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Caractères biochimiques
L’étude des différents caractères biochimiques et métaboliques des souches de staphylocoques a permis le développement de galeries d’identification rapides et efficaces, permettant de définir les différents profils biochimiques de souches appartenant à une même espèce[25] .
Caractères généraux
Les staphylocoques possèdent une catalase à l’exception de S. aureus sous espèce anaérobius que l’on retrouve exclusivement chez les moutons[25, 27] et qui est une souche anaérobie stricte. Ce sont des germes dépourvus d’oxydase en dehors de S.lentus, S. sciuri et S. caseolyticus[25, 21].
Production d’uréase
Les bactéries hydrolysent toute l’urée mais seules celles ayant une uréase constitutive, c’est à dire dont la synthèse est indépendante de la présence du substrat, vont arriver à alcaliniser le milieu, entraînant le virage de l’indicateur coloré.
L’uréase est également une enzyme inductible. La recherche de l’uréase repose sur la libération d’ions ammonium qui alcalinisent le milieu, entraînant le virage du rouge de phénol du jaune au rouge cerise.
Production d’acétoïne
Les micro-organismes produisent lors de leur métabolisme, de nombreux produits de dégradation qui comme dans le cas ci-présent peuvent être recherchés.
L’acétoïne en langage courant, ou hydroxy-3-butanone ou encore dans la nomenclature ancienne acétyl-méthyl-carbinol (AMC) est un produit de dégradation du glucose au cours de la fermentation 2-3 butyléne glycolique en passant par l’acétolactate et le diacétyl. Elle peut également être obtenue par condensation de deux molécules de pyruvate.
Il existe entre autres, la méthode conventionnelle de Voges-Proskauer miniaturisée ou non, incorporée aux méthodes biochimiques d’identification des staphylocoques disponibles dans le commerce.
Production de décarboxylases
Les décarboxylases sont des enzymes qui sont actives à pH acide, le milieu d’étude sera donc acidifié par la fermentation du glucose puis réalcalinisé par l’action des décarboxylases sur le substrat qui est un acide aminé.
La production de l’ornithine décarboxylase (ODC) concerne essentiellement l’espèce S. lugdunensis et secondairement certaines souches de S. epidermidis dont l’enzyme a une activité retardée.
Les décarboxylases clivent les acides aminés avec formation de l’amine correspondante et libération de dioxyde de carbone. Ces enzymes sont dites induites et leur synthèse est favorisée par un pH acide allant de 3,5 à 5,5 et des conditions d’anaérobiose obtenues en recouvrant le puits d’huile de paraffine.
Leur caractérisation se fera par la mise en évidence de la modification du pH du milieu lié à la production d’amine qui l’alcalinise. Les enzymes recherchées le plus souvent sont :
– l’ornithine décarboxylase (ODC)
– l’arginine dihydrolase (ADH)
– la lysine décarboxylase (LDC)
Production de la bêta-galactosidase
La ß-galactosidase est une enzyme bactérienne inductible, existant à un niveau de base dans le milieu intracellulaire, capable de scinder la molécule de lactose en sucres simples que sont le glucose et le galactose après avoir traversé la paroi cellulaire sous l’action de la béta-galactosidase perméase.
Le terme ONPG hydrolase est plus à propos que celui de bệta-galactosidase dans la mesure où il précise que le substrat utilisé est l’ONPG et non le lactose.
En effet ; il existe des germes qui reconnaissent l’ONPG du coté du nitro-2-phénol et non de celui du bệta-galactotoside. Ces germes ont donc une activité ONPG hydrolase tout en ne fermentant pas le lactose.
Le test à l’ONPG est une technique relativement simple, basée sur l’action directe de l’enzyme sur une molécule chromogène pouvant être l’ortho-nitrophényl-bêta-Dgalactopyranoside, ou le 2-naphtol-béta-D-galactopyranoside. Ceux-ci sont utilisés comme substrats et libèrent respectivement l’orthonitrophénol jaune et le bêta-naphtol qui se combine au sel de Fast blue B en solution dans le 2-méthoxyéthanol pour donner une coloration rouge pourpre.
Réduction des Nitrates
La réduction des nitrates et des nitrites constitue un des caractères taxonomiques importants chez les staphylocoques lors de leur identification. Ce test permet d’étudier la réaction de réduction des nitrates en nitrites sous l’action du nitrate réductase produite par certains staphylocoques.
La réaction sera mise en évidence par l’addition d’acide sulfanilique et d’alphanaphtylamine qui révèlent la présence de l’ammoniaque libérée
Utilisation des hydrates de carbone
Les glucides sont utilisés de trois manières différentes par les staphylocoques : soit après conversion par l’action d’isomérases, soit après hydrolyse en sucres simples ou directement, s’ils sont fournis sous une forme simple (glucose, fructose) [29].
L’assimilation étudiée surtout par la voie fermentaire mais également par la voie oxydative se traduit presque toujours par l’accumulation de dérivés acides quelle que soit la voie de dégradation.
LA CROISSANCE BACTERIENNE
DEFINITION
La croissance est l’augmentation ordonnée de la somme de tous les composants d’un organisme. Ainsi, l’augmentation de la taille lorsqu’une cellule absorbe l’eau ou libère un lipide ou un polysaccharide n’est pas la croissance réelle. La multiplication des cellules est une conséquence de la croissance ; dans les organismes unicellulaires, la croissance conduit à une augmentation du nombre d’individus composant une population ou une culture [23].
La division bactérienne est le corollaire habituel mais non obligé de la croissance [41].
LA COURBE ET LES PHASES DE CROISSANCE
Si un milieu liquide non renouvelé est ensemencé avec des cellules bactériennes prélevées d’une culture déjà saturée et le nombre de cellules viables par millilitre déterminé régulièrement, une courbe du type de celle de la figure ci-dessous, est habituellement obtenue [23]. La courbe peut être segmentée en 7 phases représentées par les chiffres 1 – 7.
FACTEURS INFLUENCANT LA CROISSANCE
De nombreux facteurs physiologiques affectent la croissance de la cellule bactérienne et incluent la concentration en ions hydrogène de son environnement, la température, l’humidité et le potentiel d’oxydo-réduction[35] .
La température
Suivant leur comportement à l’égard de la température, on distingue classiquement des micro-organismes mésophiles (l’échelle de température est comprise entre 20 et 45°C). Les bactéries pathogènes pour l’homme font partie des mésophiles et ont un optimum aux environs de 37°C ; toutefois certaines espèces comme Listeria monocytogenes peuvent se développer à + 4°C. Cependant certaines bactéries ne se comportent qu’occasionnellement comme des parasites des organismes supérieurs (infections à bactéries opportunistes), et leurs conditions confèrent une adaptation soit à des températures inférieures à 30°C (bactéries psychrophiles), soit à des températures de l’ordre de 40 à 45°C (bactéries thermophiles) [31].
La température, paramètre sélectif pour la croissance des bactéries, conditionne la prolifération exclusive de certaines espèces dans un biotype donné. [31]
Les températures élevées sont incompatibles avec la multiplication et même la survie des bactéries, la chaleur sèche au poupinel à 180° C pendant 30 minutes et la chaleur humide par l’autoclave à 120°C pendant 15 à 30 minutes servent pour la stérilisation [22].
Le pH
Les bactéries sont généralement tolérantes à des variations de pH comprises entre 6 et 9, grâce à la régulation exercée par leur membrane à l’encontre des ions H+ [14]. Les bactéries fermentant l’urée et productrices d’ammoniaque tolèrent des pH très alcalins [22].
Dans les cultures en milieux non tamponnés, les alcalins libérés à partir notamment des réactions de décarboxylation des acides aminés ou les acides libérés par dégradation des carbohydrates peuvent modifier le pH dans des conditions telles que le milieu devient toxique pour les bactéries.
La pression osmotique
Les bactéries sont assez tolérantes vis-à-vis des variations des concentrations ioniques ; l’affinité de certaines espèces pathogènes pour la salinité est utiliséepour la réalisation de milieux sélectifs (staphylocoques, vibrion cholérique). On décrit des bactéries halophiles exigeant plus de 2% de NaCl pour cultiver tel Vibrio para haemolyticus.
Les pressions partielles d’oxygène
Les bactéries peuvent être groupées dans trois catégories selon leurs exigences en oxygène :
– Les aérobies strictes ou obligatoires sont celles qui se développent en présence d’oxygène.
– Les anaérobies strictes ou obligatoires se développent seulement en l’absence d’oxygène.
– Les aéro-anaérobies facultatives sont des bactéries qui se développent aussi bien en conditions aérobiques qu’anaérobiques. Dans ce groupe, figurent la plupart des bactéries d’intérêt médical.
Les radiations
Les bactéries sont sensibles aux rayons UV, aux rayons RX, à la lumière.
Les substances antibactériennes
Les antiseptiques, les antibiotiques s’opposent à la croissance des bactéries et sont utilisés pour les détruire. Toutefois, certaines substances sont des inhibiteurs sélectifs de certains micro-organismes et on les ajoute dans les milieux pour favoriser électivement la multiplication de bactéries insensibles.
TECHNIQUES DE MESURE DE LA CROISSANCE BACTERIENNE
La croissance bactérienne peut être appréciée en estimant, en fonction du temps, les variations de la masse bactérienne ou, plus souvent, du nombre de cellules [41].
Des concentrations microbiennes peuvent être mesurées en terme de concentration en cellules (le nombre de cellules viables par unité de volume de culture) ou de la concentration de biomasse (poids sec de cellules par unité de volume). Ces deux paramètres ne sont pas toujours équivalents, parce que le poids sec moyen de la cellule change à différentes étapes de l’évolution d’une culture. Ils ne sont pas non plus d’importance égale [23].
Deux types de méthodes sont utilisés pour mesurer la croissance bactérienne :
– les méthodes de numération,
– les méthodes quantitatives.
Deux méthodes principales peuvent être utilisées :
– numération totale : elle consiste à dénombrer au microscope ou avec des compteurs spéciaux les individus viables ou non.
Les cellules mortes ne peuvent pas être distinguées de celles en vie. Seules les suspensions denses peuvent être comptées (>107 cellules par ml), mais des échantillons peuvent être concentrés par centrifugation ou filtration pour augmenter la sensibilité ;
– numération des cellules viables : on compte les colonies bactériennes apparues sur ou dans un milieu de culture gélosé convenable, inoculé par une aliquote d’une
suspension bactérienne homogène et suffisamment diluée (10-2,10-3,10-4,10-5). Sur un milieu approprié, chaque unité viable croît et forme une colonie.
Chaque colonie pouvant être comptée s’appelle une unité formant colonies (UFC), et le nombre d’UFC est lié au nombre de bactéries viables dans le milieu. Cette méthode est plus facile et de très grande sensibilité, mais elle nécessite beaucoup de dilutions et de boîtes.
Plusieurs méthodes sont envisageables, parmi lesquelles :
– la mesure directe de la masse bactérienne : en principe, la biomasse peut être mesurée directement en déterminant le poids sec d’une culture microbienne. Les bactéries sont lavées, séchées et pesées. C’est une méthode longue qui nécessite une grande quantité de cellules pour que les pesées soient assez précises.
Mais c’est la méthode de référence (1mg de poids sec correspond à quelques milliards de corps bactériens).
– la mesure de l’activité enzymatique : mesure du pH, mesure de la consommation d’oxygène. Ces méthodes sont peu précises.
– le dosage de l’azote bactérien : cette méthode a les mêmes applications que la méthode gravimétrique.
– la mesure de la densité optique : ici on admet que l’absorption lumineuse est proportionnelle à la masse des microbes. Elle est rapide et précise, mais sa sensibilité est modérée, car il faut une teneur d’au moins 107 bactéries/ml pour obtenir une densité optique mesurable. Elle est fortement entachée d’erreurs en cas de suspensions bactériennes non homogènes.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
I-GENERALITES SUR LES STAPHYLOCOQUES
1.1. Définition
1.2. Historique
1.3. Taxonomie
1.4. Habitat
1.5. Caractères bactériologiques
1.5.1. Caractères morphologiques
1.5.2. Caractères culturaux
1.5.3. Caractères biochimiques
1.5.3.1. Caractères généraux
1.5.3.2. Production d’uréase
1.5.3.3. Production d’acétoïne
1.5.3.4. Production de décarboxylases
1.5.3.5. Production de bêta-galactosidase
1.5.3.6. Réduction des nitrates
1.5.3.7. Utilisation des hydrates de carbone
II- LA CROISSANCE BACTERIENNE
II-1 Définition
II-2 Courbe et phases de croissance
II-3 Facteurs influençant la croissance bactérienne
II-4 Techniques de mesure de la croissance bactérienne
II-5 Conditions physico-chimiques de croissance des Staphylocoques
III- LES ANTIBIOTIQUES ET L’ETUDE DE LA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES
III-1 Les antibiotiques
III-1-1 Définition
III -1-2 Mécanisme d’action
III-1-3 Classification
III-2 Méthodes d’étude in vitro de la sensibilité aux antibiotiques
III-2-1 Méthodes de dilution
III-2-1-1 en milieu liquide
III-2-1-2 en milieu solide .
III-2-2 Methodes de diffusion
III-2-2-1 Antibiogramme standard
III-2-2-2 E-test® (epsilonmeter-test) : Méthode des bandes
III-3 Facteurs influant l’étude de la sensibilité aux antibiotiques .
IV- METHODES BIOMETRIQUES D’ETUDE DE LA CROISSANCE ET PREDICTION
IV-1. La microbiologie prédictive
IV-2. La modélisation classique
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
I- MATERIELS ET MILIEUX
I-1 Matériels
I-1-1 Cadre d’étude
I-1-2 Souches bactériennes
I-1-3 Matériel pour l’indentification
I-1-4 Matériel pour l’étude de la croissance bactérienne
I-1-5 Matériel pour la conservation des souches
I-1-6 Matériel pour l’étude de la sensibilité aux antibiotique
I-2 Milieux de culture et d’identification
II- METHODES
II-1 Identification de la souche de référence et des souches de contrôle
II-2 Détermination de l’inoculum et du temps d’incubation adéquats
II-2-1. Détermination de l’inoculum bactérien
II-2-2. Détermination du temps d’incubation
III- RESULTATS ET COMMENTAIRES
III-1 Titre inoculum permettant d’obtenir le maximum de bactéries viables proches 108UFC/ml
III-2 Meilleur temps d’incubation
III-3 Tests de sensibilité de la souche de référence de S. aureus ATCC29213 au lévofloxacine
III-4 Test de sensibilité des souches de contrôle au lévofloxacine
IV- DISCUSSION
IV-1 Les souches bactériennes
IV-2 Contrôles de qualité
IV-3 Etude de la croissance par la méthode du dénombrement sur boite de pétri 57
IV-4 Facteurs environnementaux influant l’état de la croissance bactérienne
IV-5 Sensibilité des staphylocoques
IV-5-1 Inoculum bactérien
IV-5-2 Temps d’incubation
IV-5-3 Test de sensibilité des souches étudiées au lévofloxacine
IV-5-3-1 Staphylococcus aureus ATCC29213
IV-5-3-2 Staphylococcus aureus et Staphylococcus saprophyticus
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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