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Les algues brunes : habitat et origine
La zone intertidale: à l’interface entre environnement terrestre et marin
Les algues brunes (Phéophycées) sont des organismes photosynthétiques multicellulaires, majoritairement marins, que l’on retrouve principalement dans les zones côtières des régions tempérées (Mann et al. 1973). On les retrouve aussi, dans une moindre mesure, au niveau de sites de grandes profondeurs dans certaines régions tropicales (Graham et al. 2007). Au sein de ces différents types d’environnement, les algues brunes, dont celles de l’ordre des Fucales et des Laminariales (« les grandes algues » ou kelps) (Figure 1), ont un rôle écologique important car elles permettent de structurer des écosystèmes au sein desquels vivent des milliers d’espèces, de façon similaire au rôle des arbres et des forêts dans la végétation terrestre.
Les contraintes abiotiques du milieu intertidal
Dans les zones côtières, ou zones intertidales, qui représentent une interface entre le milieu terrestre et le milieu marin, les algues brunes sont soumises à des changements réguliers et importants de leur habitat, imposés notamment par le balancement des marées. Parmi les stress abiotiques auxquels sont exposés ces organismes, on peut distinguer l’action mécanique des vagues, la lumière (dont les ultra-violets), la dessiccation, la salinité, le pH, et la pollution (Figure 2). Ces paramètres sont à l’origine notamment de la distribution en étage des algues brunes au niveau de la zone intertidale (aussi appelé estran), car toutes ces algues n’ont pas les mêmes capacités pour s’adapter aux contraintes abiotiques (Davison and Pearson, 1996). Ainsi, certaines espèces sont retrouvées principalement en haut de cette zone (ex. Ascophyllum nodosum), au milieu (différentes espèces de Fucus), et donc très exposées aux marées, ou dans la zone infralittorale qui n’est émergée que lors des grandes marées (ex. Laminaria digitata).
Les stress mécaniques dus à l’action des vagues et du courant ne permettent qu’à des espèces bien adaptées de coloniser les zones les plus exposées. En effet, ces algues doivent être capables de résister aux mouvements incessants causés par les déplacements d’eau plus ou moins puissants et rapides, dont les effets peuvent se traduire par des frictions au niveau de la fronde des algues, leur détachement d’un substrat solide, l’envasement et l’ensablement, et le dépôt de fines gouttelettes d’eau très concentrées en sel. Les rayons lumineux, notamment les UVs, sont absorbés par l’eau. C’est pourquoi d’importants changements dans l’intensité et dans la nature de la lumière à laquelle sont soumises les algues brunes ont été constatés suite à l’alternance des immersions et émersions. La lumière est nécessaire à la photosynthèse, et donc à la survie des organismes autotrophes, mais peut également causer de graves dommages cellulaires par la production de radicaux libres si elle est trop intense, ou directement dans l’ADN dans le cas des rayons UVs. Enfin, la lumière du soleil a un impact direct sur la température du milieu de vie des organismes. Si la température de l’eau varie peu en plein océan, les changements sont plus forts le long des zones de balancement des marées. En effet, il est possible d’observer des variations allant jusqu’à 10°C dans la même journée au niveau de la zone intertidale, selon que la marée est basse ou haute et le temps ensoleillé ou nuageux. Ces différences importantes se traduisent dans les cellules par des changements moléculaires importants. Ainsi, une hausse de température va généralement provoquer un phénomène de respiration accru, et donc une diminution du dioxygène soluble. L’environnement est alors appauvri en oxygène. Le pH est un paramètre important pour la physiologie des organismes, et les écosystèmes marins subissent actuellement une diminution du pH, phénomène aussi appelé acidification des océans. Il s’explique notamment par l’augmentation de la quantité de CO2 dissoute dans la mer. Ce CO2 réagit avec des molécules d’eau pour former de l’acide carbonique (H2CO3), qui se dissout ensuite pour former des ions H+ et bicarbonate (HCO3- ). Les ions H+ sont neutralisés par des ions carbonate (CO3 2-), ce qui entraîne une production accrue de bicarbonate, et une diminution de la quantité d’ions carbonate dans l’eau de mer. En plus d’avoir un effet sur le pH, ces modifications altèrent donc la disponibilité en sources potentielles de carbone pour les macroalgues. Les zones intertidales présentent un autre facteur de stress important: la dessiccation. En effet, à marée basse, les algues peuvent perdre, de façon réversible, jusqu’à 90% de leur quantité d’eau intracellulaire (Dring and Brown, 1982). Les conséquences physiologiques de la dessiccation sont souvent similaires à celles dues au stress hypersalin, notamment des variations d’osmolarité et une augmentation importante de la concentration intracellulaire des ions. En lien avec le phénomène de dessiccation, les algues peuvent aussi subir de fortes variations en salinité. Il a ainsi été observé que des stress salins entraînaient des changements d’expression de gènes similaires à ceux observés dans la zone intertidale chez l’algue rouge modèle Chondrus crispus (Collén et al., 2007). Les changements de salinité dans l’habitat des algues peuvent être dus à l’évaporation à marée basse, ce qui entraîne une hypersalinité dans l’environnement immédiat des algues, et à la pluie et l’écoulement d’eau douce, qui ont un effet inverse. Les organismes vivants dans un tel milieu doivent donc être capables de s’adapter rapidement pour tolérer des stress hypo et hypersalins de différentes intensités. Au niveau physiologique, il a par exemple été montré que ces stress altèrent les capacités photosynthétiques de l’algue brune modèle Ectocarpus (Dittami et al., 2009). Ces observations ont été complétées par des analyses transcriptomiques utilisant des puces à ADN. Ainsi, trois conditions ont été testées, un stress hypersalin, un stress hyposalin, et une condition de stress oxydant. Il a ainsi été montré que 70% des gènes exprimés chez cette algue brune ont un patron d’expression modifié par au moins une des conditions de stress abiotique, ce qui contraste avec les observations réalisées chez des plantes terrestres soumises à des stress similaires; en effet, ce pourcentage varie de 1 à 30% chez ces organismes. De plus, une analyse globale des résultats indique que lors d’un stress abiotique, les gènes codant pour les protéines impliquées dans des processus cellulaires tels que le métabolisme primaire et la croissance sont réprimés, alors que ceux correspondant à des protéines impliquées dans les voies d’utilisation d’énergie (comme la dégradation des lipides, l’autophagie et la dégradation de protéines par protéasome), dans la production de molécules osmoprotectantes, et le trafic cellulaire, sont activés (Dittami et al. 2009). Ces résultats obtenus au niveau transcriptomique ont ensuite été intégrés avec des résultats de profilage métabolique ciblé, ce qui a permis de confirmer certaines des observations décrites, notamment au niveau du métabolisme des acides aminés et des acides gras (Dittami et al. 2011). Enfin, l’activité humaine (qu’elle soit localisée au niveau côtier ou non) n’est pas sans conséquence sur le milieu marin, et en particulier le milieu intertidal, où l’on retrouve de nombreux polluants. Qu’il s’agisse de métaux lourds, des hydrocarbures, des produits phytosanitaires ou différents types de déchets, ces molécules d’origine anthropogénique représentent de nouveaux facteurs de stress auxquels les organismes marins, dont les algues brunes, doivent faire face. De nombreux travaux ont été réalisés chez ces organismes pour étudier leur réponse aux stress par les métaux lourds, en particulier le cuivre. Il a ainsi été observé chez plusieurs algues brunes que ce métal induisait une accumulation intracellulaire d’espèces activées de l’oxygène (EAOs) (Mithöfer et al., 2004), et avait un impact sur la physiologie des algues, en particulier sur leur appareil photosynthétique (Ritter et al., 2008). De plus, des expériences réalisées chez L. digitata ont permis d’observer l’induction d’un certain nombre de gènes de stress en présence de 300 µg/L de CuCl2 après 6h, 24h, 48h et 72h d’incubation (Ritter et al., 2008), ainsi que la production d’oxylipines (dérivés oxygénés des acides gras) à 18 atomes de carbone (type plante) et à 20 atomes de carbones (type animal). Ces deux types d’oxylipines ont aussi été identifiés chez E. siliculosus soumis à un stress cuivrique de quelques heures, et ces résultats ont été complétés par des expériences de profilage transcriptomique par puces à ADN (Ritter et al., 2014). Ainsi, il a été observé l’induction de gènes codant pour des transporteurs ABC, connus pour être impliqués dans la résistance à plusieurs drogues chez différents organismes, pour des ATPases de type P1B, et pour une bromoperoxydase à vanadium, cette enzyme étant impliquée dans le métabolisme des halogénures qui correspond à un des systèmes de détoxification des EAOs chez les algues brunes. Ces résultats très récents chez E. siliculosus, obtenus après un stress court, complètent des données qui ont été obtenues chez cette algue pour des stress plus longs (plusieurs jours) et par une approche méthodologique différente, basée sur la mise en œuvre d’expériences de protéomique différentielle (Ritter et al., 2010).
Les algues brunes et leur réponse aux stress biotiques
Jusqu’à présent, la majorité des travaux pour étudier au niveau moléculaire les réponses aux stress biotiques chez les algues brunes ont été réalisés chez L. digitata. Dans la plupart des expériences, les stress n’ont pas été appliqués par incubation directe avec des agents pathogènes, mais en mimant ce type de conditions grâce à des éliciteurs. Ainsi, chez L. digitata, il a été montré que les oligoguluronates, qui correspondent à une fraction bien particulière de la paroi des algues brunes, induisent un burst oxydatif (Küpper et al., 2001). Ceci correspond à la production rapide, massive et transitoire de peroxyde d’hydrogène (H2O2), et ce phénomène n’a pas lieu si les algues sont traitées avec du DPI (diodorium diphénylène), un inhibiteur des NADPH oxidases de mammifères, avant de faire l’élicitation. Un burst oxydatif a aussi été détecté après application de LPS (lipopolysaccharides) provenant de la bactérie Salmonella arbotus equi (Küpper et al. 2006), comme cela est aussi le cas chez les plantes terrestres. L’émission des EAO est l’une des premières réponses de l’algue face à l’attaque d’un pathogène, mais ce n’est pas la seule. Un autre système de défense rapide est l’émission de composés organiques halogénés volatiles dans l’environnement marin (VHOC). En effet, chez L. digitata, les jeunes algues peuvent concentrer des quantités très importantes d’iode (jusqu’à 4,7% de leur poids sec) (Küpper et al., 1998). Cette concentration de composés halogénés est catalysée par les haloperoxydases à vanadium (vHPO). Ces enzymes jouent un rôle important dans l’apport en iode et la production de composés carbonés halogénés (Leblanc et al., 2006). Elles permettent aussi de détoxifier rapidement le peroxyde d’hydrogène produit par le burst oxydatif. Enfin, elles interfèreraient dans le système de signalisation bactérien pour la dispersion de biofilms. Un autre mécanisme impliqué dans les réactions de défense des algues face à l’attaque d’un pathogène est l’oxygénation (enzymatique ou non-enzymatique) d’acides gras qui aboutit à la production de dérivés oxygénés appelés oxylipines. Ces molécules sont connues pour être impliquées notamment dans des voies de signalisation chez les plantes terrestres et les animaux. La synthèse des oxylipines est initiée par des phospholipases et des galactolipases qui libèrent des acides gras à partir des lipides membranaires. Chez les algues, les oxylipines sont de la famille des octadécanoïdes et des eicosanoïdes (prostaglandines et leucotriènes) (Potin et al., 2002). Ce phénomène a été étudié chez L. digitata: suite à l’élicitation par des LPS, et il a été observé une accumulation de dérivés oxydés des acides linolénique et eicosapentaénoïque, en même temps qu’un relargage d’acides gras libres (Küpper et al., 2006). Il est intéressant de signaler que cette production d’oxylipines n’a pas lieu qu’en condition de stress biotique puisque ce phénomène a aussi été observé chez les algues brunes lors de stress cuivrique, comme indiqué dans le dernier paragraphe de la partie 1.1. Les algues brunes sont aussi capables de produire d’autres types de composés, notamment lors d’attaques par des organismes brouteurs. Ces organismes induisent en effet la production de composés tels que des terpènes, comme le pachydictol A et le dictyol B acétate chez Dictyota menstrualis (aussi appelée Dictyota dichotoma var. menstrualis), ou des phlorotannins chez les fucales (Cosse et al., 2008). L’influence de l’élicitation par des oligoguluronates a aussi été montrée au niveau transcriptomique chez L. digitata. L’approche macroarray utilisée, complétée par de la PCR quantitative, a permis de mettre en évidence l’induction de gènes impliqués dans la réponse au stress oxydatif, la production de métabolites secondaires antimicrobiens, dans le renforcement de la paroi, et l’induction d’une nouvelle halopéroxidase dépendante du vanadium (Cosse et al., 2009). Ces résultats ont été combinés avec une analyse pharmacologique et ont permis d’émettre un certain nombre d’hypothèses quant à la réponse transcriptionnelle précoce de défense chez L. digitata, avec des similarités par rapport à ce qui a été identifié chez les plantes, mais aussi des originalités, notamment avec l’implication du métabolisme de l’iode. Récemment, deux mécanismes importants liés à la dissémination de signaux impliqués dans les mécanismes de défense ont été mis en évidence chez L. digitata. Ainsi, un mécanisme similaire au « priming » chez les plantes terrestres y a été découvert. En effet, il a été montré que l’incubation d’une algue élicitée par des oligoguluronates avec une autre algue non élicitée permet d’induire chez cette dernière une réponse de défense plus rapide et plus efficace en cas d’attaque par un pathogène (Thomas et al., 2011). De plus, des expériences basées sur l’élicitation de certaines zones de la lame de L. digitata, et des tests pour mettre en évidence des réactions de défense dans des parties non élicitées de la même algue ont permis de montrer l’existence d’une réponse systémique médiée notamment par la libération d’acides gras polydésaturés qui aboutit à la mise en place de réactions de défense pour conférer une résistance au broutage (Thomas et al., 2014).
Apparition et évolution des straménopiles
Au sein des eucaryotes, les algues brunes font partie du groupe des straménopiles ou hétérochontes (Figure 3). Celui-ci regroupe notamment les oomycètes, les diatomées, et les phéophycées. Les straménopiles sont caractérisés entre autre par la présence de deux flagelles, l’un plumeux avec des mastigonèmes tubulaires tripartites, l’autre lisse. Il s’agit d’un groupe très diversifié, contenant aussi bien des organismes unicellulaires (bicosoécides, pseudociliés) que des algues géantes multicellulaires (phéophytes). De plus, il comporte des organismes hétérotrophes comme les oomycètes, ou photosynthétiques, ces derniers étant regroupés sous le nom d’ochrophytes et correspondent notamment aux diatomées et aux algues brunes. En fait, les ochrophytes contiennent une grande diversité d’algues, appartenant à différentes classes, dont les Aurearenophycées, les Bacillariophycées (les diatomées), les Eustigmatophycées, les Dictyochophycées, les Synchromophycées, les Chrysophycées, les Chrysomerophycées, les Bolidophycées, les Xanthophycées, les Synurophycées, les Schizocladiophycées, les Phéophycées (algues brunes), les Raphidophycées, les Pinguiophycées, les Phaeothamniophycées, les Picophages et les Pelagophycées ( Baldauf, 2008; Brown and Sorhannus, 2010).
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Table des matières
Introduction
Partie 1 : Les algues brunes : habitat et origine
1) La zone intertidale: à l’interface entre environnement terrestre et marin
1.1) Les contraintes abiotiques du milieu intertidal
1.2) Les algues brunes et leur réponse aux stress biotiques
2) Apparition et évolution des straménopiles
3) Ectocarpus : un organisme modèle pour étudier les algues brunes
Partie 2 : Exemples de voies métaboliques caractéristiques des algues brunes
1) La photosynthèse et l’appareil photosynthétique
2) Les polysaccharides pariétaux fucanes et alginates
3) Les deux formes de stockage du carbone : la laminarine et le mannitol
Partie 3 : Le mannitol, une molécule ubiquitaire : applications, voies métaboliques et rôles physiologiques chez différents types d’organismes
1) Le mannitol : propriétés, applications, et production commerciale
2) Métabolisme et rôles physiologiques du mannitol chez différents types d’organismes
2.1) Les bactéries
2.2) Les plantes terrestres
2.3) Les champignons
2.4) Les Apicomplexa
2.5) Les algues marines
Partie 4 : Caractérisation fonctionnelle de gènes/protéines d’algues brunes
Partie 5 : Objectifs de la thèse
Matériels et Méthodes
1) Analyses bioinformatiques
2) Préparation d’extraits bruts d’E. siliculosus
3) Clonage de gènes d’E. siliculosus dans un vecteur d’expression et production d’enzymes recombinantes chez Es. coli
3.1) Clonage des gènes d’E. siliculosus impliqués dans le cycle du mannitol
3.2) Transformation bactérienne
3.3) Séquençage
3.4) Induction de la production des protéines recombinantes
4) Purification des protéines recombinantes
4.1) Purification de protéines solubles
4.2) Essai de purification de protéines insolubles
5) Mesures des activités enzymatiques
6) Analyse des variations d’expression des gènes par RT-PCRq
Résultats
I) Analyse des séquences de M1PDHs de différentes origines
1) Recherche de M1PDHs chez les algues brunes
2) Analyse des séquences protéiques d’EsM1PDH
2.1) Comparaison des extrémités N-terminales
2.2) Comparaison des modules M1PDHs
3) Analyse phylogénétique
II) Caractérisation des gènes M1PDH chez E. siliculosus
1) Détermination de l’activité M1PDH endogène dans des échantillons d’algues prélevés au cours du cycle diurnal
2) Expression hétérologue des M1PDHs d’E. siliculosus chez Es. coli
2.1) Détermination de l’activité M1PDH recombinante pour les trois enzymes complètes possédant un tag histidine à l’extrémité N-terminale
2.2) Expression de protéines EsM1PDH complètes et tronquées, et contenant au moins un tag histidine à leurs extrémités
3) Purification et caractérisation biochimique de la forme tronquée d’EsM1PDH1
3.1) Purification de la protéine EsM1PDH1 tronquée à partir de cultures d’Es. coli
3.2) Détermination des pH et tampons optimaux pour les mesures d’activités de réduction du F6P et d’oxydation du M1P
3.3) Détermination de la température optimale d’activité d’EsM1PDH1 tronquée
3.4) Influence de la quantité de NaCl dans le milieu réactionnel sur les deux activités d’EsM1PDH1 tronquée
3.5) Influence de différents cofacteurs sur les activités enzymatiques
3.6) Etude des paramètres cinétiques d’EsM1PDH1 tronquée
III) Analyse de la variation de l’expression des gènes du cycle du mannitol au cours du cycle diurnal
1) Les gènes de synthèse du mannitol
2) Les gènes de recyclage du mannitol
Discussion
Conclusion
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