L’épidémie du VIH/SIDA

L’épidémie du VIH/SIDA

Un traitement alternatif au VIH/SIDA : une réelle nécessité

Les données récentes sur l’incidence du VlH/SIDA démontrent bien que malgré une efficacité grandissante des agents antirétroviraux et de leurs combinaisons, un nombre important de nouvelles infections est toujours présent au niveau mondial. De plus, bien que le nombre de décès reliés au VIH/SIDA présente une tendance à la baisse dans certaines régions du monde (en Amérique du Nord, entre autres), une importante hausse de la mortalité est observée dans d’autres régions, incluant l’Europe de l’Est et l’Asie. De surcroît, aucun traitement actuellement répandu contre le VIH/SIDA ne permet son éradication chez les personnes atteintes. Elles doivent donc continuellement adhérer au traitement, ce qui entraîne une lourde charge économique et augmente la fréquence des interruptions de traitement, ce qui favorise l’émergence de virus résistants aux traitements, en plus de faciliter une éventuelle transmission du virus par l’augmentation de la charge virale . La fréquence d’émergence de tels virus est difficile à estimer, compte tenu de la grande quantité de facteurs l’influençant (géographie, contexte socioéconomique, génétiques de l’individu et des différentes souches virales).
Néanmoins, des études ont signalé la présence de mutations conférant une résistance à un agent antiviral chez 20 à 50 % des participants à leurs cohortes . De plus, la prévalence de la transmission de souches virales portant une mutation de résistance à un agent antiviral augmente au fil du temps, et a récemment été évaluée entre 4 et 12 % selon la localisation géographique.L’élaboration et la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques sont donc d’une importance capitale dans la lutte contre le VlH/SIDA.

Les rétrovirus

Les rétrovirus sont une famille de virus infectant les vertébrés. Ils se distinguent des autres virus entre autres par leur mode de réplication particulier. Ce sont des virus à ARN qui possèdent deux copies de leur génome. Ils codent pour une ADN polymérase ARN dépendante (la transcriptase inverse, RT) qui rétrotranscrit les brins d’ ARN en ADN viral qui pourra ainsi être intégré de façon définitive dans le génome de la cellule cible La famille des rétrovirus se divise en deux sous-familles, soit les orthoretrovirus et les spumaretrovirus. Le virus de l’immunodéficience humaine appartient au genre des lentivirus de la sous-famille des orthoretrovirus. Il existe deux types de VIH, soit le VIH-1 et le VIH-2. Le VIH-l est responsable de la pandémie mondiale alors que le VIH-2, qui est moins facilement transmissible, se limite plutôt à l’Afrique de l’Ouest

Structure

Ce sont des virus enveloppés d’une bicouche phospholipidique recouverte de protéines de surface (la glycoprotéine 120, gp 120) et transmembranaire (glycoprotéine 41, gp41). Cette enveloppe est acquise de la cellule productrice lors du bourgeonnement du virus et sa surface interne est recouverte d’une protéine structurale : la matrice (MA). Au sein de cette enveloppe se trouve le cœur viral, formé de la multimérisation de la protéine de la capside (CA) virale . Cet assemblage hexamèrique de la CA en cœurs viraux contient diverses enzymes associées: la RT, l’intégrase (IN) et la protéase (PR), ainsi que le génome viral entouré de protéines de nucléocapside .

Génome

Le génome des rétrovirus est encodé en deux copies identiques d’ARN simple brin de polarité positive. On y distingue trois gènes principaux qui codent pour des polyprotéines essentielles à la réplication des rétrovirus. Ce sont les gènes gag (group-specifie antigen), pro-pol (polymérase) et env (glycoprotéines d’enveloppe).
Ces trois gènes codent pour des précurseurs dont le clivage enzymatique permettra d’obtenir les protéines virales actives . Le génome complet est encastré entre deux régions nommées LTR (Long Terminal Repeat) qui renferment le promoteur (en 5 ‘) et le site de polyadénylation (en 3 ‘). Le génome des lentivirus code pour des protéines supplémentaires dites accessoires (pour le VIH-l : Vif, Vpr, Vpu, Tet, Rev, Tat et Nef) puisqu’elles permettent la régulation de diverses étapes de la réplication virale et de l’interaction avec les protéines de l’hôte.

Le cycle viral du VIH-l

Bien que les rétrovirus se répliquent selon le même cycle viral, certaines différences existent entre eux. Cette section est donc écrite en fonction du VIH-l afm d’explorer les particularités de ce virus, facilitant ainsi la compréhension du reste de l’ouvrage. On distinglle habituellement deux phases dans le cycle de réplication viral :
• La phase précoce allant de la fusion de la particule virale avec la membrane cellulaire jusqu’à l’intégration de l’ADN viral dans le génome cellulaire;
• La phase tardive allant de l’expression des protéines du provirus jusqu’au bourgeonnement des nouveaux virions.
Au début de la phase précoce, l’interaction entre la protéine virale de surface gp120 et le récepteur cellulaire CD4 induit un changement de conformation de gp120, permettant ainsi le recrutement du corécepteur cellulaire CCR5 (ou CXCR4 pour certaines souches virales). Le recrutement du corécepteur cellulaire entraîne d’autres changements conformationels importants qui mènent à l’attachement de la glycoprotéine transmembranaire de l’enveloppe, gp41 , à la membrane cellulaire. Grâce à ses deux régions homologues, la gp41 agit comme un ressort et son repliement sur elle-même mène à la fusion des deux membranes lipidiques, permettant ainsi le relargage du cœur viral dans le cytoplasme.

Transgènes de TRIM5a

Alors que la comparaison de la séquence d’un orthologue restrictif de TRIM5a avec celle de la protéine humaine a permis l’identification d’une mutation, deux approches différentes par mutagénèse aléatoire ont résulté en l’identification de deux autres de ces· mutations. Malgré le fait qu’elles proviennent de trois stratégies différentes, ces mutations sont situées au sein d’une même portion de la région variable 1 de TRIM5a (acides aminés 330 à 335). Récemment, des expériences de résonance magnétique nucléaire (NMR) ont permis d’affirmer que le domaine PRYSPRY de TRIM5a interagit par ses quatre régions variables avec la CA virale .
Or, de simples mutations ponctuelles dans la région vI permettent une restriction du VIH-I.  variables sans toutefois affecter le repliement de la protéine. Il est possible que le mécanisme par lequel TRIM5a reconnaît la capside virale, via un assemblage multimérique et de faibles interactions, puisse permettre à l’activité du facteur de restriction de résister à des mutations induisant des changements conformationels marqués. De plus, les mêmes travaux de NMR suggèrent que l’interaction PRYSPRY-CA est dominée par une région VI mobile, donnant ainsi une flexibilité au domaine PR YSPR y ce qui lui permet de s’adapter aux diverses conformations du cœur viral. Il n’est donc pas surprenant que des mutations ponctuelles dans cette région qui semble si importante induisent de tels changements sur le potentiel de restriction.

La résistance virale et le cas de CA-V86M

Transduction, virus réplicatif et TRIM5a :ce que nous apprend V86M

D’un point de vue pratique, il existe principalement deux stratégies différentes pour analyser la restriction de facteurs tels que TRIM5a. Afin de permettre une manipulation plus aisée et sécuritaire, et puisque TRIM5a agit aux étapes précoces du cycle de réplication, la plupart des expériences sont réalisées avec des souches nonréplicatives du VIH. Le génome de ces souches ne code pas pour l’enveloppe virale, laquelle est introduite sur un autre vecteur utilisé lors de la production des virions.
L’enveloppe naturelle du VIH, qui limite l’infection aux cellules exprimant CD4 et un corécepteur spécifique, est bien souvent remplacée par l’enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire (VSV) qui elle permet l’entrée du virus dans plusieurs types cellulaires. Utilisant un tel virus modifié, l’analyse de la restriction par TRIM5a se fait alors en observant la diminution du nombre de cellules infectées dans l’échantillon. La deuxième stratégie, qui reflète un peu plus la réalité du virus, utilise un génome viral complet. Ces virus seront donc réplicatifs et l’analyse de la restriction par TRIM5a se fera indirectement en mesurant la quantité de virus produits par ces cellules.

La résistance virale dans un contexte clinique

Il est également important de reconnaître et d’évaluer la signification d’une mutation de résistance isolée in vitro sur l’efficacité potentielle des traitements thérapeutiques qui découleraient d’une utilisation de TRIMa. Premièrement, nous n’avons pas observé de réplication accrue du virus V86M dans un contexte réplicatif en présence des transgènes de TRIM5a, ce qui tend à diminuer l’impact clinique qu’aurait cette mutation. De plus, le contexte clinique est de plusieurs ordres de grandeur plus complexe, faisant intervenir les fonctions immunes du patient et les drogues antirétrovirales qui seraient toujours utilisées. La probabilité de voir resurgir une telle mutation résistante à TRIM5a en est donc d’autant réduite. Néanmoins, il ne faut pas sous-estimer le potentiel mutagénique du virus, alors que l’une des principales causes de l’échec des traitements actuels est la résistance virale.

Thérapie génique: implications des résultats obtenus et perspectives

Transgènes de TRIM5a : leur potentiel clinique

Sans expériences concrètes, l’étude des transgènes de TRIM5a dans un contexte clinique n’est que spéculative. Cependant, puisque TRIM5a agit aux étapes précoces de la réplication virale il réduit donc dramatiquement les niveaux de transcrits viraux produits. La synthèse des nouvelles protéines virales en est donc réduite et le risque de voir surgir une mutation de résistance est faible. De plus, la thérapie génique vise à repeupler le patient de cellules immunitaires résistantes au virus, rétablissant ainsi les fonctions immunes. S’il demeure actif, le système immunitaire est capable de bâtir une forte réponse contre le virus. En effet, plusieurs études ont présenté des données suggérant que les anticorps neutralisants et la réponse cytotoxique dépendante des anticorps exercent une forte pression sélective sur le virus.Combinée à la restriction par un transgène de TRIM5a, il est probable que le potentiel qu’aurait le virus d’échapper à toutes ces pressions simultanées soit dramatiquement réduit.

Table des matières

CHAPITRE 1 :INTRODUCTION
1.1 Problématique
1.1.1 L’épidémie du VIH/SIDA
1.1.2 Un traitement alternatif au VIH/SIDA : une réelle nécessité
1.1.3 Le cas du « patient de Berlin»
1.1.4 La thérapie génique
1.2 Les rétrovirus
1.2.1 Définition
1.2.2 Structure
1.2.3 Génome
1.2.4 Le cycle viral du VIH-l
1.2.5 La pandémie de VIH : pandémie divisée en groupes et sous-groupes
1.3 Le facteur de restriction TRIM5a
1.3.1 Historique
1.3.2 Structure
1.3.3 Spécificité d’action
1.3.4 Mécanisme d’action
1.3.5 Régulation de l’expression de TRIM5a et autres facteurs de restriction
1.3.6 La cyclophiline A
1.3.7 Des mutants de la protéine TRIM5 a humaine actifs contre le VIH -1
1.3.8 TRIM5a: transgène potentiel pour thérapie génique ?
CHAPITRE II :A NOVEL AMINOACID DETERMINANT OF HIV-l RESTRICTION IN THE TRIM5A VARIABLE 1 REGION ISOLATED IN A RANDOM MUTAGENIC SCREEN
Résumé
Abstract
Introduction
Material and Methods
Plasmid DNAs
Cells and retroviral vectors production
Library construction and screening
Site-directed mutagenesis
Viral challenges
HIV-1 CA-NC expression and purification
In vitro assembly of HIV-1 CA-NC complexes and binding to TRIM5a variants
Structural models ofthe PRYSPRY domain
Results
A v1-focused mutagenic screen
Effect of alternative mutations at Gly330
Combining G330E with mutations at Arg332 or Arg335 .
In vitro binding analysis
Restriction in other viral and cellular environments
Restriction of a propagating infectîon
Modelling the effect of v 1 mutations on the TRIM5aHu PRYSPR y domain
Discussion
Conclusion
Acknowledgements 
References
CHAPITRE III : THE V86M MUTATION IN HIV-l CAPSID CONFERS RESISTANCE TO TRIM5A BY ABROGATION OF CYCLOpmLIN A-DEPENDENT RESTRICTION AND ENHANCEMENT OF VIRAL NUCLEAR IMPORT
Résumé
Abstract 
Background
Results
CA-V86M HIV-l is partially resistant to restriction by TRIM5aHu mutant R332G-R335G
Restriction of V86M CA HIV-l by R332G-R335G TRIM5aHu is independent of cyc10philin A
CsA concentration-dependent assays
The sensitivity of HIV -1 restriction by TRIM5aHu mutants to the V86M mutation correlates with its sensitivity to CsA treatment
Restriction ofV86M CA HIV-l by R332G-R335G TRIM5aHu in cat cells is insensitive to CsA
V86M CA interactions with CypA studied by NMR
Effects ofV86M on early stages of viral replication
Effect of CypA and V86M on a spreading HIV -1 infection
Discussion
Acknowledgements
Methods
Plasmid DNAs
Cells
Retroviral vectors production
RNA interference
Viral challenges
Quantitative real-time PCR ofHIV-l DNA.
Statistical analyses
2DH1N15 Heteronuc1ear (ZZ) Exchange Spectroscopy
References.
Supplementary data
CHAPITRE IV :RESTRICTION OF A DIVERSE PANEL OF HIV-l CLINICAL ISOLATES BY A MUTA TED RUMAN TRIM5a
Résumé
Abstract 
Introduction
Results
Discussion
Materials and Methods
Plasmids DNAs
Celllines
Retroviral vectors production
Viral challenges and measurement of sensitivity to TRIM5a
Phylogenetic tree analysis
Protein sequence alignment
Conclusions
Acknowledgements
References
CHAPITRE V :DISCUSSION ET PERSPECTIVES
5.1 L’identification de transgènes aux propriétés antivirales
5.1.1 Transgènes de TRIM5a
5.1.2 Transgènes d’autres facteurs de restriction
5.1.3 D’autres candidats se cachent dans le génome
5.2 La résistance virale et le cas de CA-V86M
5.2.1 Transduction, virus réplicatif et TRIM5a: ce que nous apprend V86M
5.2.2 La résistance virale dans un contexte clinique
5.3 Thérapie génique: implications des résultats obtenus et perspectives
5.3.1 Transgènes de TRIM5a : leur potentiel clinique
5.4 Perspectives générales 
CONCLUSION

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