENERALE

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