Soutenance mémoire
Le ribosome
Le ribosome est un complexe macromoleculaire forme de deux sous-unite s et compose d’ARN ribosomiques (ARNr) et de proteines ribosomiques (RP). Il est present dans tous les domaines du vivant et est responsable de la traduction de l’information gene tique contenu dans l’ARN messager (ARNm), pour cela il a pour role de de coder l’ARNm puis de synthetiser les proteines.
Historique
C’est en 1955 que Georges E. Palade de couvrit pour la premiere fois les ribosomes par observation de cellules de rats par microscopie electronique en transmission. Il les de crivit comme des petites particules granulaires d’environ 20 nanometres entourant le reticulum endoplasmique, qu’il appela initialement microsome (Palade, 1955). Cette de couverte lui a d’ailleurs valu le prix Nobel de medecine en 1974. Par la suite, plusieurs etudes biochimiques et fonctionnelles ont et emenees et ont permis d’identifier que ces microsomes etaient des complexes ribonucle o-proteiques (RNP). C’est dans ce contexte que Richard B. Roberts renomma ces particules des ribosomes, lors du congre s « Microsomal Particles and Protein Synthesis » en 1958. Durant les annees 60, ces etudes ont aussi pu mettre en e vidence le role des ribosomes dans la synthese proteique (Kirsch et al., 1960; McQuillen et al., 1959; Palade, 1975).
La determination de la structure tridimensionnelle des ribosomes a e te essentielle dans lacompre hension des me canismes entourant le de codage de l’information ge ne tique porte parl’ARNm et la synthe se des chaî nes d’acides amine s. Les toutes premie res observations des sousunite s ribosomiques ont e te re alise es en microscopie e lectronique par coloration ne gative. Ces observations ont permis de donner un premier aperçu de la morphologie du ribosome en ge ne rant les tous premiers mode les 3D « fait a la main » (Lake, 1976; Vasil’ev, 1974). Les ribosomese tant des complexes de tre s grosse taille, ils ont e te tre s largement utilise s en tant « qu’outil » afin de de velopper les techniques structurales, cet aspect sera plus largement de crit par la suite. Dans les anne es 1980-90, gra ce aux avance es technologiques des me thodes de cristallographies aux rayons X ainsi que de cryo microscopie e lectronique (Cryo-EM) (Dubochet et al., 1981) la recherche des premie res structures de ribosomes a pu rapidement progresser. En effet, a la fin des anne es 1990, la cristallographie aux rayons X a permis l’e lucidation de plusieurs structures de sous-unite s ribosomiques procaryotes, ame liorant a chaque fois leur re solution. L’exemple de la de termination de structures de la grande sous-unite ribosomique de l’arche e Haloarcula marismortui permet d’illustrer cette rapide e volution, passant d’une structure basse re solution (9 A ) (Ban et al., 1998), a moyenne re solution (5 A ) (Ban et al., 1999) jusqu’a atteindre une structure haute re solution de 3,5 A en 2000 (Ban et al., 2000). Et c’est au de but des anne es 2000, par cristallographie aux rayons X, que les premie res structures a l’e chelle atomique de ribosomes entiers procaryotes ont ete resolues. En 2001, Noller et ses collaborateurs ont rapporte la structure cristalline du ribosome entier de Thermus thermophilus a une re solution de 5,5 A (Yusupov et al., 2001), mais la toute premie re structure haute re solution (3,5 A ) d’un ribosome entier a e te obtenue par Cate et ses collaborateurs pour un ribosome vide d’Escherichia coli (Schuwirth et al., 2005). L’ensemble de ces travaux a e te essentiel dans la compre hension des me canismes de la synthe se prote ique ainsi que dans la mise en e vidence de la complexite structurale du ribosome. La de termination de ces mode les a permis une de couverte majeure, en montrant que le centre de peptidyl-transfe rase, ou la formation des liaisons peptidiques est catalyse e, est forme exclusivement d’ARNr, aucune chaîne peptidique n’e tant visible a moins de 18 A de ce centre catalytique (Ban et al., 2000; Muth et al., 2000; Nissen et al., 2000). Il a donc e te possible de de montrer que le ribosome est en fait un ribozyme, c’est-a -dire une enzyme tirant son pouvoir catalytique de l’ARN et non des prote ines.
Composition et structure des ribosomes
Les ribosomes sont des complexes ribonucle o-prote iques (RNP) compose s de deux sousunite s asyme triques appele es grande et petite sous-unite . Ces sous unites sont de finies par leur coefficient de se dimentation, chez les eucaryotes la grande sous-unite est la 60S (Svedberg) (50S chez les procaryotes) et la petite sous-unite est la 40S (30S chez les procaryotes). Lorsque ces deux sous-unite s s’assemblent, elles forment le ribosome mature aussi appele 80S (70S chez les procaryotes). Cette particule 80S est compose e de quatre ARNr, formant le squelette du ribosome et qui represente 60 % de la masse totale de ce dernier, ainsi que 80 prote ines ribosomiques .
Chez les eucaryotes, la grande sous-unite ribosomique 60S est compose e de trois ARNr qui sont les ARNr 5S, 5.8S et 25S/28S ainsi que 47 prote ines (RPL). Quant a la petite sous-unite ribosomique 40S, elle comprend un seul ARNr le 18S associe a 33 prote ines (RPS).
Ces deux sous-unite s ont des activite s distinctes dans la traduction de l’information genetique des ARNm en prote ine. En effet, la petite sous-unite est essentielle au de codage de l’ARNm en permettant l’appariement correct des ARN de transfert (ARNt) sur l’ARNm. Cette sousunite est donc implique e dans la fide lite de la traduction. Elle se caracterise par sa forme allonge e et ses cinq domaines structuraux : la te te avec le bec, le corps, la plateforme et les pieds droit et gauche (Figure 1A). Dans la petite sous-unite se trouve e galement le sillon d’entre e de l’ARNm a de coder localise entre la te te et le corps de la particule . La grande sous-unite , est de forme globulaire et se compose d’un domaine central ainsi que trois protube rances qui sont la protube rance centrale, les tiges P et L1 . Elle posse de un centre peptidyl transfe rase (PTC), qui permet de catalyser la formation des liaisons polypeptidiques entre les acides amine s. Cette activite est donc essentielle a l’e longation de la chaî ne polypeptidique, aboutissant a la synthe se des prote ines. A proximite du PTC, et traversant toute la grande sous-unite , se trouve aussi le tunnel de sortie des proteines ne o-synthe tisees .
Une fois assemble es en ribosome, a l’interface des deux sous-unite s se trouvent les trois sites de liaisons des ARNt portant les acides amines qui serviront a la synthe se prote ique durant la traduction. Lors des e tapes de la traduction, le site A (pour Aminoacyl-ARNt) est occupe par un ARNt portant l’acide amine qui doit e tre incorpore a la chaî ne polypeptidique, ensuite, c’est dans le site P (pour Peptidyl-ARNt) que vient se loger l’ARNt portant la chaî ne polypeptidique en cours de synthe se, enfin, le site E (pour Exit-ARNt) comprend un ARNt de acyle pre t a se dissocier de l’ARNm et du ribosome .
Bien que les aspects fondamentaux de la synthe se des prote ines soient pre serve s dans tous les domaines du vivant, les ribosomes eucaryotes sont plus complexes et sont en moyenne 40 % plus gros que leurs homologues procaryotes. En effet, la masse du ribosome bacte rien 70S est d’environ 2,5 MDa contre 3,2 MDa pour le ribosome 80S des eucaryotes unicellulaires et jusqu’a 4,3 MDa pour celui des eucaryotes supe rieurs. L’ensemble de ces ribosomes partagent un noyau structurel commun, conserve au cours de l’e volution, abritant les principaux centres fonctionnels des ribosomes, tels que le site de de codage, le centre de peptidyl transfe rase et les sites de liaison a l’ARNt. Mais la diffe rence de taille s’explique par la pre sence de prote ines ribosomiques supple mentaires, ainsi que d’addition de domaines sur des prote ines conserve es et de par la pre sence de segments d’extensions sur les ARNr (Anger et al., 2013; Klinge et al., 2012). Ces domaines additionnels spe cifiques des eucaryotes forment des couches externes autour du noyau commun du ribosome .
Il a de ja e te montre que si tous les composants du ribosome bacte rien e taient me langes ensemble dans un ordre pre cis, celui-ci pouvait s’auto-assembler in vitro (Nomura, 1970). Ceci ne s’applique pas pour le ribosome eucaryote. En effet, la synthe se (biogene se) des ribosomes eucaryotes requiert plus de 200 facteurs d’assemblage et de maturation, qui ont e te caracte rise s progressivement par diffe rentes approches me thodologiques (Henras et al., 2008). Du fait de la complexite des ribosomes eucaryotes, l’e lucidation de leur structure a demande plus de temps. La premiere structure a haute re solution (4,15 A ) du ribosome de levure a e te obtenue en 2010 par cristallographie aux rayons X (Ben-Shem et al., 2010). Puis, un an plus tard, cette me me e quipe a re ussi a obtenir une deuxie me structure du ribosome de S. cerevisiae cette fois-ci a 3 A de re solution, permettant ainsi d’acquerir de nouveaux de tails structuraux afin de positionner l’ensemble des proteines ribosomiques eucaryotes (Ben-Shem et al., 2011).
La cryo-microscopie e lectronique (cryo-EM), a quant a elle permis une avance e majeure sur la de termination des structures de ribosomes eucaryotes et en particulier celle des ribosomes humains (Figure 4). En effet, les premie res structures hautes re solutions de ribosomes humains ont e te obtenues par cryo-EM. En 2013, une premie re structure a e te e lucide e a moyenne re solution (~5,4 – 6 A ) (Anger et al., 2013), et c’est en 2015 que la premie re structure a l’e chelle atomique du ribosome 80S humain a pu e tre re solue a 3 A de re solution (Khatter et al., 2015). La determination de ces structures hautes re solution a e te possible gra ce a plusieurs avance es technologiques re centes de la microscopie e lectronique et de l’analyse d’images. La technique de cryo-microscopie e lectronique a e te mise au point il y a environ 40 ans par Jacques Dubochet et ses collaborateurs (Dubochet et al., 1981). Cette me thode a pour principe de congeler instantane ment l’e chantillon biologique dans une glace vitreuse. Cette technique permet donc d’observer des particules dans un e tat hydrate proche de leur e tat natif, ce qui n’e tait jusqu’a pre sent pas le cas, que ce soit lors de l’observation de particules apre s coloration negative (coloration par des sels de me taux lourds) ou lors de la de termination de structures par cristallographie au rayons X. Cette technique de pre paration des e chantillons associe e a l’analyse des images par la me thode des particules isole es (SPA) a donc e te essentielle dans la determination des premie res structures de complexes macromole culaires tels que les ribosomes par cryo-EM.
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Table des matières
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION
I. LE RIBOSOME
1.HISTORIQUE
2.STRUCTURE ET COMPOSITION DU RIBOSOME
II. LA BIOGENÈSE DES RIBOSOMES EUCARYOTES
1.GÉNÉRALITÉS
2.LES ACTEURS DE LA BIOGENÈSE DE LA PETITE SOUS-UNITÉ RIBOSOMIQUE
a. L’ARNr 18S
b. Les protéines ribosomiques
c. Les facteurs de maturation
3.LES ÉTAPES DE LA MATURATION CYTOPLASMIQUE DE LA PETITE SOUS-UNITÉ RIBOSOMIQUE
4.PROCESSUS DE CONTRÔLE QUALITÉ
III. LA TRADUCTION PAR LE RIBOSOME EUCARYOTE
1.VUE D’ENSEMBLE DU PROCESSUS DE SYNTHÈSE PROTÉIQUE
a. L’initiation de la traduction
b. L’élongation de la traduction
c. La terminaison de la traduction
2.FOCUS SUR L’ÉTAPE D’ÉLONGATION DE LA TRADUCTION
a. Reconnaissance du codon
b. Accommodation de l’ARNt-aa dans le site A et formation de la liaison peptidique
c. Translocation de l’ARNt et de l’ARNm
IV. LES MALADIES ASSOCIÉES À DES DÉFAUTS DU RIBOSOME
1. MANIFESTATIONS DES DÉFAUTS DE LA BIOGENÈSE DES RIBOSOMES
a. Cas des ribosomopathies dues à une haplo-insuffisance
b. Haplo-insuffisance de RPS20, un cas particulier de ribosomopathie
2. MUTATIONS RIBOSOMIQUES IMPLIQUANT DES DÉFAUTS DE TRADUCTION
a. Mutations impactant la fidélité de la traduction
b. Mutations entraînant la traduction spécialisée de certains ARNm
3. ALTÉRATION DES FONCTIONS EXTRA-RIBOSOMIQUES DE PROTÉINES RIBOSOMIQUES DÉFECTUEUSES
4. L’ÉNIGME DE DAMESHEK OU COMMENT LA CELLULE EST CAPABLE DE PASSER D’UN ÉTAT D’HYPOPROLIFÉRATION À UN ÉTAT D’HYPER-PROLIFÉRATION ?
V. PROBLÉMATIQUES ET OBJECTIFS DE THÈSE
CHAPITRE 2 : MATÉRIELS ET MÉTHODES
I. PURIFICATION ET ANALYSES DES PARTICULES PRÉ-40S HUMAINES
1.CULTURE CELLULAIRE ET TRAITEMENT AVEC SIARN
2. PURIFICATION PAR AFFINITÉ DES PARTICULES PRÉ-40S HUMAINES
a. Analyse des protéines
b. Analyse des ARN
3.SUREXPRESSION ET PURIFICATION DE LA PROTÉINE HRPS26-HIS
4. EXPÉRIENCE DE CLIVAGE IN VITRO
5. IMMUNOPRÉCIPITATION AVEC L’ANTICORPS α-EIF1AD
II. PURIFICATION ET ANALYSE DE POLYSOMES À PARTIR DE CELLULES BA/F3 WT OU MUTANTES
1.CULTURE CELLULAIRE DES CELLULES BA/F3
2. PURIFICATION DES POLYSOMES SUR GRADIENT DE SACCHAROSE 10-50 %
3. PURIFICATION DES POLYSOMES AVEC TRAITEMENT AU CYCLOHEXIMIDE
III. LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE À TRANSMISSION (MET)
1.PRINCIPES GÉNÉRAUX
2. QUELS SONT LES DIFFÉRENTS ÉLÉMENTS COMPOSANT LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE ?
3. COMMENT SE FORME UNE IMAGE ?
4. QUELLES SONT LES LIMITES DE LA RÉSOLUTION ?
5. LA FONCTION DE TRANSFERT DE CONTRASTE (CTF)
IV. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR LA MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE
1.COLORATION NÉGATIVE
2. CRYO-CONGÉLATION
V. ANALYSE D’IMAGES
1.PRINCIPES GÉNÉRAUX
2. ÉTAPES DE TRAITEMENT DES IMAGES
a. Pré-traitement
b. Classification 2D
c. Classification 3D
d. Auto-raffinement 3D
e. Post-traitement
f. Classification 3D masquée
g. Polishing des particules
h. Interprétation des cartes de densité électronique : construction des modèles atomiques
CHAPITRE 3 : RÉSULTATS
I. ANALYSES FONCTIONNELLES DES PARTICULES PRÉ-40S TARDIVES HUMAINES
1.CONTEXTE ET OBJECTIFS DE L’ARTICLE
2. ARTICLE: THE FINAL STEP OF 40S RIBOSOMAL SUBUNIT MATURATION IS CONTROLLED BY A DUAL KEY LOCK
3. BILAN ET PERSPECTIVES
II. CARACTÉRISATION STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DE RIBOSOMES MUTANTS RPS15- P131S,“ONCORIBOSOMES »
1.PRÉPARATION ET CARACTÉRISATION DES POLYSOMES DE BA/F3
a. Préparation des polysomes
b. Caractérisation des polysomes de Ba/F3 WT et RPS15-P131S
2. ANALYSE STRUCTURALE DES POLYSOMES
a. Acquisition des images
b. Analyse d’images
c. Modèles atomiques
d. Interprétation des cartes
e. Effet de la mutation RPS15-P131S sur le ribosome en cours de traduction
3. DISCUSSION ET PERSPECTIVES
4. CONCLUSION
CHAPITRE 4 : CONCLUSION GÉNÉRALE
BIBLIOGRAPHIE
