LES ANTIBIOTIQUES ET LE PHÉNOMÈNE DE RÉSISTANCE

Bacterial Growth Inhibition Assay

LA PROBLÉMATIQUE GLOBALE DES MALADIES INFECTIEUSES :

Dans les sociétés modernes, améliorer l’état de santé de la population est une priorité. La recherche de nouveaux traitements pour les pathologies dont les incidences et les taux de mortalité sont les plus élevés est une contribution importante à l’atteinte de cet objectif. Historiquement, les maladies infectieuses sont toujours demeurées parmi les causes de mortalité les plus importantes. Au début des années 1900, les trois plus grandes causes de décès aux États-Unis étaient trois maladies infectieuses; la pneumonie, la tuberculose et les gastro-entérites. Au cours du vingtième siècle, une meilleure application des principes d’hygiène dans la société et l’apparition de vaccins ont permis de grandement réduire la transmission des maladies infectieuses. Les taux de mortalité associés à plusieurs de ces maladies ont aussi constamment diminués jusqu’à la fin des années 1970 et ce, grâce à l’apparition de nouveaux traitements efficaces (Hughes 2001). Cependant, cette situation est surtout la réalité des pays développés puisqu’une partie importante de la population mondiale vit toujours dans des conditions favorisant la transmission de maladies infectieuses mortelles. De plus, l’accès aux vaccins et traitements qui existent est encore limité dans plusieurs pays en voie de développement. Les maladies infectieuses demeurent donc problématique pour une grande partie de la population mondiale si bien qu’il est estimé que près de 25 % des décès recensés dans le monde sont encore aujourd’hui causés par des maladies infectieuses (Fauci et Morens 2012).

Depuis de le début des années 1980, une recrudescence du taux de mortalité associé aux maladies infectieuses a été observée et ce même dans les pays développés (Hughes 2001). L’apparition de nouvelles maladies infectieuses émergentes et la réémergence de maladies connues ayant acquises des résistances aux traitements utilisés ont été identifiées parmi les causes importantes de cette recrudescence. Le phénomène de résistance des organismes microbiens face aux traitements qui ont été développés prend rapidement de l’ampleur et vient nous rappeler que la lutte contre les maladies infectieuses n’est pas terminée. La résistance aux antibiotiques utilisés dans le traitement des infections bactériennes est reconnue par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) comme la menace la plus importante pour le succès des traitements antimicrobiens (Abreu et al. 2012).

LES ANTIBIOTIQUES ET LE PHÉNOMÈNE DE RÉSISTANCE :

Dans la deuxième moitié du vingtième siècle, la médecine a été révolutionnée par la découverte des premiers antibiotiques efficaces dans le traitement des infections bactériennes. En 1928, Alexander Flemming a découvert la pénicilline à partir d’une colonie de champignons de l’espèce Pénicillium notatum. Flemming avait par hasard remarqué que la croissance de bactéries avait été inhibée autour des colonies de ce champignon (Ligon 2004). La découverte de Flemming allait devenir l’élément déclencheur de cette révolution. En effet, le métabolisme secondaire des microorganismes a été et demeure la principale source d’inspiration pour la mise au point de nouveaux antibiotiques. Entre 1940 et 1960, une vingtaine de nouvelles classes d’antibiotiques ont vu le jour (tableau 1). La majorité de celles-ci a été découverte grâce à l’étude de microorganismes produisant des metabolites avec des propriétés antibactériennes marquées.

Suite à cette période faste dans le développement d’antibiotiques, l’arsenal disponible semblait suffir pour traiter la majorité des infections problématiques pour la santé humaine. C’était cependant sans compter sur les capacités inégalées d’adaptation des bactéries. En effet, elles peuvent devenir résistantes aux traitements antibactériens qui se traduit par une croissance bactérienne malgré la présence d’antibiotiques à des  concentrations plus élevées que celles utilisées dans un cadre thérapeutique. L’apparition de ces résistances est un phénomène naturel qui résulte généralement d’une évolution par sélection naturelle. Lors du traitement d’une infection, les bactéries sensibles sont éliminées alors que celles ayant développé une résistance survivent et se reproduisent en transmettant cette nouvelle faculté. Pour plusieurs bactéries pathogènes, la proportion des infections associées à des souches résistantes a augmenté de plus en plus rapidement au cours des dernières années. Le cas du Staphylococcus aureusrésistant à  la méthicilline (SARM) permet de bien illustrer cette situation. De 1995 à 1999, la proportion des infections au S. aureus qui était causée par des SARM est passée de 1 % à 6 % au Canada (Conly 2002). Entre 2007 et 2009, il a été évalué que cette proportion avait atteint près de 25 % (Nichol et al. 2011). Aux États-Unis, la situation est encore plus alarmante puisque près de 50 % des cas d’infection au S. aureus sont des cas de SARM (Gootz 2010). Les SARM sont d’ailleurs les organismes résistants aux antimicrobiens les plus répandus au Canada ainsi que dans plusieurs régions du monde (Grundmann et al. 2006). Récemment, des souches bactériennes pathogènes résistantes à plus d’une classe d’antibiotiques (multi-résistantes) ont aussi fait leur apparition. Au moins 7 types de bactéries résistantes ou multirésistantes causent des situations problématiques dans les hôpitaux du Canada (tableau 2). La rapidité de l’augmentation de la fréquence des infections résistantes a été corrélée à une mauvaise utilisation d’antibactériens chez l’homme suite à des diagnostics incorrects ou à cause de consommations inappropriées  (Goossens et al. 2005). L’usage excessif comme promoteur de croissance chez les animaux d’élevage est aussi suspecté comme un facteur de risque important pour la propagation des gènes de résistance (Bush et al. 2011).

Concrètement, l’apparition de plus en plus fréquente de résistances aux traitements antibactériens a plusieurs impacts négatifs. Puisque le traitement antibactérien  habituellement recommandé est inefficace, un antibiotique alternatif (de seconde ligne) doit être utilisé. Généralement, ces derniers sont plus dispendieux et accompagnés d’effets secondaires plus importants. De plus, les complications associées aux traitements augmentent les durées d’hospitalisation. Conséquemment, les coûts associés aux traitements des infections résistantes sont plus élevés que pour les infections sensibles causant ainsi un poids supplémentaire sur les systèmes de santé (Mauldin et al. 2010; Bush et al. 2011). En milieu hospitalier, la présence de résistances lors d’infections nosocomiales a été associée à une hausse du taux de mortalité pour ces infections (de Kraker et al. 2011). Cette hausse signifie aussi un plus grand risque pour la vie des patients nécessitant des procédures dont les risques d’infections sont élevés comme les chirurgies majeures, les transplantations d’organes ou les traitements immunosuppresseurs (Carlet et al. 2012). Dans le cas d’infections par des souches multi résistantes, les antibiotiques de dernier recours comme les carbapénènes doivent être utilisés ce qui ouvre la porte à l’apparition de souches encore plus problématiques. La menace la plus inquiétante de l’augmentation rapide des résistances aux antibiotiques est l’apparition d’épidémies dues à des infections bactériennes qui ne pourraient pas être traitées efficacement par l’arsenal actuel d’antibiotiques.

LE RALENTISSEMENT DE LA MISE EN MARCHÉ DE NOUVELLES CLASSES D’ANTIBIOTIQUES :

Des regroupements d’experts dans le domaine des maladies infectieuses tel que la « Infectious Diseases Society of America » (IDSA) et la « World Alliance against Antibiotic Resistance » (WAAR) ont mis de l’avant différentes actions qui doivent être entreprises pour arriver à contrer l’émergence fulgurante de la résistance aux antibiotiques (Spellberg et al. 2011; Carlet et al. 2012). Parmi celles-ci, une pratique médicale plus adéquate grâce au développement d’outils de diagnostics permettant d’éviter l’utilisation erronée d’antibiotiques est une priorité. Modifier les réglementations concernant l’utilisation d’antibiotiques comme promoteurs de croissance pour l’élevage pourrait aussi contribuer à réduire la fréquence d’apparition de résistances. En combinaison avec l’application de ces mesures, le développement de nouvelles classes d’antibiotiques demeurent essentiel (Carlet et al. 2011). Le besoin de nouvelles classes d’antibiotiques est particulièrement criant à cause du ralentissement de la mise en marché d’antibiotiques qui a suivi le succès obtenu jusqu’à la fin des années 1960. En effet, seulement deux nouvelles classes d’antibiotiques ont été approuvées cours des 50 dernières années, soit les oxazolidinones et les lipopeptides (tableau 1). En 2011, il a été évalué qu’il y avait au moins 27 composés antibactériens en évaluation clinique mais que parmi ceuxci, seulement deux représentaient de nouvelles classes d’antibiotiques potentielles (Coates et al. 2011). La diminution du développement de nouvelles classes d’antibiotiques s’explique par plusieurs facteurs. Au cours des dernières décennies, la recherche au sein de l’industrie pharmaceutique a surtout été affectée au développement d’analogues des classes d’antibiotiques connues. Cette stratégie a probablement été priorisée à cause des risques de toxicité moins élevés pour les analogues que pour de nouvelles classes. Plusieurs analogues de P-lactames, de céphalosporines, de quinolones et d’aminoglycosides ont fait leur apparition sur le marché permettant de contrer temporairement certaines résistances associés à ces classes d’antibiotiques. Mais cette stratégie permet surtout « d’acheter » du temps puisqu’il y a une limite au nombre d’analogues qui peut être développé à partir d’un même squelette chimique (Coates et al. 2011). Ultimement, la recherche de nouvelles classes d’antibiotiques doit continuer. Malheureusement, le contexte actuel est défavorable puisque le retour sur l’investissement pour un nouveau composé est limité par les prescriptions qui sont de courtes durées et épisodiques. Les nouvelles classes ne sont prescrites qu’en dernier recours, surtout dans la perspective d’une utilisation adéquate limitant l’apparition de résistances. De plus, les critères réglementaires pour l’approbation d’un nouveau composé ont été resserrés et il est maintenant nécessaire d’effectuer des essais cliniques démontrant clairement une efficacité supérieure par rapport aux antibiotiques déjà sur le marché (US-department of Health and Human Services et al. 2010). Pour sortir de cette impasse, l’organisation mondiale de la santé (OMS) et le Centre Européen de Prévention et Contrôle des Maladies (CEPCM) demandent aux gouvernements d’agir rapidement pour relancer la recherche de nouvelles classes d’antibiotiques (Norrby et al. 2009; Braine 2011).

LES METABOLITES SECONDAIRES ISSUS DES PLANTES, UNE SOURCE POTENTIELLE D’ANTIBACTÉRIENS  :

ACTÉRIENS
En plus du contexte économique défavorable, il ne faut pas oublier que la découverte de nouvelles classes d’antibiotiques représente aussi un défi important en recherche. Les metabolites secondaires issus des microorganismes ont été largement étudiés pour leurs propriétés antibactériennes et il est possible que les antibiotiques « facile à découvrir » grâce à cette stratégie aient déjà été commercialisés (Coates et al. 2011). Il est donc nécessaire d’explorer de nouvelles avenues potentielles pour assurer un développement continu de nouvelles classes d’antibiotiques. En ce sens, l’étude des metabolites secondaires issus des plantes représente une alternative attrayante. En effet, les plantes ont un système de défense complexe contre les pathogènes qui diffère de celui de microorganismes. Cette défense inclue la production de metabolites secondaires induite par l’intrusion d’envahisseurs microbiens. Ces metabolites sont regroupés sous l’appellation de phytoalexines (Ahuja et al. 2012). Les plantes se servent aussi des phytoanticipines. Ces composés sont stockés et peuvent être libérés au moment d’une infection (Abreu et al. 2012). Parmi les 145 produits naturels antimicrobiens recensés dans la littérature entre 2000 et 2008, 47 sont de la famille des composés phénoliques et la majorité de ceux-ci d’origine végétale (Saleem et al. 2010). Un autre indicateur du potentiel des metabolites secondaires végétaux est la vaste utilisation d’extraits de plantes pour le traitement d’infections en médecine traditionnelle de différentes cultures autour du monde (Navarro et al. 1996; Omar et al. 2000; Bonjar 2004; Koné et al. 2004). Les autochtones d’Amérique du Nord ne font pas exception et utilisaient aussi plusieurs espèces de plantes pour traiter des infections diverses. Une compilation récente des informations disponibles à ce sujet a permis d’identifier 130 différents taxa utilisés pour traiter le rhume, la toux et les maux de gorge et plus de 100 taxa pour les infections de la peau (Uprety et al. 2012). Malgré cela, très peu de plantes de la forêt boréale du Canada ont été étudiées scientifiquement pour leur propriété antibactérienne potentielle. C’est suite à ce constat que le Laboratoire d’Analyse et de Séparation des Essences Végétales (LASEVE), au sein duquel j’ai effectué mes travaux de recherche de doctorat, a décidé de  s’intéresser aux propriétés antibactériennes des plantes de la forêt boréale du Canada. Depuis plus de 12 ans, le LASEVE s’intéresse à l’identification de metabolites secondaires bioactifs issus des plantes de la forêt boréale. Les travaux effectués ont entre autres permis d’identifier plusieurs composés prometteurs pour le développement d’anticancéreux (Legault et al. 2003; Pichette et al. 2006c; Dufour et al. 2007; Legault et Pichette 2007; Mshvildadze et al. 2007; Simard et al. 2008; Gauthier et al. 2009; Piochon et al. 2009; Pichette et al. 2010). Avec les craintes grandissantes associées à l’émergence rapide des résistances aux antibiotiques et le ralentissement du développement de nouvelles classes d’antibiotiques, il est devenu clair que l’expertise du LASEVE devait être mise à profit pour tenter d’identifier de nouveaux composés antibactériens. Un criblage en continu de plusieurs plantes utilisés par les amérindiens pour traiter diverses infections a donc été amorcé. Des résultats tangibles ont déjà été obtenus grâce à ces travaux. L’activité antibactérienne de l’huile essentielle de sapin baumier ainsi que de deux sesquiterpènes contenus dans cette huile a pu être démontré (Pichette et al. 2006b). Récemment, les travaux de criblage ont aussi permis de mettre en lumière le grand potentiel d’une autre matrice, les bourgeons de P. balsamifera.

LES BOURGEONS DE POPULUS BALSAMIFERA, UNE MATRICE D’INTÉRÊT DANS LA DÉCOUVERTE DE NOUVEAUX COMPOSÉS ANTIBACTÉRIENS :

Le peuplier baumier (Populus bolsamifera L) s’est retrouvé au haut de la liste des espèces d’intérêt dans le cadre des études de criblage antibactérien effectuées au LASEVE. En effet, les bourgeons de cette espèce de peuplier étaient particulièrement prisés des guérisseurs autochtones d’Amérique du Nord. Une revue récente des utilisations traditionnelles des plantes médicinales de la forêt boréale du Canada inclut P. bolsamifera parmi les plantes qui étaient les plus communément utilisées (Uprety et al. 2012). Moerman, lors de ses imposants travaux concernant l’ethnobotanique des autochtones d’Amérique, l’a aussi incluse dans sa liste des dix espèces ayant le plus grand nombre d’utilisations traditionnelles (Moermann 1998). L’emploi des bourgeons pour obtenir des préparations utilisées sur les blessures, les coupures, les plaies, les engelures et les piqûres d’insectes (Moermann 1998; Maries et al. 1999; Uprety et al. 2012) suggère que cette matrice pourrait posséder des propriétés antibactériennes. Les bourgeons de peuplier sont recouverts d’un exsudât qui possède aussi un intérêt particulier dans le cadre de cette étude de criblage. En effet, la composition chimique des exsudats de bourgeons de peupliers possède une grande similarité avec celle de certains types de propolis (Salatino et al. 2011). Le propolis est un sous-produit des abeilles qui contient des résines issues de plusieurs plantes. Son utilisation en médecine traditionnelle remonte à l’Antiquité et est encore aujourd’hui très répandue dans plusieurs cultures à travers le monde. Le traitement de blessures, de brûlures, de maux de gorge et d’ulcères d’estomac font partie des nombreuses utilisations traditionnelles du propolis. Les propriétés antibactériennes du propolis ont été largement étudiées (Fokt et al. 2010) et la présence de metabolites secondaires issus des exsudats de bourgeons de peupliers ne serait pas étrangère à cette activité dans certains cas (Vardar-Ûnlù et al. 2008). Pour toutes ces raisons, les bourgeons de P.balsamifero représentent un excellent candidat pour la découverte de nouveaux composés antibactériens. Un extrait a donc été préparé avec un mélange d’éthanol et d’eau puis l’activité antibactérienne de cet extrait a été évaluée lors des études de criblage du LASEVE. La concentration minimale inhibitrice (CMI) de cet extrait contre S. aureus a été évaluée à 12.5 jug/ml. Ce résultat était fort encourageant puisque certains auteurs considèrent une activité antibactérienne très intéressante lorsque que la CMI est inférieure à 100 jig/ml pour un extrait de plante et inférieure 10 ug/ml pour un composé isolé (Rfos et Recio 2005). Un projet de ma trise a donc été entrepris avec comme objectif d’identifier les composés responsables de cette activité. L’extrait de bourgeons a été soumis à un fractionnement guidé par l’activité antibactérienne. Ce fractionnement a été effectué d’abord par extractions liquide-liquide puis par chromatographie sur colonne. Les composés majoritaires de la fraction ayant montré l’activité la plus marquée ont ensuite été isolés par chromatographie liquide haute performance (HPLC) à l’échelle preparative. Grâce à ces travaux, trois dérivés de dihydrochalcones possédant une activité antibactérienne significative in vitro ont été identifiés (basacones A (1), B (2) et C (3), tableau 3). Ces travaux exploratoires ont aussi relevé que la fraction active était riche en d’autres composés phénoliques apparentés et que des travaux plus approfondis étaient nécessaires pour compléter l’identification des composés impliques dans l’activité antibactérienne des bourgeons. Le potentiel de l’extrait de bourgeons de P. balsamifero pour l’identification de nouveaux composés antibactériens étaient dès lors bien établi. Le projet de recherche présenté dans cette thèse est la suite logique de ces travaux et vise à compléter l’isolement des composés impliqués dans cette activité.

OBJECTIFS ET PLAN DE LA THÈSE :

L’hypothèse de départ pour l’élaboration de ce projet de recherche est que l’activité antibactérienne in vitro de l’extrait de bourgeons de P. bolsamifera est due à la présence de metabolites secondaires possédant eux-mêmes une activité antibactérienne. Comme mentionné dans la section précédente, cette hypothèse a été vérifiée en partie lors de travaux antérieurs par l’identification des balsacones A (1), B (2) et C (3). Ces résultats ont aussi permis de conclure que ces composés n’étaient pas les seuls responsables de l’activité antibactérienne. La présence d’autres composés apparentés a été détectée dans la fraction active sans qu’ils ne puissent y être identifiés. De plus, les baslacones A, B et C doivent être isolés à nouveau en plus grande quantité pour confirmer la caractérisation de leurs structures et pour procéder à l’évaluation de leur activité antibactérienne sur d’autres souches. Cette étape permettra ainsi de consolider les résultats obtenus pour procéder à leur publication et au dépôt d’une demande de brevet. L’objectif principal du projet de recherche est donc le suivant: • isoler et identifier les composés impliqués dans l’activité antibactérienne des bourgeons de P. balsamifera. Pour atteindre cet objectif principal, les objectifs secondaires suivants ont été fixés: • développer une méthode de fractionnement de l’extrait de bourgeons de P. baslamifera en utilisant l’activité antibactérienne comme guide afin d’étudier l’ensemble des fractions montrant une activité; • développer une méthode d’isolement efficace des balsacones A, B et C; • isoler les composés présents dans les fractions les plus actives obtenues par la méthode de fractionnement développée; • procéder à la caractérisation complète des composés isolés; • déterminer l’activité antibactérienne des composés isolés in vitro sur plusieurs souches de bactéries incluant S. oureus et des souches de SARM.

Le premier chapitre de cette thèse établissait la problématique globale de la résistance aux antibiotiques ainsi que les résultats antérieurs qui sont à l’origine du présent projet de recherche. Le second chapitre s’intéresse à un autre aspect de la problématique ayant donné naissance à ce projet de recherche. L’industrie forestière du Canada fait actuellement face à une crise importante résultant entre autres d’une diminution de la demande pour les produits traditionnels comme le bois d’œuvre et le papier. Cette crise a fait valoir la nécessité de diversifier les produits de transformation de la biomasse forestière au Canada. Le chapitre tente de montrer de quelle façon les résultats obtenus au LASEVE concernant les produits naturels bioactifs pourrait mener au développement de nouveaux bioproduits. Cette revue a été préparée en tant que chapitre pour le livre intitulé « Biorefinery Co-products. Phytochemicals, Primary Metabolites and ValueAdded Biomass Processing », publié par Wiley dans la série « Renewable ressources » (Bergeron et al. 2012). Le chapitre est divisé en deux parties, une première s’intéressant à l’identification de nouveaux produits naturels bioactifs issus d’espèces commerciales de la forêt boréale canadienne et la seconde aux modifications chimiques apportées aux produits naturels pour moduler leur bioactivité. Ce chapitre constitue une contribution importante de l’auteur de cette thèse et fournit du même coup une entrée en matière permettant de mieux comprendre certaines retombées potentielles de ce projet de thèse.

Le troisième chapitre présente la littérature scientifique pertinente au projet de recherche. Le chapitre est divisé en trois sections. La première s’intéresse au genre Populus et en particulier à l’espèce P. balsamifera en présentant la littérature concernant leurs caractéristiques générales, leurs utilisations commerciales et traditionnelles, la composition chimique de leurs extraits ainsi que leurs activités biologiques. La deuxième section porte sur le propolis. La littérature concernant la composition chimique et les activités biologiques du propolis est abondante. Il est essentiel d’en présenter un survol puisque l’exsudat qui recouvre les bourgeons des peupliers est reconnu comme une des sources végétales du propolis et que plusieurs similarités ont été établies entre leurs compositions chimiques respectives. Enfin, la troisième section porte sur l’activité antibactérienne des flavano’des en lien avec les balsacones A (1), B (2) et C (3) qui ont été isolés lors des travaux préliminaires du présent projet. Cette section met particulièrement en lumière les relations qui ont déjà été établies entre les structures des flavono des et leur activité antibactérienne.

Le chapitre 4 présente un article scientifique publié dans Tetrahedron Letters concernant l’isolement, la caractérisation et l’évaluation de l’activité antibactérienne des balsacones A (1), B (2) et C (3). Les résultats obtenus avec ces composés ont aussi mené au dépôt d’une demande de brevet provisoire au United States Patent and Trademark Office pour en protéger leur utilisation en tant qu’antibactériens chez l’humain et chez les animaux (Pichette et al. 2012).

Les chapitre 5 est rédigé sous la forme d’un article scientifique dont la publication a été recommandée par les éditeurs du journal Phytochemistry conditionnellement à quelques modifications mineures. Il décrit d’abord l’isolement de 6 nouveaux dérivés de dihydrochalcone, les balsacones D à I, obtenus sous la forme de mélanges racémiques. La purification de ces mélanges sur support chiral ainsi que la détermination de la configuration absolue des énantiomères obtenus grâce à une analyse de diffraction de rayons X et aux calculs théoriques des spectres de dichroÉme circulaire y sont aussi décrites. Enfin, l’activité antibactérienne des composés isolés contre 5. oureus et leur cytotoxicité sur une souche de fibroblastes de peau humaine (WS1) y sont présentées.

Le chapitre 6 est rédigé sous la forme d’un article scientifique à soumettre prochainement au journal Organic Letters. L’isolement de deux composés inédits dont les structure sont des hybrides entre un ester d’acide hydroxycinnamique et une dihycrochalcone est présenté (balsacones J et K). La purification sur support chiral des composés qui ont été obtenus sous la forme de mélanges racémiques y est aussi décrite. La détermination de la configuration absolue de ces composés est toujours en cours et n’a pu être terminée à temps pour être incluse dans ce chapitre. L’activité antibactérienne et la cytotoxicité des mélanges racémiques et des énantiomères purifiés sont également présentées .

Le chapitre 7 est rédigé sous la forme d’un article scientifique à soumettre prochainement à Journal of Natural Products. Les résultats inclus dans cet article concernent l’isolement, la purification sur support chiral et la caractérisation complète (incluant la configuration absolue) de quatre nouveaux dérivés de dihydrochalcones substitués par deux unités hydroxycinnamyles (balsacones L à O) ainsi que de l’iryantherin-D.

Le chapitre 8 présente les résultats et discussion ainsi que la partie expérimentale de l’isolement de huit autres nouvelles balsacones (P-W). Il est aussi rédigé selon la forme généralement acceptée dans les journeaux scientifiques pour faciliter son intégration dans un article qui sera rédigé après le dépôt de cette thèse. Les balsacones P à W sont des dihydrochalcones substituées par un nombre variant entre 2 à 4 unités hydroxycinnamyles. Leur caractérisation y est présentée en détail ainsi que l’approche de séparation chirale qui a été mise en oeuvre. La détermination de la configuration absolue de ces composés est en cours mais n’a pu être complétée à temps pour le dépôt de cette thèse .

Le chapitre 9 présente des résultats d’activité antibactérienne in vitro face à des souches de SARM pour la majorité des composés isolés dans ce projet de recherche. Ces résultats sont suivis d’une discussion portant sur différentes relations apparentes entre la structure des composés et leur activité antibactérienne.

Finalement, le chapitre 10 présente la discussion générale et les principales conclusions tirés des résultats obtenus de ce projet de recherche. Ce chapitre propose aussi quelques perspectives futures envisageables pour la poursuite du développement des balsacones et de l’extrait de bourgeons de P. bolsamlfera en tant que produits antibactériens.

ISOLEMENT, CARACTÉRISATION ET ÉVALUATION DE L’ACTIVITÉ ANTIBACTÉRIENNE DES BALSACONES P ÀW  :

Ce chapitre présente une section résultats et discussion ainsi qu’une section expérimentale rédigées selon la forme exigée dans la plupart des journaux scientifiques du domaine des produits naturels. Ces résultats pourront ainsi être facilement intégrés à un article dont la préparation sera poursuivie après le dépôt de cette thèse. L’isolement de huit nouvelles balsacones (P-W) est décrit ainsi que la détermination de leurs structures grâce à l’analyse des données spectrales obtenues par RMN ID et 2D, par spectroscopie infrarouge et par spectrométrie de masse. Tous les balsacones isolées étaient racémiques et quatre d’entre elles (T-W) ont été purifiées par HPLC sur un support chiral ce qui a permis d’obtenir les paires d’énantiomères de ces 4 mélanges. Des analyses expérimentales de dichroÈme circulaire ont été effectuées sur ces énantiomères. Des calculs seront bientôt entrepris pour générer des spectres de dichro’Ème circulaire théorique et les comparer avec les spectres expérimentaux avec comme objectif d’arriver à déterminer la configuration absolue des ces énantiomères. L’activité antibactérienne et la cytotoxicité des composés racémiques isolés ont été évaluées in vitro contre S. oureus et une souche de fibroblastes de peau humaine (WS1) respectivement.

Structural determination :

Fractionation of P. boslamifera bud ethanolic extract by liquid-liquid extractions, silica gel column chromatography and reversed phase flash chromatograhy followed by preparative HPLC purification yielded compounds 162-169. Balsacone P (162) was isolated as a reddish powder, and its molecular formula was established as C33H30O6 based on the [M+Na]+ quasimolecular ion peak at m/z 545.1943 (calcd for C33H3o06Na, 545.1935) in the HRMS spectrum. The IR spectrum showed bands at 3348 and 1598 cm »1 , due to phenol and carbonyl functions respectively. The 13C and 1H NMR data (table 19) along with information from Dept 135 and HSQC spectra indicated the presence of one carbonyl, five oxygenated aromatic quaternary carbons, five aromatic quaternary carbons, ten sp2 methines, two sp3 methines and four méthylènes. Detailed analysis of ID 1H, 2D COSY and HSQC experiments showed signals for two 1,4-disubstituted aromatic rings at 6H 7.29 (2H, m, H-B2), 6.90 (2H, d, 8.6 Hz, H-B3), 7.23 (2H, d, 8.6 Hz, H-E2) and 6.77 (2H, d, 8.6 Hz, H-E3) and one monosubstituted aromatic ring at 6H 7.28 (2H, m, H-D2), 7.27 (2H, m, H-D3) and 7.17 (1H, m, H-D4). The other coupling systems observed on the COSY spectrum (one AA’X2, one AA’MX and one allyl) were reminiscent of balsacone L (157) previously isolated from P. bolsamifera buds (not yet published, Chapitre 7). Indeed, XH and 13C NMR spectra of 162 showed signals accounting for a flavan skeleton substituted by a 4-hydroxycinnamyl moiety in position 3 of ring C and a dihydrocinnamoyl moiety. The discrepancies between the spectral data of 162 and balsacone L (157) were attributed to a different position for the dihydrocinnamoyl moiety on ring A. HMBC correlations of 6C 162.3 (C-A9) with 6H 4.79 (1H, d, 8.8 Hz, H-C2), 6H 2.33 (1H, dd, 16.3, 10.3 Hz, H-C4a), 6H 2.84 (1H, dd, 16.3, 4.7 Hz, H-C4b) and 6H 5.94 (1H, s, H-A8) and of 6C 205.5 with H-A8 indicated that the dihydrocinnamoyl moiety was attached at position 6 of ring A compared to position 8 for balsacone L (157). Based on these observations, balsacone P (162) was characterized as 6-dihydrocinnamoyl-3-(4 hydroxycinnamyl)-5,7,4′-trihydroxyflavan.

CONCLUSIONS GÉNÉRALES :

Avant de revenir sur l’objectif principal du projet de recherche présenté dans cette thèse, les accomplissements en lien avec les objectifs secondaires qui avaient été fixés seront récapitulés. Le premier objectif secondaire fixé était de développer une méthode de fractionnement de l’extrait de bourgeons de P. balsomifera guidée par l’activité antibactérienne. Deux méthodes de fractionnement alternatives ont été mises aux points dans le cadre de cette thèse. La méthode 1 (annexe 3) a mené aux fractions enrichies permettant ensuite de procéder à l’isolement des composés présentés dans les chapitres 5, 6 et 7 ainsi que deux des composés présentés au chapitre 8. Cette méthode a aussi conduit à l’isolement d’une plus grande quantité des balsacones A (1), B (2) et C (3) (deuxième objectif secondaire) permettant ainsi de procéder à la publication de leur caractérisation complète et de leur activité antibactérienne in vitro (chapitre 4). Sommairement, la méthode de fractionnement consiste en deux étapes d’extractions liquide-liquide suivies de deux étapes de chromatographie sur colonne de gel de silice et d’une étape de chromatographie « flash » en phase inverse (C18). Cette méthode a été développée dans une optique exploratoire et l’activité antibactérienne face à 5. oureus était le critère de sélection des fractions à refractionner d’avantage ou à purifier. Ainsi, à l’annexe 3, la fraction MeOH, la fraction Et2O, la fraction F et la fraction F4 ont tous montré une activité antibactérienne contre S. aureus similaire à l’extrait brut (CMI variant entre 12.5 et 50 ug/ml) tout en possédant des profils chimiques moins complexes. La seconde méthode de fractionnement a été développée plus tard au cours du projet et est plutôt optimisée vers l’isolement des dihydrochalcones hydroxycinnamylées (balsacones) avec de meilleurs rendements. Cette seconde méthode a d’ailleurs été développée sur une plus grande quantité d’extrait brut de bourgeons (1 kg) permettant l’isolement et l’identification de balsacones qui étaient présentes en plus faible quantité. Les fractions Dlc, D4g, D5g et D7I (annexe 4) ont d’ailleurs permis l’isolement des balsacones P, Q, T, U, V et W, présenté au chapitre 8. Cette méthode devrait être privilégiée si l’isolement de certaines balsacones est nécessaire lors de travaux futurs.

Table des matières

CHAPITRE 1  INTRODUCTION GÉNÉRALE 
1.1 LA PROBLÉMATIQUE GLOBALE DES MALADIES INFECTIEUSES
1.2 LES ANTIBIOTIQUES ET LE PHÉNOMÈNE DE RÉSISTANCE
1.3 LE RALENTISSEMENT DE LA MISE EN MARCHÉ DE NOUVELLES CLASSES D’ANTIBIOTIQUES
1.4 LES METABOLITES SECONDAIRES ISSUS DES PLANTES, UNE SOURCE POTENTIELLE D’ANTIBACTÉRIENS
1.5 LES BOURGEONS DE POPULUS BALSAMIFERA, UNE MATRICE D’INTÉRÊT DANS LA DÉCOUVERTE DE NOUVEAUX COMPOSÉS
ANTIBACTÉRIENS
1.6 OBJECTIFS ET PLAN DE LA THÈSE
CHAPITRE 2  NEW BIOACTIVE NATURAL PRODUCTS FROM CANADIAN BOREAL FOREST  CONTRIBUTIONS DES AUTEURS 
RÉSUMÉ ;
INTRODUCTION
IDENTIFICATION OF NEW BIOACTIVE NATURAL PRODUCTS FROM CANADIAN BOREAL FOREST
Selection of plant species and bioguided isolation process
Diarylheptanoids from the inner bark Betula papyrifera
Labdane diterpenesfrom Larix laricina
Phenolic compounds from Populus tremulo’ides buds
Sesquiterpenes from Abies balsamea
CHEMICAL MODIFICATION OF BIOACTIVE NATURAL PRODUCTS FROM THE CANADIAN BOREAL FOREST
Glycosidation of triterpenoids from outer bark of B. papyrifera
CONCLUSION
CHAPITRE 3  REVUE DE LA LITTÉRATURE 
3.1 LE GENRE POPULUS ET LE PEUPLIER BAUMIER (POPULUS BALSAMIFERA L)
3.1.1 Taxinomie, morphologie, habitat et distribution
3.1.2 Génétique et génomique
3.1.3 Utilisations commerciales actuelles et potentielles
3.1.4 Utilisations médicinales traditionnelles
3.1.5 Composition chimique des extractibles du genre Populus
3.1.6 Composition chimique des extractibles de P. balsamifera
3.1.7 Activités biologiques
3.2 LA PROPOLIS
3.3 LES DÉRIVÉS DE DIHYDROCHALCONES ET LEUR ACTIVITÉ ANTIBACTÉRIENNE
CHAPITRE 4  NEW ANTIBACTERIAL DIHYDROCHALCONE DERIVATIVES FROM BUDS OF POPULUS BALSAMIFERA  CONTRIBUTIONS DES AUTEURS 
RÉSUMÉ GRAPHIQUE
RÉSUMÉ
ABSTRACT
INTRODUCTION
RESULTS AND DISCUSSION
ACKNOWLEDGMENTS
SUPPLEMENTARY MATERIAL
EXPERIMENTAL PART
General Experimental Procedures
Plant material
Extraction and isolation
Evaluation of antibacterial activity
CHAPITRE 5  BALSACONES D-l, DIHYDROCINNAMOYL FLAVANS FROM POPULUS BALSAMIFERA BUDS  CONTRIBUTION DES AUTEURS 
RÉSUMÉ GRAPHIQUE
RÉSUMÉ
ABSTRACT
INTRODUCTION
RESULTS AND DISCUSSION
Structural determination
Proposed biosynthetic pathway
Antibacterial activity and cytotoxicity of enantiomers pairs from 149-154
CONCLUDING REMARKS
EXPERIMENTAL
General
Plant material
Extraction and isolation
Detection of compounds 149-154 in a cold solvent extract
Physical data of new compounds
X-ray crystal structure analysis of(-)-balsacone D [(-)-149]
Conformational analysis, geometrical optimization and ECD calculation
Antibacterial activity
Cytotoxicity
ACKNOWLEDGMENTS
APPENDIX A. SUPPLEMENTARY DATA
CHAPITRE 6  BALSACONE J AND K: ANTIBACTERIAL HYDROXYCINNAMATE ESTER SUBSTITUTED DIHYDROCHALCONES AS RACEMATES FROM POPULUS BALSAMIFERA BUDS  CONTRIBUTION DES AUTEURS 
RÉSUMÉ GRAPHIQUE
RÉSUMÉ
ABSTRACT
INTRODUCTION
RESULTS AND DISCUSSION
ACKNOWLEDGMENT
SUPPORTING INFORMATION
EXPERIMENTAL SECTION
General Experimental Procedures
Plant Material
Extraction and Isolation
Bioassays
CHAPITRE 7  BALSACONE L-O, ANTIBACTERIAL HYDROXYCINNAMYLATED DIHYDROCHALCONES FROM POPULUS BALSAMIFERA BUDS  CONTRIBUTION DES AUTEURS 
RÉSUMÉ ;
ABSTRACT
INTRODUCTION
RESULTS AND DISCUSSION
EXPERIMENTAL SECTION
General Experimental Procedures
Plant Material
Extraction and Isolation
X-ray diffraction crystal structure analysis of (-)-157
Conformational analysis, geometrical optimization and ECD calculation for (2S,3S)-157, (2S,3S)-158,
(2S,3S)-159 and (2S,3S)-160
Bacterial Growth Inhibition Assay
Cytotoxicity Assay
AKNOWLEDGMENTS
SUPPORTING INFORMATION
CHAPITRE 8  ISOLEMENT, CARACTÉRISATION ET ÉVALUATION DE L’ACTIVITÉ ANTIBACTÉRIENNE DES BALSACONES P À W 
INTRODUCTION
RESULTS AND DISCUSSION
Structural determination
Proposed biosynthetic pathway
Antibacterial activity and cytotoxicity of isolated compounds
EXPERIMENTAL
General
Plant material
Extraction and isolation
Physical data of new compounds
Antibacterial activity
Cytotoxicity
ACKNOWLEDGMENTS
SUPPLEMENTARY DATA
CHAPITRE 9 ÉVALUATION DE L’ACTIVITÉ ANTIBACTÉRIENNE DES BALSACON ES ISOLÉES SUR DES SOUCHES DE SARM 
RÉSULTATS ET DISCUSSION
PARTIE EXPÉRIMENTALE
Isolation et identification des souches de SASM et de SARM
Test de susceptibilité des souches de SARM par la méthode de diffusion sur disque
Évaluation de l’activité antibactérienne des balsacones sur les souches de SASM et de SARM
CHAPITRE 10  CONCLUSIONS GÉNÉRALES

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