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Les microorganismes rhizosphรฉriques.
Les microorganismes sont trรจs nombreux dans le sol et particuliรจrement actifs dans la rhizosphรจre grรขce ร lโexsudation de carbone organique effectuรฉe par les racines lors du processus de rhizodรฉposition (Benizri et al., 2002; 2007). En effet, le flux des rhizodรฉpots, de la racine vers la rhizosphรจre, constitue une source de carbone et dโรฉnergie pour la microflore du sol (Hamdan, 2010). Il est estimรฉ que 40 % du carbone assimilรฉ par les plantes au cours de la photosynthรจse est allouรฉ au compartiment souterrain, avec des variations importantes suivant les espรจces vรฉgรฉtales et leur environnement. Le tiers de ce carbone permet lโรฉlaboration de la biomasse racinaire, un second tiers est respirรฉ par les racines, alors quโun dernier tiers correspond ร la rhizodรฉposition qui constitue une source dโรฉnergie essentielle pour les microorganismes du sol (Hinsinger, 2010). Ainsi, la biomasse microbienne dans la rhizosphรจre vaut au moins le tiers de celle qui vit au-dessus du sol (Presott et al., 2008) et lโactivitรฉ de la microflore y sont significativement plus รฉlevรฉes.
Diversitรฉ et spรฉcificitรฉ des microorganismes rhizosphรฉriques
De nombreuses recherches ont montrรฉ que la densitรฉ, la diversitรฉ et lโactivitรฉ des microorganismes sont fortement รฉlevรฉes ร proximitรฉ de la racine รฉtant donnรฉ que cโest dans cette zone que ce manifeste lโeffet rhizosphรจre (Hamdan, 2010). Parmi les microorganismes couramment rencontrรฉs dans la rhizosphรจre se trouvent les bactรฉries dont la densitรฉ peut aller jusquโร 109 par gramme de sol (Balasubramanian et Rangaswami, 1978), les champignons microscopiques environ 105 par gramme de sol (Soufiane, 1998 ; Morel, 1996), les virus, les algues, les protozoaires et un groupe trรจs particulier qui est constituรฉ par les actinomycรจtes ou bactรฉries filamenteuses dont la densitรฉ peut atteindre jusquโร 107 par gramme de sol (Iwai et Takashi, 1992; Soufiane, 1998). Ils manifestent souvent un antagonisme vis-ร -vis des autres bactรฉries et des champignons voisins; cet antagonisme rรฉsulte de la sรฉcrรฉtion de substances antibiotiques (Soufiane, 1998).
Propriรฉtรฉs et valorisations des microorganismes rhizosphรฉriques.
Les microorganismes prรฉsents ร proximitรฉ de la racine ont des propriรฉtรฉs diffรฉrentes ร celles du sol nu (sans vรฉgรฉtation). Certains microorganismes rhizosphรฉriques peuvent jouer un rรดle majeur dans la dรฉcontamination du sol ou absorber les substances toxiques pour les transformer en composรฉs moins toxiques (Paskiewicz, 2006). Ils jouent aussi un rรดle dans la modification du pH du sol (acidification et alcalinisation) (Belyagoubi, 2014). Cependant, les rรดles bรฉnรฉfiques les plus connus sont lโamรฉlioration de la croissance des plantes par divers mรฉcanismes, la protection de la plante contre les agents pathogรจnes et lโamรฉlioration de la propriรฉtรฉ biotique et abiotique du sol (Schardl et al., 2004 ; Stefan et al., 2012). Il existe nรฉanmoins des microorganismes rhizosphรฉriques qui ne sont pas bรฉnรฉfiques pour les plantes ou pour les autres organismes vivants dans le sol (Sharma, 2014). Ces agents pathogรจnes sont รฉgalement capables de modifier les propriรฉtรฉs biologiques du sol et influencent ainsi nรฉgativement le dรฉveloppement des plantes (Sharma, 2014). Les interactions entre les microorganismes bรฉnรฉfiques et non bรฉnรฉfiques existent donc naturellement mais lโissue dรฉpend gรฉnรฉralement des propriรฉtรฉs du sol, de lโรฉtat physiologique de la plante et des alรฉas climatiques (Zhang et al., 2010).
Interaction entre la plante, le sol et les microorganismes
Il est connu depuis longtemps que la prรฉsence des microorganismes dans le sol affecte significativement la croissance des plantes (Ameur, 2011). Les interactions entre les microorganismes et la plante dans la rhizosphรจre sont nombreuses et variรฉes. Les microorganismes prรฉsents dans le sol exercent une grande influence sur plusieurs mรฉcanismes responsables de la santรฉ et de la croissance des plantes. Ils rรฉgulent souvent la rรฉponse de la plante aux stress environnementaux et contribuent au dรฉveloppement de celle-ci (Stefan et al., 2012). En effet, ces microorganismes contribuent au processus de croissance des plantes รฉtant donnรฉ quโils sโactivent dans le sol, rejoignent et stimulent lโensemble de la microflore pour dรฉclencher des rรฉactions chimiques complexes qui sous-tendent les processus de transformation et de solubilisation des nutriments minรฉraux et organiques, et leur transport du sol vers la plante, pour รชtre finalement absorbรฉs par cette derniรจre (Robin,2012).
Les actinomycรจtes
Gรฉnรฉralitรฉ sur les actinomycรจtes
Les actinomycรจtes sont des bactรฉries Gram positif avec un coefficient de Chargaff (% GC) รฉlevรฉ, allant de 51% chez certaines Corynebactรฉries, ร plus de 70% chez les genres Streptomyces et Frankia, (Ventura et al., 2007). Ce sont des microorganismes procaryotes mais leur morphologie ressemble beaucoup ร celle des champignons (eucaryote) ร cause de la prรฉsence des filaments ramifiรฉs et de sporulation au cours de leur croissance (Reponen et al., 1998). Toutefois, leurs propriรฉtรฉs chimiques, physiologiques, immunologiques les rangent parmi les procaryotes (Belyagoubi, 2014). Ces caractรจres sโajoutent ร dโautres comme le diamรจtre des hyphes, habituellement de 0,5 ร 1ยตm (Eunice et Prosser, 1983), est deux ร dix fois plus petit que celui des champignons (de 2 ร 5ยตm) (Gottlieb, 1973) et confirment le bien-fondรฉ de la classification des actinomycรจtes parmi les bactรฉries. Cette classification des actinomycรจtes est donnรฉe dans lโannexe 3.
Structure des colonies dโactinomycรจte
Les colonies formรฉes par les actinomycรจtes sur milieu solide sont trรจs particuliรจres. Elles rรฉsultent de lโaccumulation des hyphes ramifiรฉs et non pas de cellules comme le cas des bactรฉries non filamenteuses. Le diamรจtre des colonies est variable (1 ร 10mm). Lโaspect des colonies peut รชtre compact, sec, lisse, rugueux ร contours lisse ou รฉchancrรฉs. Elles sont souvent pigmentรฉes (blanc, crรจme, jaune, violet, rose, gris) (Perry et al., 2004).
Ecologie et distribution
Les actinomycรจtes sont des microorganismes ubiquitaires et se rencontrent presque dans tous les habitats (Waksman, 1959) notamment le sol oรน ils jouent un rรดle capital dans la dรฉcomposition des matiรจres organiques mรชme celles qui ne sont pas dรฉgradables par les autres microorganismes. Le genre Streptomyces est le plus frรฉquent dans le sol.
Les eaux douces et marines constituent รฉgalement des habitats pour les actinomycรจtes oรน lโon rencontre spรฉcifiquement les genres Microspora, Actinoplanes et Streptosporangium. Les actinomycetes sont prรฉsents essentiellement dans les sรฉdiments des fonds fluviaux et lacustres oรน ils jouent un rรดle important dans la dรฉcomposition des dรฉbris vรฉgรฉtaux et donnent ร lโeau son odeur de terre ainsi que sa flaveur.
Importance environnementale et socio-รฉconomique des actinomycรจtes
๏ผ Sur le plan environnemental
Les actinomycรจtes ont un rรดle important dans les processus de recyclage et de biodรฉgradation de la matiรจre organique et des รฉlรฉments minรฉraux. Ils contribuent ainsi ร la fertilisation des sols. Ils ont รฉgalement une aptitude ร dรฉgrader les substances organiques complexes difficilement dรฉgradables ou non par les autres microorganismes, tels que les polymรจres complexes, les polysaccharides, les lignocelluloses et la chitine (Goodfellow et Williams, 1983) grรขce ร leur capacitรฉ ร produire une large variรฉtรฉ dโhydrolases extracellulaires. Ils sont aussi capables de dรฉgrader ou de recycler certaines toxines produites par des champignons toxinogรจnes.
Par ailleurs, les actinomycรจtes sont connus pour leur aptitude ร produire des substances biologiquement actives non seulement sur la croissance des plantes mais aussi sur la fertilisation du sol telles les antibiotiques, les vitamines et les enzymes (de Boer et al., 2005). Certaines espรจces ont la capacitรฉ ร solubiliser le phosphore pour le rendre ainsi facilement accessible aux plantes (Crawford et al., 1993), dโautres sont รฉgalement impliquรฉes dans le contrรดle phytopathologique et dans la production des composรฉs antifongiques ou antibactรฉriens (Riedlinger et al., 2006). La production des substances ayant un rรดle important sur la croissance de la plante telle lโacide indole acรฉtique qui influence plusieurs paramรจtres physiologiques chez la plante, ร savoir lโรฉlongation et la division cellulaire, la dormance apicale, la diffรฉrenciation des tissus vasculaires, la production dโรฉthylรจne, lโinitiation racinaire (Keyeo et al., 2011) et la prolifรฉration racinaire aboutissant ainsi ร une meilleure disponibilitรฉ en eau et en nutriments est รฉgalement trรจs courant chez les actinomycรจtes (Ashrafuzzamann et al., 2009).
๏ผ Sur le plan socio-รฉconomique :
Les actinomycรจtes jouent un rรดle capital dans la production dโantibiotique. Ils gagnent en importance, car cโest la plus importante source de production dโantibiotiques et autres mรฉtabolites secondaires bioactifs (Valanarazu et al., 2009). Cโest pour cette raison que ces microorganismes sont extrรชmement pertinents pour les scientifiques pour รชtre exploitรฉs dans les industries pharmaceutiques et agricoles (Kumar et al., 2010). Ainsi, un grand nombre dโantibiotiques actuellement utilisรฉs, y compris l’รฉrythromycine, streptomycine, la novobiocine, la nystatine, la rifamycine et la gentamicine sont tous des produits isolรฉs ร partir des actinomycรจtes du sol (Thakur et al., 2007; Jeffrey, 2008). Parmi les genres producteurs, Streptomyces qui est le plus connu comme premier producteur (environ 80 % des antibiotiques totales), ensuite le genre Micromonospora (Arifuzzaman, 2010). Dโautres genres tels: Nocardia, Actinomadura, Actinoplanes, Nocardiopsis, et Saccharothrix sont aussi des producteurs dโantibiotiques.
En plus des antibiotiques antimicrobiens, les actinomycรจtes sont aussi une source de substances anti-tumorales, insecticides, antihelminthiques, pesticides, herbicides et des substances ayant des activitรฉs biologiques les plus diverses (Berdy, 2005).
Les actinomycรจtes comme principales sources de mรฉtabolites secondaires et agents biologiques
les diffรฉrentes sources de mรฉtabolites secondaires
Les mรฉtabolites secondaires sont des substances naturelles synthรฉtisรฉes par un organisme vivant (animaux, vรฉgรฉtaux et les microorganismes) qui sont responsables des fonctions indirectement essentielles ร leur survie et leur dรฉveloppement (contrairement au mรฉtabolite primaire) telles que la communication intercellulaire, la dรฉfense, la rรฉgulation des cycles catalytiques. Ce concept est historiquement attribuรฉ ร Kossel (Kossel, 1891) qui lโa introduit par opposition ร celui de mรฉtabolites primaires. Ces derniers รฉtant directement impliquรฉs dans les grandes voies du mรฉtabolisme basal de la cellule. Tous les รชtres vivant peuvent produire des mรฉtabolites secondaires ร un moment prรฉcis de leur cycle de dรฉveloppement mais les plantes et les microorganismes semblent รชtre les principaux producteurs.
๏ Les vรฉgรฉtaux sont รฉgalement parmi les organismes les plus รฉtudiรฉs comme
producteurs des mรฉtabolites secondaires. Ses composรฉs secondaires regroupent plusieurs dizaines de milliers de molรฉcules diffรฉrentes, gรฉnรฉralement rassemblรฉs en superfamilles chimiques tel que les composรฉs azotรฉs dont les alcaloรฏdes, les composรฉs phรฉnoliques ou aromatiques dont les flavonoรฏdes, les isoprรจnoรฏdes ou terpรจnoรฏdes et les hรฉterosides. Outre la trรจs grande diversitรฉ chimique quโils reprรฉsentent, ces mรฉtabolites secondaires se caractรฉrisent gรฉnรฉralement par de faibles concentrations dans les tissus vรฉgรฉtaux (gรฉnรฉralement quelques pourcents du carbone total, si on exclue la lignine de cette catรฉgorie) ainsi que par leur stockage souvent rรฉalisรฉ dans des cellules ou organes dรฉdiรฉs. Pour ce qui concerne leurs fonctions chez les plantes, les mรฉtabolites secondaires exercent un rรดle majeur dans lโadaptation des vรฉgรฉtaux ร leur environnement. Ils assurent des fonctions clรฉs dans la rรฉsistance aux contraintes biotiques (phytopathogรจnes, herbivores) et abiotiques (UV, tempรฉrature). Du point de vue pharmacologique, les mรฉtabolites secondaires constituent la fraction la plus active des composรฉs chimiques prรฉsents chez les vรฉgรฉtaux et on estime aujourdโhui quโenviron 1/3 des mรฉdicaments actuellement sur le marchรฉ contiennent au moins une substance vรฉgรฉtale (Newman et Cragg, 2012)
๏ Chez les microorganismes, les mรฉtabolites secondaires sont dรฉfinis comme des composรฉs de faible poids molรฉculaire, non essentiels ร la croissance du microorganisme producteur. La production de ces mรฉtabolites est souvent associรฉe ร la phase stationnaire de la courbe de croissance du microorganisme en question (Demain, 1995; Saffroy, 2006). Les mรฉtabolites secondaires produits par les microorganismes les plus รฉtudiรฉs sont les antibiotiques et le premier producteur dโantibiotique parmi tous les microorganismes est lโactinomycรจte comme il est montrรฉ dans le tableau ci-aprรจs (tableau 2).
METHODES
Isolement des souches dโactinomycรจte
Cette รฉtape a pour objectif dโisoler des souches dโactinomycรจte ร partir des รฉchantillons du sol rhizosphรฉrique du margose. Le milieu utilisรฉ pour lโisolement est un milieu sรฉlectif pour les actinomycรจtes: le milieu Waksman solidifiรฉ, prรฉalablement stรฉrilisรฉ ร lโautoclave ร 120ยฐC pendant 20min et sous une pression รฉgale ร 1bar.
Prรฉparation de la suspension dilution
Pour chaque รฉchantillon, 5g de sol rhizosphรฉrique, prรฉalablement sรฉchรฉ ร la tempรฉrature ambiante pendant 24 heures, ont รฉtรฉ pesรฉes et mis en suspension dans 45ml dโeau distillรฉe stรฉrilisรฉe. La suspension du sol ainsi obtenue est homogรฉnรฉisรฉe sur un agitateur magnรฉtique pendant 15 minutes et cela correspond ร la dilution 10-1. Puis aprรจs agitation au vortex, 100ยตl de la dilution 10-1 ont รฉtรฉ prรฉlevรฉs puis mรฉlangรฉs avec 900ยตl dโeau distillรฉe stรฉrilisรฉe et ce qui correspond ร une dilution 10-2. Les dilutions en cascade ainsi commencรฉes ont รฉtรฉ continuรฉes jusqu’ร lโobtention de la dilution 10-4.
Etalement sur milieu de culture solide
Pour lโรฉtalement, 100ยตl de chaque solution prรฉalablement diluรฉe ร 10-2,10-3 et 10-4 ont รฉtรฉ ensemencรฉs puis รฉtalรฉs, ร lโaide dโun racloir stรฉrile, dans des boites de Pรฉtri contenant le milieu Waksman solidifiรฉ. Pour chaque dilution trois rรฉpรฉtitions ont รฉtรฉ effectuรฉes. Les boรฎtes de Pรฉtri ont รฉtรฉ ensuite incubรฉes ร une tempรฉrature de 30ยฐC pendant 7 jours.
Observation des caractรจres morphologiques des souches
Aprรจs 7 jours dโincubation, les caractรฉristiques morphologiques des colonies apparues dans chaque boite de Pรฉtri ont รฉtรฉ observรฉes ร lโลil nu. La prรฉsence de mycรฉlium vรฉgรฉtatif diffusรฉ ร la surface du milieu de culture a servi ร la reconnaissance visuelle des colonies dโactinomycรจte. Ensuite, chaque colonie dโactinomycรจte identifiรฉe dโaprรจs leurs caractรจres morphologiques a รฉtรฉ par la suite isolรฉe sur des nouveaux milieux de culture (milieu Waksman solidifiรฉ) pour une purification et lโรฉtude de leur activitรฉ fonctionnelle.
Evaluation de lโactivitรฉ antagoniste des souches dโactinomycรจte
Lโantagonisme des souches dโactinomycรจte a รฉtรฉ รฉvaluรฉ vis-ร -vis dโune espรจce de champignon phytopathogรจne, Fusarium oxysporum. Cette activitรฉ se manifeste par lโinhibition de la croissance mycรฉlienne du champignon phytopathogรจne lorsquโils sont cultivรฉs ensembles. Lโobjectif de cette รฉtape est donc de sรฉlectionner, parmi les souches dโactinomycรจte isolรฉes ร partir du sol rhizosphรฉrique du margose, celles qui sont capables dโinhiber la croissance de cet agent phytopathogรจne.
Repiquage des souches dโactinomycรจte
A lโaide dโune anse stรฉrile, chaque souche dโactinomycรจte pure est ensemencรฉe respectivement sur le milieu de culture PDA (Potatoes Dextrose Agar) en faisant des stries trรจs serrรฉes. Toutes les boites ainsi cultivรฉes ont รฉtรฉ incubรฉes dans une รฉtuve de 30ยฐC pendant 24h.
Dรฉpรดt de la souche de Fusarium oxysporum
Lorsque les souches dโactinomycรจte ont bien repris leur phase de croissance, la souche phytopathogรจne sous forme de disque de mycelium de 1,5mm de diamรจtre a รฉtรฉ ensuite dรฉposรฉe sur le mรชme milieu ร une distance d=3cm du dรฉbut des stries de colonies dโactinomycรจte et symรฉtriquement par rapport au centre de la boรฎte de Pรฉtri (figure nยฐ3).
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Table des matiรจres
INTRODUCTION
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. LA RHIZOSPHERE DES PLANTES
II. LES MICROORGANISMES RHIZOSPHERIQUES.
II-1. Diversitรฉ et spรฉcificitรฉ des microorganismes rhizosphรฉriques
II-2. Propriรฉtรฉs et valorisations des microorganismes rhizosphรฉriques
II-3. Interaction entre la plante, le sol et les microorganismes
III. LES ACTINOMYCETES.
III.1. Gรฉnรฉralitรฉ sur les actinomycรจtes
III.2. Structure des colonies dโactinomycรจte
III.3. Ecologie et distribution
III.4. Importance environnementale et socio-รฉconomique des actinomycรจtes
Sur le plan environnemental
Sur le plan socio-รฉconomique :
IV. LES ACTINOMYCETES COMME PRINCIPALES SOURCES DE METABOLITES SECONDAIRES ET AGENTS BIOLOGIQUES.
IV.1. Les diffรฉrentes sources de mรฉtabolites secondaires.
IV.2. La lutte biologique
MATERIELS ET METHODES
SECTION I : LES MATERIELS DโETUDE
I. LA PLANTE DโETUDE
II. LES SOUCHES MICROBIENNES
II.1. Origines des Souches
II.2. Le sol rhizosphรฉrique
SECTION 2 : METHODES
I. ISOLEMENT DES SOUCHES DโACTINOMYCETE
I.1. Prรฉparation de la suspension dilution
I.2. Etalement sur milieu de culture solide
II. OBSERVATION DES CARACTERES MORPHOLOGIQUES DES SOUCHES
III. EVALUATION DE LโACTIVITE ANTAGONISTE DES SOUCHES DโACTINOMYCETE
III.1. Repiquage des souches dโactinomycรจte
III.2. Dรฉpรดt de la souche de Fusarium oxysporum
III.3. Lecture des rรฉsultats
IV. MESURE DES ACTIVITES BIOLOGIQUES DES METABOLITES SECONDAIRES
IV.1. Fermentation en milieu solide
IV.2.Extraction des mรฉtabolites secondaires
IV.3. Test dโactivitรฉ antimicrobienne des mรฉtabolites secondaires
IV.3.1. Revivification et rajeunissement des germes tests
IV.3.2. Ensemencement des germes tests et dรฉpรดt des disques
RESULTATS ET INTERPRETATIONS
I.CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES DES SOUCHES DโACTINOMYCETE ISOLEES22
II. PROPRIETE ANTAGONISTE DES SOUCHES DโACTINOMYCETE ISSUES DE LA RHIZOSPHERE DE MARGOSE
III. ACTIVITE BIOLOGIQUE DES METABOLITES SECONDAIRES DES SOUCHES DโACTINOMYCETE
DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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