Soutenance mémoire
Évolution et traitement
L’évolution et la sévérité de l’atteinte sont très variables. La moitié des patients connait une régression de la maladie dans les deux ans, alors qu’après cinq ans une rémission est peu probable (2). On définit ainsi les formes aigues de sarcoïdose < 2 ans et les formes chroniques > 3-5 ans. Un suivi trimestriel ou semestriel est nécessaire dans les formes chroniques afin de détecter précocement les localisations qui pourront menacer le pronostic vital. Les patients rechutent le plus souvent dans les 2 à 6 mois suivant l’interruption du traitement et exceptionnellement après 3 ans de recul sans traitement. La guérison de la maladie est définie par une rémission stable en dehors de tout traitement pendant 3 ans. Le pronostic de la sarcoïdose est bon dans 80% des cas avec ou sans traitement. Dix à vingt pourcents des patients vont garder des séquelles et 1-5% des patients vont décéder de leur sarcoïdose.
La plupart des patients atteints ne sont pas handicapés par leur maladie, il ne convient alors pas d’introduire un traitement. Lorsqu’il est jugé nécessaire, la pierre angulaire du traitement est l’utilisation de glucocorticoïdes (24), leur introduction est généralement inévitable lorsque la fonction de l’organe atteint est menacée (4). Des agents immunosuppresseurs et cytotoxiques sont également utilisés dans de rares cas (4,25) mais leur toxicité fait tendre la balance bénéfice/risque en leur défaveur.
Neurosarcoïdose
Épidémiologie
Les manifestations neurologiques de la sarcoïdose ont pour la première fois été décrites en 1909 par Heerfordt qui associait des paralysies faciales à la sarcoïdose (26). Plusieurs cas sont individuellement publiés durant le XXe siècle puis inclus dans des séries permettant de dresser le panorama des atteintes retrouvées dans la neurosarcoïdose. Cette forme particulière est souvent révélatrice de la sarcoïdose systémique sous-jacente (70% des cas) et peut constituer son unique localisation (20%)(27), l’âge médian de découverte serait plus élevé (environ 40 ans), suggérant la possibilité qu’une sarcoïdose jusque-là passée inaperçue se révèle par la survenue de signes neurologiques.
Clinique
L’ensemble du système nerveux central (SNC) et périphérique peut être touché, mêmesi le SNC en représente une large majorité (85%). On peut dégager l’atteinte des nerfs crâniens (50-75%) et la méningite aseptique (10-20%) comme étant les manifestatio ns les plus fréquentes (Tableau 2)(28). Il est à noter qu’un tiers voire la moitié des patientsdéveloppent plus d’une manifestation neurologique de leur pathologie (28).
Une hypertension intracrânienne peut survenir et est alors à considérer comme un signe de gravité. La neurosarcoïdose doit être évoquée devant des céphalées ne cédant pas aux antalgiques de palier I, des nausées ou vomissements, un œdème papillaire ou une hyperprotéinorachie disproportionnée. Le tableau clinique dépend essentiellement de la localisation des granulomes, pouvant alors donner des troubles moteurs, sensitifs, psychiatriques ou encore hormonaux.
Évolution
L’évolution et le pronostic des patients touchés par la neurosarcoïdose varient mais peuvent être anticipés dans leurs grandes lignes. Deux tiers des patients ne connaitront qu’un seul épisode de leur manifestation neurologique, le plus souvent une neuropathie des nerfs crâniens ou une méningite aseptique, le reste fera face à une forme chronique, récidivante ou récurrente. Il s’agit alors plus d’atteintes parenchymateuses du SNC, d’hydrocéphalie ou d’atteintes multiples des nerfs crâniens. La mortalité survient majoritairement chez les patients avec une forme parenchymateuse ou une hydrocéphalie, de par le phénomène inflammatoire luimême ou à cause des complications thérapeutiques, elle serait de 5 à 10 % (29,34).
L’évolution sans traitement de la neurosarcoïdose n’a pas été déterminée du fait de la mise systématique des patients sous corticoïdes ou immunosuppresseurs. Mais bien que le traitement soit toujours bénéfique à court terme, son impact dans le temps est à relativiser, même si l’inflammation peut être spontanément résolutive, certains patients souffrant de formes progressives ou récidivantes se voient sévèrement handicapés malgré un traitement agressif.
Diagnostic
Le diagnostic se présente sous deux cas de figure de fréquences égales. Soit un patient sans sarcoïdose connue se présente avec des signes orientant vers une neurosarcoïdose, le but va alors être de mettre en évidence la sarcoïdose systémique sous-jacente. Soit la sarcoïdose est déjà connue, il faudra alors s’assurer que les signes neurologiques sont bien dus à une neurosarcoïdose et non pas à une autre pathologie évoluant en parallèle de la sarcoïdose. La difficulté d’accès du tissu nerveux à la biopsie et la fréquente unicité des granulomes rendent le diagnostic particulièrement compliqué de par le peu de recours possible à l’anatomopathologie.
D’après une classification de Zajicek et al en 1999, reprise par la suite, une neurosarcoïdose « prouvée » se caractérise par une mise en évidence de structuresgranulomateuses au niveau du système nerveux, le diagnostic est « probable » si une atteinte neurologique est associée à la présence de granulomes dans d’autres organes et « possible » si ces conditions ne sont pas remplies (Tableau 3)(37).
Marqueurs biologiques
Du point de vue biologique, si le diagnostic de sarcoïdose systémique n’a pas été posé il est important de réaliser les examens et de rechercher les anomalies mentionnées précédemment. Pour le diagnostic spécifique de neurosarcoïdose, l’analyse du LCR se révèle intéressante puisque plus de 50% des patients présenteront des anomalies biologiques du LCR (29). Elles incluent une augmentation de la pression du LCR, une hyperprotéinorachie, une hypoglycorachie et une hypercellularité à prédominance mononuclée jusqu’à plusieurs centaines de cellules par microlitre. On note chez certains patients la présence de bandes oligoclonales à l’isoélectrofocalisation ou une augmentation de l’index IgG montrant une synthèse intrathécale. En parallèle, il est recommandé de réaliser les examens suivants sur la ponction lombaire : recherches bactériologiques (avec recherche de mycobactéries), virologiques voire parasitologiques de routine ainsi qu’une étude des cellules en cytométrie en flux.
Le dosage de l’activité de l’ECA dans le LCR constitue un examen plus ciblé bien que relativement peu sensible et spécifique. La sensibilité du dosage serait de 50% mais varie largement en fonction des études (27,38,39), une cause possible de ces variations pourrait être la mise sous traitement corticoïde ou non des patients. Il est également possible que l’élévation du taux d’ECA suive le développement clinique de la neurosarcoïdose, en outre, plus l’invasion du SNC par des granulomes ou des lésions sarcoïdiennes serait importante, plus le taux d’ECA dans le LCR serait élevé (40). La rareté des cas avérés de neurosarcoïdose rend compliquées les études de grande échelle sur la fiabilité du dosage. Certaines études de petite à moyenne envergure se contredisent quant à la spécificité de l’ECA dans le LCR (41–44).
Néanmoins, tous les auteurs se rejoignent sur sa faible spécificité, notamment en raison de taux élevés d’ECA dans le LCR retrouvés dans les méningites, certaines tumeurs cérébrales, la maladie de Behçet ou le syndrome de Guillain-Barré (41). En somme, une activité ECA non pathologique dans le LCR n’exclut pas une neurosarcoïdose, de plus la portée diagnostique de l’analyse est limitée du fait de manque de standardisation du dosage et de la mise en place de valeurs usuelles consensuelles. Se rajoutent également les dissensions quant à l’interprétation d’un taux qui serait jugé pathologique notamment sur l’indexation ou non de l’ECA sur la protéinorachie pour compenser un phénomène de transsudation des protéines sériques, il ne serait pas recommandé d’indexer le taux d’ECA sur celui des protéines dans le LCR mais une hyperprotéinorachie serait à prendre en compte (41). D’autres études n’ont pas retrouvé de corrélation entre l’activité de l’ECA dans le LCR et celle du sérum, l’albuminorachie ou les IgG du LCR (41,45).
Imagerie
Comme dans la sarcoïdose systémique, l’imagerie a une place significative dans le diagnostic de neurosarcoïdose, en particulier l’IRM avec injection de gadolinium (46,47), permettant de mettre en évidence les atteintes de la barrière hématoencéphalique et les zones inflammatoires actives. Ce qui fait de l’IRM un outil particulièrement adapté est sa maniabilité pour obtenir des coupes dans les plans et la qualité de contraste sur les tissus mous. Un signal IRM se définit par son temps de répétition (TR) correspondant à l’intervalle entre deux excitations, et son temps d’écho (TE), le temps entre l’excitation et la survenue du signal IRM. Une séquence IRM est un ensemble d’impulsions excitatrices dont les paramètres (TE, TR) sont ajustés pour obtenir des images ayant un contraste donné (T1 ou T2 par exemple).. Fréquemment on retrouve dans la neurosarcoïdose une prise de contraste leptoméningée évocatrice lorsqu’elle présente un aspect micronodulaire confluent (Figure 8).
Les nerfs crâniens peuvent apparaître épaissis ou réhaussés, les nerfs optiques augmentés de taille en hypersignal FLAIR (FLuid Attenuated Inversion Recovery), technique basée sur l’inversion-récupération, le signal provenant du LCR est supprimé et un long TE est donné afin de donner à l’image une forte pondération T2 (49). Au niveau médullaire l’IRM peut montrer des prises de contraste des méninges et/ou unhypersignal intramédullaire généralement étendu sur plusieurs étages vertébrauxpermettant de faire la différence avec d’autres pathologies démyélinisantes où l’hypersignal ne s’étend que sur moins d’un corps vertébral (27).
L’enzyme de conversion de l’angiotensine I
Système rénine-angiotensine-aldostérone
De par une action conjuguée sur les vaisseaux, les reins et le cœur, le système rénineangiotensine est l’un des principaux régulateurs de l’homéostasie hydrosodée et de la pression artérielle (53). Il comprend deux enzymes qui agissent de manière successive, d’abord la rénine, synthétisée par l’appareil juxta-glomérulaire en réponse aux variations de la volémie (54). Elle produit au niveau sanguin l’angiotensine I (décapeptide) à partir de l’angiotensinogène, un glycopeptide d’origine hépatique (55).
Rôles physiologiques
Outre son action sur l’angiotensine I, l’ECA est également capable de cliver le dipeptide en C-terminal de la bradykinine, empêchant son action vasodilatatrice (58).
L’ECA, et plus particulièrement son inhibition médicamenteuse, est aussi suspectée de jouer un rôle dans le développement de la maladie d’Alzheimer de par la dégradation du peptide b amyloïde, composant principal des plaques amyloïdes (59). Bien qu’elle soit produite au niveau de tout le tissu endothélial, on la retrouve particulièrement au niveau des capillaires pulmonaires, des cellules épithéliales rénales, intestinales et épididymaires. La régulation de l’enzyme au niveau endothélial est mal connue, bien que son activité reste relativement constante, plusieurs composés hormonaux ou médicamenteux mis en évidence in vitro en favoriseraient la production. On peut citer la déxaméthasone (60), l’endothéline-I (61) ou le peptide atrial natriurétique (62).
Structure
L’ECA est une métalloenzyme ayant une fonction carboxy-dipeptidase, monomérique, transmembranaire, zinc et chlore dépendante (63), décrite pour la première fois en 1956 de par son rôle sur la tension artérielle (64). Chez l’humain, on la rencontre sous deux formes distinctes : la forme somatique abondante au niveau de l’endothélium vasculaire, et la forme testiculaire exclusive aux cellules germinales. Les deux formes diffèrent principalement au niveau du nombre et de la structure de leurs sites catalytiques (56). Plus récemment, un homologue de l’ECA nommé ECA2 a été identifié et décrit comme ayant un rôle important dans la régulation cardiaque (65). L’ECA somatique (qui est désignée ici comme « l’ECA ») est codée par un gène unique de 21 kpb situé sur le chromosome 17q23 comprenant 26 exons et 25 introns. Elle se compose de 1 306 acides aminés (aa) pour un poids moléculaire de 140-170 kDa (66).
En partant de l’extrémité C-terminale elle comprend un domaine cytosolique de 28 aa, un domaine hydrophobe transmembranaire de 22 aa et un domaine extracellulaire de 1 227 aa fortement glycosylé (Figure 12). La partie extracellulaire est divisée en deux domaines homologues, le premier en N-terminal fait 612 aa est relié au second de 600 aa par une séquence de 15 aa. Chacun de ces deux domaines extracellulaires comprend une séquence HEXXH (H = histidine, E = acide glutamique et X n’importe quel acide aminé, séquence consensuelle à toutes les enzymes à zinc) dans laquelle les deux histidines servent de ligand à un atome de zinc. Elles forment, avec une glutamine située 23 aa au-delà vers le côté C-terminal et une molécule d’eau, le site catalytique de forme tétraédrique (63). Chacun des deux domaines exerce une action catalytique (67) et bien que hautement homologues, ils sont suffisamment différents pour exercer une action différente en fonction du substrat. Bien que l’affinité des deux sites pour l’angiotensine I soit la même, le domaine en C-terminal l’hydrolyse plus efficacement in vitro ou in vivo (66). La spécificité de chaque domaine pour un substrat donné se fait notamment en fonction de leur dépendance au chlore (66).
La localisation extracellulaire de l’ECA sur les cellules endothéliales rend son interaction avec son substrat, l’angiotensine I, idéale. Il a été montré qu’un seul passage du sang au travers du système vasculaire pulmonaire permettait la conversion de tout l’angiotensine I circulant (68).
Méthodes de dosage
Dans le sérum
Plusieurs méthodes ont été développées pour le dosage de l’ECA, d’abord dans des tissus de modèles animaux, puis dans le sérum humain. On peut citer la spectrophotométrie, qui en a permis l’automatisation (71,72), la fluorimétrie (73), la chromatographie liquide haute performance (HPLC), la radiométrie (74) et l’analyse radio-immunologique (75). Chacune de ces méthodes rencontre un ou plusieurs inconvénients majeurs (laborieuse, peu sensible, rencontrant des interférences analytiques ou difficile à automatiser)(76). Néanmoins, elles se basent presque toutes sur un principe commun : l’ECA hydrolyse un substrat dont un des résidus devient détectable et quantifiable. Les efforts ont donc été axés sur le développement de substrats très spécifiques à l’ECA, détectables par des techniques simples, rapides et automatisables. Actuellement la détermination de l’activité de l’ECA sérique en routine dans les laboratoires s’effectue en spectrophotométrie à partir de substrats artificiels commercialisés sous forme de kits à installer sur des automates compatibles. Parmi ces substrats on peut citer l’hippuryl-histidileucine (HHL) et le furylacroloylphénylalanyl-glycyl glycine (FAPGG). L’Abz-FRK(dnp)P-OH trifluoroacetate (Abz = acide ortho-aminobenzoïque, FRK = phenylalaline, arginine et lysine, dnp = 2,4-dinitrophenyl) est un substrat synthétique développé en 2005 (76) qui est actuellement utilisé au Centre Hospitalier Universitaire de Caen dans le laboratoire de Biochimie et sera employé ici. L’activité est exprimée en Unité Internationale qui correspond à l’hydrolyse d’une micromole de substrat par minute.
Dans le LCR
Physiologiquement, la faible quantité d’ECA retrouvée dans le LCR proviendrait d’un détachement des plexus choroïdes (41). En 1984, Schweifurst et al. proposent une méthode de dosage par fluorimètrie de l’ECA dans le LCR, les techniques classiques de spectrophotométrie utilisées dans le sérum où l’enzyme est beaucoup plus concentrée ne sont pas assez sensibles pour des taux aussi faibles que ceux du LCR.
La linéarité de l’essai est bonne mais il n’est pas fait mention de la sensibilité ou de la spécificité, de plus la technique requière d’assez nombreuses étapes, une incubation de 60 minutes et ne permet pas la lecture simultanée de plusieurs échantillons (essai de fluorimétrie en cuve)(77).
À la fin des années 1990, Baudin et al. ont développé une méthode de dosage radiométrique à l’hôpital Saint-Antoine à Paris. Le substrat HHL (hippuryl-histidineleucine) est marqué au 14C ( 14C-HHL) puis hydrolysé par l’ECA dans des conditions de vitesse initiale de Michaelis Menten. Un résidu hippurate marqué est libéré puis compté en scintillation liquide après extraction par l’acétate d’éthyl. Du point de vue analytique, le seuil de détection est à 0,04 U/l et la sensibilité proche, à 0,06 U/l. Le domaine de mesure va de 0,5 à 5 U/l et couvre toutes les valeurs rencontrées dans des LCR sains et pathologiques. La linéarité sur ce domaine est obtenue pour une durée d’incubation de 60 minutes, nécessaire à l’hydrolyse complète du substrat. Bien qu’analytiquement performante, cette technique nécessite une installation de radiométrie conséquente avec un système d’élimination de déchets chauds complexe et onéreux.
Répétabilité
Elle consiste à analyser plusieurs fois un même échantillon dans des conditions identiques dans un délai le plus court possible (81). Elle a été effectuée à partir d’un pool de LCR ainsi que des contrôles commerciaux haut et bas, chacun au sein d’une même série. Comme précisé précédemment le nombre d’échantillons pouvant être inclus dans une série est limité à 10. Afin d’avoir la meilleure visibilité possible sur la performance, l’approche en triplicate a été écartée et chaque puits a été considéré individuellement. Les CV obtenus sont tous inférieurs à 20%, limite généralement utilisée pour les techniques non automatisées (Tableau 6)(81).
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Table des matières
Liste des abréviations
Table des Figures
Table des Tableaux
Introduction
1) Sarcoïdose
a) Épidémiologie
b) Physiopathologie
c) Diagnostic clinique, radiologique et biologique
d) Évolution et traitement
2) Neurosarcoïdose
a) Épidémiologie
b) Clinique
c) Évolution
d) Diagnostic
e) Marqueurs biologiques
f) Imagerie
g) Traitements
3) L’enzyme de conversion de l’angiotensine I
a) Système rénine-angiotensine-aldostérone
b) Rôles physiologiques
c) Structure
d) Mécanisme
e) Méthodes de dosage
4) Le processus qualité
a) La démarche qualité en France
b) Vérification et validation de méthode
5) Objectifs
Matériel et Méthodes
1) Matériel et réactifs
a) Réactifs
b) Spectrofluorimétrie
2) Mise au point de la méthode
a) Principe de la mesure
b) Gamme de calibration
c) Détermination de l’activité
d) Contrôles
3) Protocole
a) Phase pré-analytique
b) Préparation des réactifs
c) Préparation de la plaque
d) Lecture
e) Analyse
4) Essais
Résultats
1) Détermination de la phase stationnaire
2) Répétabilité
3) Reproductibilité
4) Variabilité inter-opérateurs
5) Incertitudes de mesure
6) Étendue de mesure
a) Limite de détection
b) Limite de quantification et linéarité
7) Valeurs de référence
8) Comparaison de méthodes
9) Interférences et spécificité analytique
10) Contamination
11) Robustesse et stabilité des réactifs
a) Tampon
b) Substrat
c) Stabilité des échantillons de LCR congelés à -20°C
Discussion
1) Dossier de validation de méthode
a) Répétabilité
b) Reproductibilité
c) Variabilité inter-opérateurs
d) Incertitudes de mesure
e) Étendue de mesure
f) Valeurs de référence
g) Comparaison de méthode
h) Interférences et spécificités pré-analytique et analytique
i) Contamination
j) Robustesse et stabilité des réactifs
2) Application en routine
a) Technique
b) Validation biologique
c) Interprétation des résultats
3) Échanges inter-laboratoires
4) Perspectives
Conclusion
Bibliographie
Annexes
Annexe 1 : Fiche technique
Annexe 2 : Exemple d’un fichier de calcul des résultats
Annexe 3 : Formulaire SH-Form 43
Annexe 4 : Quizz d’habilitation technicien
