Les acylcarnitines
La carnitine
La carnitine (du latin carnus : viande) est une molรฉcule ubiquitaire que lโon retrouve dans les tissus des mammifรจres. Elle a รฉtรฉ dรฉcouverte dans des extraits de muscle squelettique par Gulewitsch et Krimberg en 1905 (18). Sa structure chimique, C7H15NO3, a รฉtรฉ รฉtablie en 1927 par Tomita et Sendju (19). La carnitine est biologiquement active sous sa forme lรฉvogyre. Elle est prรฉsente dans lโorganisme sous ses deux formes : L- et D-carnitine. Cโest une petite molรฉcule ayant un poids molรฉculaire dโenviron 161,2 .Elle comprend une fonction ammonium quaternaire et est hydrosoluble. Dans les annรฉes 1950, la carnitine a pris lโappellation de ยซ vitamine Bt ยป en rรฉfรฉrence ร son rรดle de facteur de croissance chez le verre de terre Tenebrio molitor(20).
Les premiers cas de pathologies concernant la carnitine dans le cadre de la รOAG datent de 1973 : Engel et Angelini dรฉcrivirent un dรฉficit en carnitine (21) et Di Mauro et Di Mauro un dรฉficit en CPTII (9). La carnitine est retrouvรฉe quasiment chez toutes les espรจces animales ainsi que chez les plantes. Les concentrations sont cependant trรจs variables selon les tissus et les espรจces. La carnitine est distribuรฉe dans tout lโorganisme. Certains tissus contiennent plus de 95% du stock total de carnitine, comme le coeur et les muscles squelettiques, principaux consommateurs de carnitine. Ils contiennent 1570 ร 3010 nmol de carnitine par gramme de tissu. Le foie, principal lieu de synthรจse, est le troisiรจme organe contenant le plus de carnitine. Le plasma contient environ 0.6% du pool total de carnitine, ce qui correspond ร une concentration de 36 ร 56 ฮผmol/L (22)(23). Les mammifรจres sont capables de synthรฉtiser de la carnitine ร partir dโacides aminรฉs (Lmethionine et L-lysine). Les principaux siรจges de synthรจse endogรจne sont le foie, le rein et le cerveau (24). La majoritรฉ des apports (75%) est dโorigine exogรจne. La viande, surtout la viande rouge et le poisson, sont les principales sources de carnitine, puis les produits laitiers dans une moindre mesure (25).
Chez les sujets vรฉgรฉtariens et vรฉgรฉtaliens, les taux de carnitine sont bas mais ils restent dans les limites physiologiques (26). La biosynthรจse de carnitine peut fournir jusquโร 90% des besoins dโun organisme nโayant que trรจs peu dโapports exogรจnes(27). Certaines bactรฉries comme Pseudomonas aeruginosa ou Escherichia Coli utilisent la carnitine comme source de carbone ou dโazote dans des conditions aรฉrobies. Dโautres utilisations sont possibles dans des conditions anaรฉrobies (28).
Rรดles de la carnitine
En 1995, il a รฉtรฉ montrรฉ que la carnitine pouvait รชtre acรฉtylรฉe de maniรจre rรฉversible par lโacรฉtyl-coenzyme A (acรฉtyl-CoA) (33). La mรชme annรฉe, il fut montrรฉ que la carnitine stimulait lโoxydation des acides gras dans le foie (34). Cโest ร partir de ces constatations que fut dรฉcouverte lโimplication de la carnitine dans le transport des acides gras ร longues chaรฎnes activรฉs, depuis le cytosol, ร travers les membranes mitochondriales, jusque dans la matrice mitochondriale, lieu de la ร oxydation des acides gras.
Le mรฉtabolisme des acides gras a lieu dans la matrice mitochondriale. Cependant, la membrane interne est impermรฉable aux acides gras. La carnitine transporte alors les acides gras ร longues chaรฎnes jusquโร la matrice. Ce processus implique diverses enzymes. Les acides gras ร longues chaรฎnes sont dโabord activรฉs par la PCS (palmitoyl-CoA synthetase) en acyl-CoA. La PCS est situรฉe sur le versant externe de la membrane externe de la mitochondrie. Ces esters CoA prรฉsents dans le cytosol passent la membrane externe mais ils doivent รชtre trans-รฉsterifiรฉs en acylcarnitines ร longues chaรฎnes pour traverser la membrane interne. Dans cette rรฉaction, la partie acyl des acides gras ร longues chaรฎnes est transfรฉrรฉe du CoA vers le groupe hydroxyl de la carnitine (figure 5) .Cette รฉtape est catalysรฉe par la CPT 1 (palmitoyltransfรฉrase 1), situรฉe sur le versant interne de la membrane externe (7). Ces acylcarnitines ร longues chaรฎnes entrent alors dans lโespace intermembranaire et sont transportรฉs ร travers la membrane interne via un transporteur spรฉcifique : la CACT (Carnitine Acylcarnitine Translocase) (35).
Une fois ร lโintรฉrieur de la matrice, la CPT 2 (carnitine palmitoyltransfรฉrase 2) reconvertit les acylcarnitines ร longues chaรฎnes en acyl-CoA ร longues chaรฎnes respectifs. La CPT 2 est situรฉe sur le versant matricielle de la membrane interne. Les acyl-CoA ร longues chaรฎnes libรฉrรฉs subissent alors leur ร-oxydation intramitochondriale. Une partie de la carnitine libรฉrรฉe dans la matrice mitochondriale quitte la mitochondrie via la CACT. Elle se retrouve de nouveau disponible dans le cytosol pour un nouveau cycle de transport. Une autre partie de la carnitine libre est utilisรฉe pour former des acylcarnitines ร courtes et moyennes chaรฎnes grรขce ร la CAT (Carnitine Acรฉtyl Transfรฉrase), ร partir des produits libรฉrรฉs au cours de la ร-oxydation des acides gras ร longues chaรฎnes. Ces acylcarnitines peuvent aussi quitter la mitochondrie via la CACT. A travers ces mรฉcanismes dโacylations rรฉversibles, la carnitine est capable de rรฉguler la concentration intarcellulaire du CoA libre et des acyl-CoA (29). Trois diffรฉrents groupes de transfรฉrases existent et se distinguent par leur substrat, leur localisation cellulaire et leur structure (36). Lโaction dโune tranfรฉrase est la suivante : Acyl-CoA + carnitine Acylcarnitine + CoASH Les CPT 1 et 2 utilisent les groupes acyl ร longues chaรฎnes et se trouvent dans la mitochondrie (37).
Dรฉtoxification de mรฉtabolites pouvant รชtre toxiques Lorsque les acyl-CoA sโaccumulent dans la mitochondrie en cas dโanomalie de la ร-oxydation des acides gras (6) ou en cas dโintoxication par certains rรฉsidus acylรฉs issus de mรฉdicaments faiblement mรฉtabolisรฉs (acide pivalique, valproateโฆ) (41), le mรฉcanisme de dรฉtoxification par la carnitine devient indispensable. En effet, la carnitine transporte des fragments acylรฉs issus de la ร-oxydation des acides gras ou issus dโun mรฉtabolisme partiel de mรฉdicaments hors de la mitochondrie et des peroxysomes. Ils sont alors รฉvacuรฉs de la mitochondrie vers le cytosol sous forme dโacylcarnitines. Ils sont ensuite excrรฉtรฉs dans les urines. Cette action permet de rรฉgรฉnรฉrer le 27 pool de CoA libre mais elle entraรฎne une dรฉplรฉtion en carnitine qui peut รชtre traitรฉe par une supplรฉmentation en carnitine (42). Lโhypocarnitinรฉmie peut donc รชtre le reflet dโune anomalie de la ร-oxydation des acides gras ou dโune intoxication par certaines molรฉcules. Dans dโautres situations pathologiques comme certaines aciduries organiques, la carnitine joue aussi un rรดle dโรฉpurateur.
La dรฉcarboxylation oxydative de certains acides aminรฉs ramifiรฉs (dรฉrivรฉs de la leucine et de la valine) entraรฎne une production de groupes acylรฉs qui sont transportรฉs hors de la mitochondrie sous forme dโacylcarnitines. Ils sont ensuite รฉliminรฉs dans les urines (40). Cette voie de dรฉtoxification a rรฉcemment รฉtรฉ accusรฉe de jouer un rรดle dans la pathogรฉnie du diabรจte de type II et de lโinsulino-rรฉsistance (43)(44)(45). Ces conditions pathologiques sont caractรฉrisรฉes par une accumulation dโacides gras dans la mitochondrie dรฉpassant les capacitรฉs mรฉtaboliques dโรฉpuration. Cet รฉtat est reflรฉtรฉ par une augmentation des acylcarnitines plasmatiques et une baisse de la carnitine libre. De nouvelles approches thรฉrapeutiques prรฉconisent dโobtenir des taux รฉlevรฉs de carnitine, permettant lโexportation des acylcarnitines hors de la mitochondrie (46).
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Table des matiรจres
LISTE DES ENSEIGNANTS DE LA FACULTร DE MรDECINE DโANGERS
COMPOSITION DU JURY
REMERCIEMENTS
LISTE DES ABREVIATIONS
PLAN
INTRODUCTION
PARTIE 1 REVUE DE LA LITTERATURE
Chapitre 1 La carnitine
1.1 Historique et aspects gรฉnรฉraux
1.2 Biosynthรจse de la L-carnitine
1.3 Rรดles de la carnitine
1.3.1 Transport des acides gras ร longues chaรฎnes dans la mitochondrie, lieu de leur oxydation
1.3.2 Rรฉgulation du ratio acyl-CoA/CoA dans la mitochondrie
1.3.3 Dรฉtoxification de mรฉtabolites pouvant รชtre toxiques
1.3.4 Oxydation des acides gras dans les peroxysomes
1.3.5 Neuroprotection
1.3.6 Autres fonctions
1.4 Rรฉgulation de la carnitine dans lโorganisme
1.4.1 Aspects gรฉnรฉraux
1.4.2 Le transport de la carnitine vers les tissus pรฉriphรฉriques
1.4.3 Rรฉgulation de la distribution tissulaire de la carnitine
1.5 Les dรฉficits acquis en carnitine
1.5.1 Situations pathologiques
1.5.2 Situations physiologiques
1.5.3 Effet de certains mรฉdicaments
Chapitre 2 La bรฉta-oxydation des acides gras (รOAG)
2.1 Son rรดle
2.2 Le cycle de la ร-oxydation
2.3 Devenir des substrats : les acรฉtyl-CoA
2.3.1 Oxydation dans le cycle de Krebs
2.3.2 Prรฉcurseurs de la biosynthรจse des lipides et des phospholipides
2.4 Rรฉgulation de la ร oxydation des acides gras
2.5 Oxydation microsomale et peroxysomale des acides gras
Chapitre 3 Les acylcarnitines
3.1 Aspects gรฉnรฉraux
3.2 Les diffรฉrents types dโacylcarnitines
3.3 Mรฉthodes dโexploration des acylcarnitines
3.3.1 Aspects gรฉnรฉraux
3.3.2 Point sur la dรฉrivatisation des acylcarnitines
3.3.3 Historique des techniques
3.3.4 Acylcarnitines: approches qualitatives, quantitatives, semi-quantitatives et ratios
3.3.5 Diffรฉrences entre acylcarnitines rรฉalisรฉs sur papier buvard et sur plasma
3.4 Interfรฉrences analytiques
3.4.1 Les toxiques
3.4.2 Lโhรฉmolyse
3.4.3 Lโanticoagulant EDTA
3.4.4 La cรฉtose
3.5 Valeurs physiologiques des acylcarnitines et de la carnitine
3.6 Place de lโexploration des acylcarnitines en pathologie
Chapitre 4 Carnitine, acylcarnitines et erreurs innรฉes du mรฉtabolisme
4.1 Le contexte
4.2 Les anomalies de transport de la carnitine et du cycle de la carnitine
4.2.1 Les anomalies de transport de la carnitine
4.2.2 Les anomalies du cycle de la carnitine
4.3 Les anomalies du cycle de la รOAG (ร lโintรฉrieur de la mitochondrie)
4.3.1 Le dรฉficit en Very Long Chain Acyl-CoA Dehydrogenase (VLCAD ; phenotype MIM number :609575)
4.3.2 Le dรฉficit en Medium chain Acy-CoA Dehydrogenase (MCAD; phenotype MIM number: 607008)
4.3.3 Le dรฉficit en Short Chain Acyl-CoA Dehydrogenase (SCAD; phenotype MIM number : 606885) .
4.3.4 Le dรฉficit en Long Chain 3 Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase (LCHAD)/ protรฉine trifonctionnelle (TFP)
4.3.5 Une forme mixte entre anomalie de la รOAG et anomalie du catabolisme dโacides aminรฉs ramifiรฉs :lโacidurie glutarique de type 2 (AG2) / dรฉficit multiple en acyl-CoA dehydrogรฉnase (MADD)
4.4 Les aciduries organiques ou acidรฉmies organiques AO
4.4.1 Gรฉnรฉralitรฉs
4.4.2 Les aciduries organiques classiques
4.4.3 Les aciduries organiques cรฉrรฉbrales
4.5 Principes de traitement et de suivi des anomalies de la รOAG et des aciduries organiques
4.5.1 Traitement et suivi des anomalies de la รOAG
4.5.2 Traitement et suivi des aciduries organiques
Chapitre 5 Stratรฉgie diagnostique des anomalies de la ร oxydation des acides gras et de certaines anomalies du mรฉtabolisme des acides organiques
5.1 Orientation gรฉnรฉrale devant une suspicion de maladie mรฉtabolique
5.2 Orientation devant une suspicion dโanomalie de la ร oxydation des acides gras ou de certaines aciduries organiques
5.2.1 Gรฉnรฉralitรฉs
5.2.2 Explorations spรฉcialisรฉes
5.2.3 Explorations complรฉmentaires
5.2.4 Exemple de stratรฉgie diagnostique australienne devant un patient suspect dโanomalie de la รOAG
Chapitre 6 Principes de la spectromรฉtrie de masse
6.1 Introduction
6.2 Notions รฉlรฉmentaires et dรฉfinitions
6.3 Les sources dโionisation
6.3.1 Dรฉfinition
6.3.2 La source MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)
6.3.3 Lโionisation par รฉlectro-nรฉbulisation ou ESI
6.4 Les analyseurs de masse
6.4.1 Gรฉnรฉralitรฉs
6.4.2 Analyseurs utilisant un champ รฉlectrique oscillant
6.4.3 Couplage des mรฉthodes sรฉparatives avec la spectromรฉtrie de masse
6.4.4 Notion de quantification en spectromรฉtrie de masse
PARTIE 2 DONNEES EXPERIMENTALES
Chapitre 1 Objectifs de lโรฉtude et mise au point de la mรฉthode
1.1 Objectifs et justification de lโรฉtude
1.2 Mise au point de la mรฉthode: considรฉrations gรฉnรฉrales
Chapitre 2 Matรฉriel et mรฉthode
2.1 Principe
2.2 Etapes prรฉanalytiques
2.3 Matรฉriel
2.3.1 Rรฉactifs
2.3.2 Etalons internes deutรฉrรฉs
2.3.3 Standards non deutรฉrรฉs pour la prรฉparation de la gamme
2.3.4 Contrรดles de qualitรฉ
2.3.5 Matรฉriel et consommable
2.3.6 LC/MSMS
2.4 Mรฉthode
2.4.1 Prรฉparation des รฉtalons internes
2.4.2 Prรฉparation des standards de carnitine et acylcarnitines non deutรฉrรฉs pour la gamme dโรฉtalonnage externe
2.4.3 Prรฉparation de la gamme dโรฉtalonnage externe
2.4.4 Prรฉparation des รฉchantillons et des contrรดles
2.4.5 Prรฉparation des tampons
2.4.6 LโHPLC, paramรจtres issus de la mise au point de la mรฉthode
2.4.7 Paramรจtres du spectromรจtre de masse
2.5 Validation de mรฉthode
2.5.1 Particularitรฉs des analytes รฉtudiรฉs
2.5.2 Paramรจtres รฉtudiรฉs
2.6 Tests de stabilitรฉ de la carnitine et des acylcarnitines
2.7 Approximation des valeurs de rรฉfรฉrence biologique
Chapitre 3 Rรฉsultats
3.1 Validation de mรฉthode
3.1.1 Rรฉpรฉtabilitรฉ
3.1.2 Fidรฉlitรฉ intermรฉdiaire
3.1.3 Evaluation de la justesse du CO
3.1.4 Estimation de lโincertitude de mesure
3.1.5 Limites de dรฉtection (LOD) et de quantification (LOQ) en ฮผM
3.1.6 Limites supรฉrieures de linรฉaritรฉ (LSL)
3.1.7 Stabilitรฉ des acylcarnitines
3.1.8 Etude de la contamination
3.2 Valeurs de rรฉfรฉrence biologique
3.2.1 Adultes
3.2.2 Tรฉmoins prรฉmaturรฉs
3.2.3 Tรฉmoins รขgรฉs de 1 ร 7 jours
3.2.4 Tรฉmoins รขgรฉs de 7 jours ร 2 mois
3.2.5 Tรฉmoins รขgรฉs de 2 ร 18 mois
3.2.6 Tรฉmoins รขgรฉs de 18 ร 59 mois
3.2.7 Tรฉmoins รขgรฉs de 5 ร 10 ans
3.2.8 Tรฉmoins รขgรฉs de 10 ร 17 ans
3.2.9 Evolution des analytes fonction de l’รขge
Chapitre 4 Discussion
4.1 Particularitรฉs et principales difficultรฉs des analytes ร doser
4.1.1 Molรฉcules trรจs hรฉtรฉrogรจnes
4.1.2 Absence de gold standard
4.1.3 Absence de contrรดles qualitรฉ
4.1.4 Etalons internes choisis
4.1.5 Axes dโamรฉlioration
4.2 Principales difficultรฉs de la technique
4.2.1 La spectromรฉtrie de masse
4.2.3 La gamme
4.2.4 La chromatographie
4.2.5 Suppression dโionisation, effet matrice, saturation du signal
4.3 Performances et limites de la mรฉthode
4.4 Stabilitรฉ des acylcarnitines
4.5 Estimation des valeurs de rรฉfรฉrence biologique
4.5.1 Discussion gรฉnรฉrale
4.5.2 Comparaison des rรฉsultats par rapport aux valeurs ยซย normalesย ยป disponibles dans la littรฉrature
4.5.3 Comparaison des rรฉsultats entre les diffรฉrentes tranches d’รขge
4.6 Principes dโinterprรฉtation
4.7 Perspectives
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
Annexes
A.Dรฉtail de lโรฉtude des tรฉmoins adultes
B.Dรฉtail de lโรฉtude des tรฉmoins prรฉmaturรฉs (9)
C.Dรฉtail des tรฉmoins de 0-7jours (3)
D.Dรฉtail des tรฉmoins de 7jours-2mois (7)
E.Dรฉtail des tรฉmoins de 2-18 mois (11)
F.Dรฉtail des tรฉmoins de 18-59 mois (7)
G.Dรฉtail des tรฉmoins de 5-10 ans (8)
H.Dรฉtail des tรฉmoins de 11-17 ans (10)
Table des matiรจres
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