LES ACTEURS MOLECULAIRES MIS EN JEU AU COURS DE LA MISE EN PLACE DES AXES EMBRYONNAIRES

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La nature moléculaire des inducteurs du mésoderme

De nombreux travaux ont été réalisés pour découvrir les molécules qui participent à l’induction du mésoderme. Ces facteurs doivent remplir un certain nombre de critères.
Tout d’abord ils doivent être exprimés avant la transition blastuléenne. De plus, l’injection d’ARNm codant pour un inducteur mésodermique dorsal doit être susceptible d’induire la formation d’un second axe embryonnaire lorsqu’il est injecté dans la région ventrale de l’embryon, ou encore de restaurer la formation d’un embryon normal lorsque l’embryon a été irradié aux UV. Enfin, si cette molécule est incubée in vitro en présence des cellules du pôle animal, elle doit être capable d’induire du mésoderme. Des expériences réalisées in vitro et in vivo ont permis d’isoler les membres de la famille des facteurs de croissance fibroblastiques, les FGF (Fibroblast Growth Factors) (Dale and Slack, 1987) et des facteurs de croissance transformants, les TGF-β (Transforming Growth factors) (Rosa et al., 1988). Ces deux facteurs induisent différents types de tissus : les facteurs de la famille FGF induisent du mésoderme ventral alors que ceux de la famille TGF-β sont plutôt associés aux structures mésodermiques dorsales. Le centre de Nieuwkoop est formé suite à l’accumulation d’un certain nombre de protéines. La formation de ce centre requiert l’implication de divers facteurs et peut se résumer de la manière suivante : au cours de l’ovogenèse, les ARNm maternels Vg1 et VegT et les protéines Dsh sont accumulés dans l’hémisphère végétatif cortical. Lors de la rotation corticale, le facteur de transcription VegT est localisé dans le cytoplasme des cellules de l’hémisphère végétatif tandis que Vg1 et Dsh se restreignent dans la future région dorsale. Vg1, VegT et la β-caténine activent l’expression zygotique des protéines de la famille Nodal, (chez le xénope elles sont appelées Xnr, pour Xenopus Nodal Related) et un gradient de ces protéines se met en place dans l’hémisphère végétatif. C’est l’accumulation de ces protéines couplée à l’activation de la voie de signalisation Wnt/βcaténine qui permettent la formation du centre de Nieuwkoop (figure 11). Ce centre est caractérisé par l’expression de plusieurs facteurs (Nodal, TGF-β, Siamois, entre autres) qui induisent les blastomères à produire du mésoderme dorso-antérieur. En ce  qui concerne la région ventrale, la combinaison des protéines de la famille FGF avec les faibles concentrations de Xnr induit la formation du mésoderme ventral.

Le centre organisateur de Spemann

Des expériences de transplantation réalisées chez le triton par Spemann et Mangold en 1924, ont permis de découvrir l’existence d’un centre organisateur des axes embryonnaires dans la région de la lèvre dorsale de l’embryon. Cette région, appelé centre organisateur de Spemann et Mangold, contient un territoire capable de spécifier les différentes structures de l’axe embryonnaire (figure 13) (Spemann and Mangold, 1924).

Induction du centre organisateur de Spemann

Le centre organisateur de Spemann correspond au mésendoderme dorsal, territoire présomptif de la chorde, de la plaque préchordale et de l’endoderme pharygien.
Au stade blastula, les activités combinées de Vg1 et VegT avec les concentrations élevées de β-caténine, génèrent un gradient dorso-ventral des protéines de la famille Nodal, les Xnrs (Xnr1, Xnr2, Xnr4, Xnr5 et Xnr6), dans l’endoderme. Ce gradient de concentration conduit la spécification du mésoderme : les faibles concentrations de Xnrpermettent la formation du mésoderme ventral, tandis que dans la région où ces concentrations sont élevées, il y aura la formation du mésoderme dorsal et du centre organisateur de Spemann. Le centre de Nieuwkoop exprime également Siamois un gène à homéoboîtes qui fonctionne comme un intermédiaire entre les facteurs maternels et la formation de l’organisateur de Spemann (Carron and Shi, 2016). Ainsi, le centre organisateur de Spemann, localisé dans la zone marginale dorsale, est induit suite aux signaux envoyés par le centre de Nieuwkoop (figure 14).

Nature moléculaire du centre organisateur de Spemann

Le centre organisateur de Spemann est une source de facteurs qui permettent la régionalisation des axes dorso-ventral et antéro-postérieur. Au niveau moléculaire, l’organisateur de Spemann induit l’expression de deux catégories de facteurs antagonistes : les antagonistes de BMP (Bone morphogenetic protein) et de Wnt. La partie de l’organisateur troncal exprime des antagonistes de la voie de signalisation BMP, comme Chordin, Noggin, Follistatin et Xnr3 et des facteurs de transcription telles que Xnot et Xbra (Xenopus brachyury) (von Dassow et al., 1993; Hansen et al., 1997; Hemmati-Brivanlou et al., 1994; Sasai et al., 1994; Smith and Harland, 1992; Smith et al., 1991). Il est important de noter Xbra est un facteur de transcription qui n’est pas exclusivement exprimé dans le centre de Spemann. En effet, il est exprimé dans le mésoderme en général et n’est pas spécifique de ce centre organisateur.
L’organisateur de Spemann exprime également des gènes inhibiteurs de la signalisation Wnt comme Crescent, Tiki, Frzb-1 (Frizzled-Related Protein 1), Dkk1 (Dickkopf-related protein 1) et sFRP2 (Secreted frizzled-related protein 2), ainsi que Cerberus et d’autres facteurs de transcription comme Goosecoid ou Otx2 (Orthodenticle Homeobox 2) (Cho et al., 1991; Glinka et al., 1998; Leyns et al., 1997; Pannese et al., 1995; Pera and De Robertis, 2000; Wang et al., 1997; Zhang et al., 2012).

Les facteurs de transcription Xnot, Xbra, Goosecoïd et Otx-2

Siamois est un gène cible de la ß-caténine. Ce facteur de transcription permet l’induction de l’expression de Goosecoïd (Moon and Kimelman, 1998), un gène qui est exprimé à partir de la transition blastuléenne dans la partie la plus végétative de la zone marginale dorsale. Goosecoïd est aussi un facteur de transcription qui joue un rôle important dans la fonction dorsalisante car il peut conduire à la formation d’un deuxième axe embryonnaire lorsqu’il est exprimé ectopiquement dans la région ventrale de l’embryon (Cho et al., 1991).
Otx2 est exprimé dès l’ovogénèse à des faibles doses, puis son expression augmente à partir de la mise en place de la transcritpion zygotique, dans le mesendoderme préchordal et dans le neuroectoderme antérieur. La surexpression d’Otx2 conduit à l’apparition d’une deuxième glande adhésive et des axes secondaires partiels. Ces embryons ont les structures troncales réduites. De plus, la surexpression d’Otx2 dans des embryons irradiés aux UV, restaure le phénotype de ventralisation. Ces embryons sont capables de former la glande adhésive, les muscles, la notochorde et les tissus neuraux. Otx2 est un gène inducteur du tissu neural antérieur et joue un rôle crucial dans la formation des axes embryonnaires et en particulier dans la formation de la spécification de la région antérieure de la tête (Pannese et al., 1995).

La région ventrale possède un centre activateur des signaux ventro-postérieurs

Au stade gastrula, la zone marginale ventrale de l’embryon possède un centre activateur dans lequel se concentre un ensemble de signaux capables de déterminer la région ventrale. Ce centre joue un rôle dans la régionalisation de l’axe dorso-ventral et aussi antéro-postérieur. Cette région exprime principalement Wnt8 et BPM4, deux facteurs qui induisent du mésoderme de nature ventrale (revoir figure 14).

L’organogenèse

L’étape suivante correspond à l’organogenèse, la phase pendant laquelle les trois feuillets embryonnaires (ectoderme, mésoderme et endoderme) mis en place au cours des étapes précédentes, évoluent et se différencient en organes. Elle se déroule pendant le stade de bourgeon caudal puis les stades larvaires. Le bourgeon caudal correspond au stade où l’embryon s’est globalement allongé selon l’axe antéropostérieur. A partir de ce stade, les yeux, la glande adhésive et les somites commencent à être bien définis. Au cours de l’organogenèse, l’ectoderme va se différencier en système nerveux et épiderme. Le mésoderme produira la chorde dans la région dorsale de l’embryon. Au niveau latéral de la chorde, le mésoderme somitique sera à l’origine du tissu conjonctif, des os, des muscles, du derme et du cartilage. Le mésoderme adjacent formera le système urinaire, les conduits génitaux, le système vasculaire, le coeur, les cellules sanguines et les composants des membres. Enfin, l’endoderme produira les épithéliums respiratoire et digestif. A l’issue de l’organogenèse, l’embryon au stade larvaire va se libérer de son chorion, ce qui lui permettra de nager librement. A ce stade, l’embryon sera nommé têtard. Le têtard mènera une vie aquatique libre aidée par une respiration de type branchial et la présence d’une région caudale différenciée en nageoire. La métamorphose,!impliquant la des remaniements internes, notamment au niveau des organes, et aussi externe, comme la formation des pattes ou la disparition de la queue, conduira au développement d’une grenouille adulte (Darribère, 2002).

Polarisation de l’axe dorso-ventral

Comme nous avons vu précédemment, la polarité dorso-ventrale est établie dès les premières étapes du développement embryonnaire. La fécondation engendre la rotation corticale, qui, à son tour, induit l’activation de la voie de signalisation Wnt/β- caténine dans la région dorsale de l’embryon. Ceci permet la formation du centre de Nieuwkoop dans la partie dorsale de l’hémisphère végétatif. L’activation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine en combinaison avec les molécules sécrétées par le centre de Nieuwkoop permettent la formation du centre organisateur de Spemann. Dans la région ventrale, il y a la formation d’un centre activateur des signaux ventro-postérieurs. Ces deux régions de la partie dorsale et ventrale émettent des signaux antagonistes pour permettre la régionalisation de l’axe dorso-ventral et aussi de l’axe antéropostérieur.

Polarisation de l’axe antéro-postérieur

Des études ont montré que différents signaux provenant du centre organisateur de Spemann, localisé dans la région dorsale, sont nécessaires pour induire les structures antéro-postérieures du tube neural. La polarité antéro-postérieur dépend ainsi de l’axe dorso-ventral.
La voie de signalisation Wnt joue un rôle crucial dans la spécification de l’axe antéro-postérieur. En effet, avant la transition blastuléenne, les ligands Wnt induisent la postériorisation de l’embryon, alors que les antagonistes Wnt, tels que GSK-3 ou DKK1, conduisent à son antériorisation. Ainsi, dans la région postérieure il y a une forte concentration de l’activation de la voie Wnt, alors que dans la région antérieure le degré d’activation de cette voie est plus faible. Ceci pourrait s’expliquer par la présence des antagonistes de Wnt dans la région antérieure. De plus, des concentrations importantes de Xnr permettent la formation du mésoderme axial antérieur (préchordal) tandis que des concentrations plus faibles de Xnr sont à l’origine du mésoderme axial postérieur (chordal).

Autres facteurs impliqués dans la mise en place des axes embryonnaires

Nous avons vu que les polarités dorso-ventrale et antéro-postérieure se mettent en place suite à une régulation stricte de différents gènes. Au niveau moléculaire, nous avons vu que les différents facteurs impliqués dans la mise en place des axes peuvent être soit activés soit réprimés. Par exemple, lors de la régionalisation de l’axe dorsoventral, les facteurs de transcription Goosecoïd et Xvent-1 se répriment mutuellement (Carron and Shi, 2016). Ceci montre que des mécanismes de répression sont importants au cours de la mise en place des axes embryonnaires.
Des mécanismes de dérepression génique sont également importants lors de ces processus. Par exemple, mon équipe a mis en évidence un nouveau mécanisme de dérepression que je vous détaillerai dans le chapitre suivant. Très brièvement, ils ont montré que Xdscr6 est un inducteur du mésoderme dorsal et du tissu neural. Ce gène est un homologue de Dscr6 humain, un gène localisé dans la région DSCR. Mon équipe a montré que XDSCR6 est capable de lever la répression induite par les membres de la famille polycomb au cours de la mise en place des axes embryonnaires (Li et al., 2013).

La région DSCR (Down Syndrom Critical Region)

Chez l’Homme, DSCR est localisée dans la région HSA21q22 (human chromosome 21) (figure 16). Des chercheurs ont montré que cette région pourrait être suffisante pour reproduire partiellement les phénotypes des patients atteints de trisomie 21, notamment le retard mental (Delabar et al., 1993; Korenberg et al., 1994). Cependant, des études plus récentes ont montré que cette région n’est pas aussi restreinte et qu’il existe d’autres régions capables d’induire d’autres caractéristiques de cette pathologie (Lyle et al., 2009).

DSCR dans les modèles murins

La région DSCR a été étudiée plus en détail dans les modèles murins. Le bras long du chromosome 21 humain contient 430 gènes dont 293 trouvent leur homologue dans le génome de la souris. Ils sont positionnés dans le même ordre et la même orientation. Chez la souris, une grande partie de ces gènes (154 orthologues) se localisent dans une région du chromosome 16 murin (MMU16), qui lui contient 715 gènes murins au total (Das and Reeves, 2011; Reymond et al., 2002). C’est également dans ce chromosome murin qu’on retrouve les gènes homologues de la région DSCR de l’Homme (figure 17). Pour étudier cette pathologie, des chercheurs ont donc créé des modèles transgéniques murins. C’est par exemple le cas des souris Ts16, Ts65Dn, Ts1Rhr que je vous présenterai ci-dessous.

Les souris Ts65Dn

Un autre modèle a été créé par l’équipe de Muriel Davisson, la souris Ts65Dn (Davisson et al., 1990). Ce modèle a été généré en créant une translocation de la partie distale du MMU16 sur la partie centromérique du MMU17 (chromosome 17 murin) (Cabin et al., 1998). Cette lignée a permis d’apporter un grand nombre de réponses sur les origines et les mécanismes conduisant certains phénotypes comportementaux, physiques et neurologiques chez l’Homme (ils sont résumés dans la Table I). Les souris Ts65Dn survivent après la naissance, ce qui permet d’étudier des caractéristiques cliniques plus tardives. Ce modèle présente beaucoup de traits communs avec l’Homme, tant au niveau morphologique que biologique (Patterson and Costa, 2005).

Les souris Ts1Rhr

Cette lignée a été générée en utilisant la technique de recombinaison Cre/loxP dans les cellules souches embryonnaires. Pour ces souris, seule la région DSCR (contenant 33 gènes) a été tripliquée (Reeves et al., 1995). Avec cette lignée, les chercheurs ont montré que cette région DSCR est suffisante pour induire les défauts cognitifs retrouvés dans le syndrome de Down (Belichenko et al., 2009).
Contrairement à la lignée Ts65Dn, les souris Ts1Rhr adultes sont plus grandes que les contrôles. Ces souris présentent des phénotypes moins sévères que les Ts65Dn et montrent que la région DSCR seule n’est pas suffisante pour reproduire toutes les anomalies morphologiques observées chez les patients trisomiques, notamment les anomalies craniofaciales (Olson et al., 2004, 2007). L’équipe de Reeves suggère ainsi que certaines anomalies retrouvées chez les patients atteints de trisomie 21 et chez les Ts65Dn ne seraient pas dues à la triplication d’un ou plusieurs gènes d’une région spécifique du chromosome mais à l’interaction entre gènes non contigus (Olson et al., 2004).

Autres modèles murins

D’autres modèles murins ont été créés pour étudier la trisomie 21. Il s’agit par exemple des lignées : Ts1Cje (Sago et al., 1998), Tc1 (O’Doherty et al., 2005), Ts1Yu (Li et al., 2007) ou Ts1Yah (Pereira et al., 2009). Dans la plupart de ces modèles, le phénotype observé est moins sévère que celui induit par la lignée Ts65Dn. Ces lignées permettent de comparer les caractéristiques morphologiques, physiologiques et biologiques, mais aussi d’estimer les déficits moteurs et cognitifs de cette pathologie.

Les gènes localisés dans cette région

Beaucoup de gènes localisés dans le chromosome 21 humain ont été surexprimés ou invalidés dans des modèles murins afin d’étudier les conséquences phénotypiques et moléculaires. C’est le cas par exemple de DYRK1A (Dual specificity tyrosinephosphorylation- regulated kinase 1A), DSCR5 et DSCR6, trois gènes localisés dans la région DSCR. Il est important de noter que la fonction de la majorité des gènes de la région DSCR n’a pas été étudiée au cours du développement embryonnaire.

Dyrk1A

DYRK1A est une protéine appartenant à la famille des Dual-specificity tyrosine- Regulated Kinases (DYRK), capable d’induire la transcription de gènes via la phosphorylation de facteurs de transcription comme CREB cette protéine est impliquée dans la régulation du cycle cellulaire, la survie cellulaire et dans la prolifération et différenciation neurale (Aranda et al., 2011; Chen et al., 2013).
Dans les années 1990, cette protéine a été étudiée chez la drosophile et les rongeurs et a été montrée comme étant impliquée dans le retard mental et la dégénérescence du Syndrome de Down. De plus, ces études ont montré que DYRK1A est essentielle pour la neurogenèse post-embryonnaire (Guimerá et al., 1996; Kentrup et al., 1996; Tejedor et al., 1995). Chez l’Homme, DYRK1A est exprimée de façon ubiquitairedans les tissus foetaux et adultes, avec une forte expression dans le cerveau et dans le coeur (Guimerá et al., 1996; Hämmerle et al., 2003). L’importance de ce gène a été renforcée par les études fonctionnelles et phénotypiques de modèles murins transgéniques ou de Knockout (KO). Le modèle KO homozygote (Dyrk1a-/-), créé par l’équipe de Fotaki, est létal au stade embryonnaire E14,5. Les souris hétérozygotes (Dyrk1a+/-) sont plus petites en taille et présentent une diminution de la taille du cerveau. Chez les deux lignées, les résultats montrent un défaut de développement du système nerveux central, une réduction du nombre de neuroblastes et une dérégulation de la différenciation neurale (Fotaki et al., 2002).
D’autres études en utilisant différentes lignées de souris transgéniques ont montré que la surexpression de Dyrk1a seul est suffisante pour induire des altérations de la morphologie cérébrale, ainsi que des troubles neurologiques et moteurs comparables à ceux observés chez les patients atteints de trisomie 21 (Ahn et al., 2006; Altafaj et al., 2001, 2008; Branchi et al., 2004; Laguna et al., 2008; Martínez de Lagrán et al., 2004; Sebrié et al., 2008; Smith et al., 1997).

Les modifications post-traductionnelles des histones

Les modifications des histones constituent un ensemble de marques de la chromatine. Elles sont importantes pour réguler de la structure chromatinienne et l’activité des gènes. En effet, les modifications post-traductionnelles des histones peuvent changer la nature de l’interaction entre l’ADN et le nucléosome ou permettre le recrutement de protéines interagissant avec la chromatine. Il existe un grand nombre de modifications des histones impliquées dans différents processus cellulaires (figure 23), comme c’est le cas de la méthylation ou de l’acétylation. En général, l’acétylation des lysines est corrélée avec une chromatine « ouverte » et transcriptionnellement active tandis que la méthylation des lysines aura un effet inverse en fonction de la position et du nombre de résidus méthylés.

La méthylation

Les histones peuvent également être méthylées sur les résidus lysines ou arginines, principalement sur les extrémités amino-terminales des histones H3 et H4. Comme pour l’acétylation, la méthylation est une modification réversible qui fait intervenir l’action d’histones méthyltransférases et de l’histones déméthyltransférases (Agger et al., 2008; Sims et al., 2003). Selon l’acide aminé modifié, les histones méthyltransférases peuvent être classés en 2 groupes différents : les PRMT (protein arginine methyltransferase) qui méthylent les résidus arginine, et les protéines à domaine SET (Suppressor of variegation 3-9, Enhancer-of-zeste, Trithorax) qui méthylent les résidus lysine. La méthylation des résidus arginine semble avoir un effet positif sur la transcription, alors que la méthylation de certains résidus lysine joue un rôle principalement dans la formation de l’hétérochromatine et donc dans la répression de la transcription (Zhang and Reinberg, 2001). Chez le xénope, ces résidus sont également méthylés au cours du développement embryonnaire précoce. Par exemple, l’acquisition de la marque H3K4me3 corrèle avec l’activation de l’expression des gènes zygotiques, alors que la marque H3K27me3 est préférentiellement déposée plus tard dans le développement, probablement pour restreindre l’activité des régulateurs transcriptionnels de façon spatio-temporelle (Akkers et al., 2009).

Les complexes PRC1 et PRC2

Les protéines Polycomb sont regroupées au sein de deux complexes principaux : Polycomb Repressive Complexe 1 et 2 (PRC1 et PRC2) (figure 24). Le complexe PRC1 catalyse la mono-ubiquitination de la lysine 119 sur l’histone H2A (H2A119ub) via RING1A et RING1B, tandis que le complexe PRC2 présente une activité méthyltransférase, notamment sur la di-/tri-méthylation de l’histone 3 sur la lysine 27 (H3K27me2/3) par l’action des sous-unités enzymatiques EZH1 et EZH2 (Kuzmichev et al., 2002; Margueron et al., 2008; Sawarkar and Paro, 2010; Schuettengruber and Cavalli, 2009; Simon and Kingston, 2009).

BMI1 au cours du développement embryonnaire

Chez la souris BMI1 est très exprimée dans les cellules souches embryonnaires, dans le placenta, dans le thymus, dans le coeur, dans les testicules et dans le cerveau (van Lohuizen et al., 1991). La délétion de BMI1 n’est pas létale au niveau embryonnaire mais les souris Bmi1-/- présentent des anomalies neurologiques, hématopoïétiques et squelettiques, notamment dans l’axe antéropostérieur (van der Lugt et al., 1994). Chez le xénope, les transcrits de XBmi1 sont détectés de manière abondante dès le début de la fécondation jusqu’à la gastrulation. Au stade gastrula, ils sont localisés essentiellement dans l’ectoderme dorsal et ventral. A des stades plus tardifs, XBmi1 est restreint aux régions le plus antérieures de l’embryon (Reijnen et al., 1995). La surexpression de XBmi1 induit des embryons avec des défauts antérieurs, notamment au niveau de la morphologie de la tête et la taille des yeux (Yoshitake et al., 1999). Ce phénotype peut être partiellement restauré avec la co-injection de XBmi1 et Xdscr6 (figure 26), comme décrit dans le chapitre II. Ces résultats démontrent que XDSCR6 empêche de XBMI1 de contacter l’ADN (Li et al., 2013).

L’implication d’EZH2 au cours du développement embryonnaire de l’amphibien

Dans les embryons de xénope Xezh2 a été identifié pour la première fois dans les années 2000. Ces travaux ont montré que Xezh2 est détecté à partir du stade blastula tardif jusqu’au stade 41 (figure 29A). De plus, cette étude a montré que cette expression est restreinte à la partie antérieure de l’embryon. En effet, des expériences de RT-PCR sur des coupes de l’embryon au stade 25 ont montré que Xezh2 est plus exprimé dans la région antérieure (figure 29B) (Barnett et al., 2001). En revanche, ces résultats ont été en désaccord avec trois autres études plus récentes. D’une part, des données de RT-PCR ont montré que Xezh2 est détecté dès le stade zygote jusqu’au stade têtard de manière constante (figure 29C) (Kawaguchi et al., 2012; Tien et al., 2015). D’autre part, il a été montré par hybridation in situ que Xezh2 est exprimé sur la totalité de l’axe antéropostérieur et son expression ne serait donc pas restreinte exclusivement à la partie antérieure de l’embryon. Cette étude a également montré que les transcrits de Xezh2 sont présents dans la moelle épinière présomptive au stade 19, puis, au stade 24, ils sont aussi détectés dans la région de la tête, y compris dans la vésicule optique. Au stade bourgeon caudal, l’expression de Xezh2 persiste dans la région antérieure, notamment dans les arcs branchiaux, dans le mésencéphale et dans les yeux (Aldiri and Vetter, 2009; Tien et al., 2015). Dans l’oeil, la protéine XEZH2 est enrichie dans les cellules progénitrices rétiniennes dans la région marginale ciliaire (Aldiri et al., 2013).

La famille STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription)

La famille des protéines STAT a été découverte dans les années 1990s. A cette époque, il avait été montré que des peptides spécifiques, notamment les interférons (IFN), étaient capables de se fixer à leurs récepteurs présents à la surface de la cellule pour entraîner la transcription d’un groupe de gènes. Les protéines de cette famille STAT ont été retrouvées chez plusieurs espèces dont la drosophile, le poisson-zèbre ou encore le xénope. Les gènes de la famille STAT codent pour des facteurs de transcription présents dans le cytoplasme en condition basale et qui sont activés transitoirement par des signaux extracellulaires, notamment par les récepteurs aux cytokines, aux hormones ou aux facteurs de croissance.
Dans les cellules, un récepteur localisé dans la membrane plasmique est stimulé suite à l’arrivée d’une cytokine. Ensuite, les tyrosine-kinases JAK (Janus kinases) en s’associant avec la sous-unité gp130 (signal transducer glycoprotein 130), s’activent par transphosphorylation. Une fois activées, les JAK kinases phosphorylent le récepteur dans sa région intra-cytoplasmique sur des résidus tyrosines. Le récepteur phosphorylé recrute alors les STAT qui sont à leur tour phosphorylées sur le résidu tyrosine par les JAK. Les STAT phosphorylées forment des homo ou hétérodimères et sont transloquées vers le noyau pour réguler l’expression de leurs gènes cibles (figure 30) (Harrison, 2012). Les STATs ont une structure modulaire comprenant des domaines fonctionnels très conservés entre les protéines de cette famille. Ces domaines fonctionnels comprennent : i) un domaine amino-terminal (N-term), ii) un domaine coiled-coil, iii) un domaine de liaison à l’ADN, iv) un domaine linker, v) un domaine SH2 (Src Homology 2) et un domaine de transactivation (TAD) (figure 31) (Miklossy et al., 2013).

STAT5

La protéine STAT5 peut être activé par les tyrosines kinases (HTVL-1), par des cytokines (par exemple par des hormones de croissance ou IL-2) ou par des récepteurs à tyrosine kinases (par exemple par EGF ou PDGF). STAT5 peut être phosphorylée sur la tyrosine 699 et sur deux résidus sérine : S128 et S193. Chez les embryons de souris, il a été montré que STAT5b est essentielle à la croissance post-natale. Les souris déficientes pour Stat5b (Stat5-/-) ont des problèmes de développement des organes sexuels du mâle.
Ceci pourrait s’expliquer par le fait que ce facteur de transcription est connu pour être activé en réponse à l’hormone de croissance dans les cellules de Leydig. De plus, ces souris présentent des problèmes de nanisme (Kanzaki and Morris, 1998). En ce qui concerne Stat5a, la déplétion de ce gène conduit à un mauvais fonctionnement mammaire (Liu et al., 1997).
Au cours du développement embryonnaire du xénope, XStat5 présente une expression maternelle et zygotique. Au stade gastrula, cet ARN est distribué de manière ubiquitaire, alors qu’à partir du stage neurula, il se concentre dans la région antérieure de la future plaque neurale. Au stade bourgeon caudal, il est fortement détecté au niveau des yeux et de la glande adhésive, et à des doses plus faibles dans les structures dorsales de l’embryon comme les somites, la notochorde et le tube neural. Au niveau ventral, XStat5 est également présent, notamment au niveau du VBI (Ventral Blood Island), la région où se développent les érythrocytes (Pascal et al., 2001). Chez l’amphibien, il a été montré que la dérégulation de cette protéine induit des défauts tardifs lors de l’érythropoïèse. En effet, XStat5 fonctionne comme un répresseur au cours de l’érythropoïèse primitive, pour permettre le développement des cellules érythroïdes.
Pendant cette période, XStat5 antagonise les gènes qui inhibent le développement de ces cellules. Ensuite, pendant les étapes tardives de l’érythropoïèse, XStat5 agit comme un activateur pour réguler la prolifération et la survie des érythrocytes définitifs (Schmerer et al., 2006).

STAT3 au cours du développement embryonnaire de la souris

Chez la souris, l’ARN de Stat3 est présent maternellement et est exprimé de manière ubiquitaire dans l’embryon ainsi que dans les tissus extraembryonnaires aux premiers stades de développement (Duncan et al., 1997). Dans les stades plus tardifs, Stat3 est détecté dans tous les tissus comme la peau, le thymus et le système nerveux (Levy and Lee, 2002). La protéine STAT3 est présente dès le stade ovocyte dans le cytoplasme. Après la mise en place de la transcription zygotique cette protéine est localisée également dans le noyau. La forme activée de STAT3, STAT3-Y705, n’est détectée qu’à partir la transition blastuléenne (figure 32), suggérant ainsi STAT3 pourrait éventuellement jouer un rôle dès le début du développement précoce (Do et al., 2013). En effet, la déplétion du gène Stat3 est létale pour l’embryon, juste après l’implantation du blastocyste. Les embryons meurent au stade E7.0 avec des défauts de gastrulation, notamment à cause de leur incapacité à former du mésoderme entre l’ectoderme et l’endoderme (Takeda et al., 1997). Une étude plus récente a montré que STAT3 régule directement l’expression d’Oct4 et Nanog pour maintenir la pluripotence des cellules souches embryonnaires. Ainsi, STAT3 est impliquée dans le maintien de la pluripotence de ces cellules (Do et al., 2013).

STAT3 au cours du développement embryonnaire de l’amphibien

Chez le xénope, il a été montré par RT-PCR quantitative que l’ARNm de XStat3 est exclusivement présent dans l’hémisphère animal de l’embryon du stade 4 au stade 6 (Flachsova et al., 2013). Les travaux de Nishinakamura ont montré qu’au stade gastrula, cet ARNm est détecté, par hybridation in situ, principalement dans le neuroectoderme présomptif. En ce qui concerne la protéine STAT3, elle est présente dès le stade 1 (ovocyte) jusqu’au stade 42 (stade larvaire), suggérant une contribution maternelle et zygotique (Nishinakamura et al., 1999). Une autre étude qui porte sur le rôle de STAT3 au cours de la mise en place des crêtes neurales, a montré, par immunodétection, que STAT3-Y705 est présente au niveau de l’ectoderme à la fin de la gastrulation et au cours de la neurulation chez le xénope. Cette étude s’est focalisée essentiellement sur le rôle de STAT3 dans la mise en place des crêtes neurales. Pour cette raison, les auteurs n’ont pas détaillé si STAT3-Y705 est présente également dans les deux autres feuillets embryonnaires (Nichane et al., 2010). Toutes ces données montrent que STAT3 est exprimée et potentiellement active lors du développement précoce, mais sa cinétique d’expression et d’activité au cours du développement n’a pas été analysée en détail chez l’amphibien. Deux autres études ont analysé en partie les conséquences de la dérégulation de STAT3 au cours du développement embryonnaire.
D’abord, les travaux de Nishinakamura portent sur l’étude du rôle des récepteurs Cytokines dans la régionalisation de l’axe dorso-ventral. Ils ont montré que l’injection d’une forme activée du récepteur activateur gp130 au stade 4 cellules dans les blastomères dorsaux, induit une forte ventralisation des embryons (figure 33A) et inhibe l’expression des marqueurs du mésoderme comme Xnot et MyoD. Par des essais luciférase, les auteurs ont montré que XSTAT3 est activée transcriptionnellement suite à la stimulation de gp130. L’injection d’une forme dominante négative de STAT3 (STAT3-EnR, où la région responsable des propriétés activatrices de la transcription a été remplacée par un domaine répresseur Engrailed) dans la partie ventrale de l’embryon induit la formation d’un axe embryonnaire surnuméraire (Figure 33A’). Ainsi, lorsque Stat3 est converti en un répresseur, les tissus injectés sont dorsalisés. L’ensemble de ces résultats suggère que STAT3 aurait une activité ventralisatrice. Comme j’ai décrit précédemment dans le premier chapitre, l’injection d’une forme dominante négative de BMP-4 induit la formation d’un double axe (Suzuki et al., 1994). Les auteurs ont montré que l’activationde gp130, et par conséquent de XSTAT3, n’a pas restauré ce phénotype. Ceci suggère que l’activité ventralisante de STAT3 est indépendante de la voie BMP. Les auteurs ont montré que la Xwnt8 n’active pas XSTAT3. Ils ont ainsi proposé que proposé que la voie gp130/Xstat3 est indépendante de la signalisation Wnt. En revanche, ils ont suggéré que Xstat3 aurait un lien avec le facteur transducteur de signal Smad2. La surexpression ectopique de Smad2 induit la formation d’un axe surnuméraire, et ce phénotype est restauré par la co-injection avec les récepteurs de cytokines, ce qui suggère que l’activité dorsalisante de Smad2 est inhibée par l’activation de ces récepteurs et donc l’activation de Xstat3. Les auteurs ont ainsi proposé que Xstat3 régule l’inhibition de la voie Smad2, et ceci pourrait expliquer les propriétés ventralisatrices de Xstat3. Les travaux de Nishinakamura ont ainsi proposé que l’activité ventralisatrice de Stat3 est indépendante de la voie BMP et que Stat3 fonctionne en inhibant notamment Smad2 (Nishinakamura et al., 1999).
D’autres travaux ont étudié l’implication de la voie STAT3 dans l’induction du mésoderme. D’abord, les travaux de Ohkawara ont montré que l’inhibition de NLK (Nemo-like kinase, qui inhibe la voie de signalisation Wnt) conduit à la formation d’embryons avec une gastrulation incomplète et un axe antéro-postérieur raccourci. Ils ont également montré que NLK interagit avec STAT3 et phosphoryle directement son résidu sérine localisé dans la partie carboxy-terminale. Ensuite, ils ont étudié le rôle de STAT3 dans l’induction du mésoderme. L’injection d’un morpholino spécifique de Xstat3 dans la région dorsale de l’embryon induit un phénotype similaire à celui obtenu lors de l’inhibition de NLK (gastrulation incomplète et axe antéro-postérieur raccourci) (figure 33B). L’expression des marqueurs mésodermiques Xbra, α-actin et Xnot au niveau de la zone marginale dorsale est également inhibée. Les auteurs ont également utilisé trois formes dominantes négatives de STAT3 – les mutants simples STAT3-YF, STAT3-SA ou le double mutant STAT3-YFSA (dans ces mutants les acides aminés Y et S ont été remplacés par des acides aminés non phosphorylables). Ils ont montré que l’injection de ces formes induit la diminution de l’expression de Xbra. A l’inverse, l’utilisation d’un mutant constitutivement actif de STAT3, STAT3-CTC-SE (qui mime la dimérisation et la phosphorylation de STAT3) induit l’expression de Xbra (figure 33B’). Ces résultats suggèrent ainsi que la dimérisation et la phosphorylation de STAT3 sont requises pour l’induction du mésoderme et que STAT3 pourrait être importante pour la mise en place des feuillets embryonnaires primordiaux (Ohkawara et al., 2004).

Table des matières

INTRODUCTION
A. ETUDE DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE 
1. L’HISTOIRE
2. LE MODELE XENOPUS LAEVIS
B. MISE EN PLACE DES FEUILLETS EMBRYONNAIRES
1. LES ETAPES DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE DE XENOPUS LAEVIS
1.1. L’ovogenèse
1.2. La fécondation
1.3. La segmentation
1.3.1. La nature moléculaire des inducteurs du mésoderme
1.4. La gastrulation
1.4.1. Le centre organisateur de Spemann
1.4.2. Induction du centre organisateur de Spemann
1.4.3. Nature moléculaire du centre organisateur de Spemann
1.4.3.1. Les antagonistes de BMP
1.4.3.2. Les antagonistes de Wnt
1.4.3.3. Les facteurs de transcription Xnot, Xbra, Goosecoïd et Otx-2
1.4.3.4. La protéine Cerberus
1.4.4. La région ventrale possède un centre activateur des signaux ventro-postérieurs
1.4.4.1. BMP4
1.4.4.2. Wnt8
1.5. La neurulation
1.6. L’organogenèse
2. RESUME : LES ACTEURS MOLECULAIRES MIS EN JEU AU COURS DE LA MISE EN PLACE DES AXES EMBRYONNAIRES 
2.1. Polarisation de l’axe dorso-ventral
2.2. Polarisation de l’axe antéro-postérieur
2.3. Autres facteurs impliqués dans la mise en place des axes embryonnaires
C. LES GENES DE LA FAMILLE DSCR 
1. GENERALITES DE LA TRISOMIE
2. LA REGION DSCR (DOWN SYNDROM CRITICAL REGION)
2.1. DSCR dans les modèles murins
2.1.1. Les souris Ts16
2.1.2. Les souris Ts65Dn
2.1.3. Les souris Ts1Rhr
2.1.4. Autres modèles murins
2.2. Les gènes localisés dans cette région
2.3.1. Dyrk1A
2.3.2. DSCR5
2.3.3. DSCR6
D. LES REGULATIONS EPIGENETIQUES AU COURS DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE 
1. GENERALITES
2. LES MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES DES HISTONES
2.1. L’acétylation
2.2. La méthylation
3. IMPORTANCE DES POLYCOMBS
4. LES COMPLEXES PRC1 ET PRC2
4.1. PRC1
4.1.1. BMI1
4.1.1.1. BMI1 au cours du développement embryonnaire
4.2. PRC2
4.2.1. EZH2
4.2.1.1. L’implication d’EZH2 au cours du développement embryonnaire de la souris
4.2.1.2. L’implication d’EZH2 au cours du développement embryonnaire de l’amphibien
E. LE FACTEUR DE TRANSCRIPTION STAT3 
1. LA FAMILLE STAT (SIGNAL TRANSDUCER AND ACTIVATOR OF TRANSCRIPTION)
2. IMPLICATION DES DIFFERENTS STATS AU COURS DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE
2.1. STAT1
2.2. STAT5
2.3. STAT3
2.3.1. STAT3 au cours du développement embryonnaire de la souris
2.3.2. STAT3 au cours du développement embryonnaire de l’amphibien
2.3.3. La régulation de Stat3
2.3.3.1. La phosphorylation de STAT3
2.3.3.2. L’acétylation de STAT3
2.3.3.3. La méthylation de STAT3
PROJET DE THESE
RESULTATS 
1. PRESENTATION DES RESULTATS
2. PUBLICATION EN COURS
SUMMARY
INTRODUCTION
MATERIAL AND METHODS
Embryos manipulations
Plasmid constructs
GST pull-down, co-immunoprecipitation and western blot analysis
Immunostaining experiments
Luciferase assay
RESULTS 
XDSCR6 and XSTAT3 exhibit antagonistic effects in vivo
XDSCR6 physically interacts with XSTAT3 in vitro and in vivo
XSTAT3 is mainly activated during gastrulation
XDSCR6 negatively regulates XSTAT3 transcriptional activity and lysine-methylation
EZH2 methyltransferase activity is required for optimal XSTAT3 activity in vivo
DISCUSSION 
XSTAT3 is mainly active during xenopus gastrulation and exhibits ventralization properties
Implication of XDSCR6 in XSTAT3 regulation during axis specification
XDSCR6 negatively regulates XSTAT3 transcriptional activity by modulating its lysine methylation during embryonic development
XDSCR6, a regulator at the cross-road between epigenetic and transcriptional control?
ACKNOWLEDGEMENTS
AUTHOR CONTRIBUTION
FUNDING
REFERENCES
FIGURES
DISCUSSION 
A. LA FONCTION DE XDSCR6, XSTAT3 ET XEZH2 AU COURS DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE D’AMPHIBIEN
1. XSTAT3 EST ACTIVE AU COURS DE LA GASTRULATION
2. L’ACTIVATION DE XSTAT3 CONDUIT A DES MALFORMATIONS ANTERIEURES 97
3. IDENTIFICATION DES GENES CIBLES DE XSTAT3 IN VIVO AU COURS DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE
4. L’INACTIVATION XSTAT3, EN MODULANT NEGATIVEMENT SA PHOSPHORYLATION, NE SEMBLE PAS JOUER UN ROLE DANS LA MISE EN PLACE DES AXES EMBRYONNAIRES
5. XSTAT3 EST METHYLEE SUR LES RESIDUS LYSINE AU COURS DE LA GASTRULATION ET LA MODULATION DE CETTE METHYLATION EST IMPLIQUEE DANS LA MISE EN PLACE DES AXES EMBRYONNAIRES
6. XSTAT3 INTERAGIT DIRECTEMENT AVEC XDSCR6 ET XEZH2 VIA SON DOMAINE CARBOXYTERMINAL
8. LA MODULATION DE L’ACTIVITE METHYLTRANSFERASE D’EZH2 INFLUENCE LA MISE EN PLACE DES AXES EMBRYONNAIRES
9. XSTAT3 REQUIERT L’ACTIVITE DE LA METHYLTRANSFERASE EZH2 POUR ETRE METHYLEE ET TRANSCRIPTIONNELLEMENT ACTIVE
10. LA MODULATION DE LA PHOSPHORYLATION SUR LE RESIDU S21 D’EZH2 MODIFIE LA MISE EN PLACE DES AXES EMBRYONNAIRES
11. XDSCR6 INHIBE L’ACTIVITE TRANSCRIPTIONNELLE DE STAT3 EN INTERFERANT AVEC SON ETAT DE METHYLATION
12. XDSCR6 REGULE NEGATIVEMENT L’ACTIVITE DE XEZH2 ET DE XSTAT3
B. EST-CE QUE LES FONCTIONS DE XDSCR6, XSTAT3 ET XEZH2 EST CONSERVEE AU COURS DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE DES AUTRES VERTEBRES ? 
C. LA REGULATION NEGATIVE DE XDSCR6 SUR EZH2 ET STAT3 EST-ELLE CONSERVEE AU COURS DES PROCESSUS ONCOGENIQUES ? 
CONCLUSION GENERALE
REFERENCES BIBLIOGRAHIQUES

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