L’ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE OU PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS  (PFGE)

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Peptidoglycane (ou Muréine)

Il s’agit d’une macromolécule réticulée composée de longues chaînes glycaniques qui sont des copolymères alternés de N- acétyl glucosamine et d’acide N- acétyl-muramique. Des tétrapeptides sont branchés sur ces chaînes et une structure en réseau est constituée grâce à l’existence de ponts peptides entre les tétrapeptides.
La synthèse du peptidoglycane peut se décomposer en trois phases : les précurseurs du peptidoglycane sont synthétisés dans le cytoplasme, ils traversent ensuite la membrane cytoplasmique puis ils ont polymérisé à l’extérieur. Au cours de la dernière étape, il y a d’abord formation de liaisons osidiques entre les disaccharides ou réaction de transglyco-sylation; ensuite des réactions de transpeptidation réalisent des ponts interpéptides, assurant ainsi la réticulation du peptidoglycane, les différentes réactions sont réalisées par des enzymes de transglyco-sylation et de transpeptidation appelées PLP (Protéines Liants les Pénicillines) [125, 167].
Ce sont en effet les cibles des -lactamines, elles sont universellement présentes chez les bactéries et se situent à la face externe de la membrane cytoplasmique, leur nombre et leur spécificité variant en fonction des genres et espèces. Chez E.coli, espèce la plus étudiée, elles sont au nombre de sept : 1a, 1b, 2, 3, 4, 5, et 6. Les PLP de haut poids moléculaire sont habituellement des enzymes bifonctionnelles (transglycosylases et transpeptidase). La fonction enzymatique précise de chacune des PLP a été étudiée en détail chez E.coli. Chaque PLP de haut poids moléculaire (PLP 1a, 1b, 2 et 3) semble avoir une fonction spécifique : les PLP 1a et 1b interviendraient dans l’élongation de la cellule, la PLP 2 serait impliquée dans le maintien de la morphologie globale de la bactérie, alors que la PLP 3 participerait à la formation du septum au cours de la division cellulaire [125, 167].
Les PLP de bas poids moléculaire (PLP 4, 5 et 6) ne semblent pas catalyser de réaction de transpeptidation et ne sont pas impliquées de façon prépondérante dans l’effet antibactérien des -lactamines. Ces enzymes ont un rôle dans le remaniement du peptidoglycane, notamment au cours de la division cellulaire [112].

Membrane externe

La membrane externe constitue un modèle d’adaptation à l’environnement, protégeant la bactérie des agressions extérieures physiques, chimiques ou biologiques. Elle est à l’interface entre le milieu extérieur et la bactérie. Elle joue le rôle de barrière vis-à-vis des sels biliaires, des enzymes du tube digestif ainsi que des métaux lourds et des détergents. Elle organise également le passage des substrats nécessaires à la survie et à la croissance de la bactérie. Elle est aussi le support de structures comme les fimbriaes, les adhésines et la capsule, qui interviennent dans la pathogénicité de la bactérie.
La composition lipidique de ce double feuillet est asymétrique (Figure 3) : les phospholipides, analogues à ceux de la membrane cytoplasmique, occupent la face interne, tandis que le lipopolysaccharide (LPS) constitue l’essentiel de la face externe. Les chaînes polysaccharidiques composant la partie externe hydrophile du LPS établissent entre elles des liaisons électrostatiques grâce à des cations métalliques divalents (Mg2+, Ca2+) qui ordonnent la couche externe de la bactérie et la rendent peu perméable [102].
La composition protéique de la membrane externe peut se résumer en deux catégories:
Des protéines de rôle structural, comme la lipoprotéine de Braun et la protéine OmpA, qui interagissent avec le peptidoglycane, principal composant du périplasme qui donne à la bactérie sa forme et maintient son intégrité face aux variations environnementales. Elles participent ainsi à la cohésion structurale de l’enveloppe bactérienne.
Des protéines de transport comme les protéines spécifiques énergie-dépendantes, les transporteurs spécifiques, les transporteurs non spécifiques.
Les protéines spécifiques, énergie-dépendantes ont une fonction qui nécessite l’apport d’énergie via la protéine TonB, transductrice d’énergie [96]. On peut citer parmi ces transporteurs : BtuB pour la vitamine B12, FepA ou FhuA, par exemple, pour les sidérophores.
Les transporteurs spécifiques (transport préférentiel) ont un site de fixation pour certains ligands, modulant la diffusion de ceux-ci. On connaît sur ce modèle : Tsx pour les nucléosides, SrcY pour le saccharose ou encore LamB (récepteur du phage lambda) pour le maltose et les maltodextrines, qui est la mieux connue [158].
Les transporteurs non spécifiques, communément appelés « porines » assurent la diffusion passive. E.coli K12 exprime dans les conditions biologiques courantes en particulier celles du tube digestif de l’homme deux porines OmpF et OmpC [102, 133] dont la quantité relative dépend des conditions de croissance: osmolarité, température et sources de carbone. Dans des conditions limitantes en phosphate, la bactérie exprime également une porine ayant une affinité pour celui-ci: la phosphoporine, PhoE.

Les porines

Ce sont des protéines assemblées en trimères; chaque monomère organise un pore hydrophile dans la membrane externe des bactéries à Gram-négatif, qui permet aux solutés d’un poids moléculaire de 600 daltons environ de diffuser. Les porines sont présentes au nombre de 105 copies par cellule, ont un poids moléculaire de 35 à 40 kda, et sont fortement associées au peptidoglycane et au LPS (Figure 3). Cette quantité élevée se traduit par une concentration importante de canaux dans la membrane externe et explique la nécessité d’une régulation efficace de leur expression [132].

Structure des porines

A partir des années 90, la résolution des structures de porines a permis de localiser un certain nombre de régions importantes pour l’insertion dans la membrane, la structure et la fonction et ainsi de comprendre l’effet des mutants d’E.coli isolés au cours des années précédentes. A côté de ces approches de cristallisation éclairant la structure, l’utilisation de techniques de gonflement de liposomes a permis d’évaluer la diffusion des sucres à travers les porines, plus récemment, c’est le développement des mesures, d’électrochimie en bicouche lipidique, définissant les caractéristiques électriques du pore, qui ont apporté les paramètres indispensables de mesure de l’activité [52, 154].
Structure primaire et secondaire :
Les séquences des porines OmpF, OmpC et PhoE d’E.coli montrent une homologie stricte de plus de 50% dans leur séquence en acides aminés: on peut noter 77% de conservation entre les gènes d’ompF et phoE et 63% entre leurs produits. Tout comme la structure de la porine de Rhodobacter capsulatus (résolue à 1,8 Å par cristallographie aux rayons X), première structure résolue du genre, la structure d’un monomère d’OmpF s’organise en 16 feuillets antiparallèles, reliés par des boucles de taille variable (Figure 4) [38, 91, 155, 180].

Fonctions des porines

La fonction des porines est d’assurer la diffusion, à travers la membrane externe, des petits solutés hydrophiles indispensables à la vie et à la croissance de la bactérie [14]. La vitesse de diffusion d’un soluté dépend de sa taille, de son hydrophilie et de sa charge : elle sera d’autant plus élevée qu’il est petit et hydrophile. L’effet de sa charge dépend du type de porine impliquée : OmpF et OmpC ont en effet une sélectivité cationique, et PhoE une spécificité anionique [22].
Cette sélectivité est liée aux charges présentes dans la zone de constriction, au potentiel électrostatique engendré dans cette zone et au niveau de l’embouchure du canal.
Afin de mieux comprendre la sélectivité de ces transporteurs, OmpF et PhoE sont aujourd’hui utilisées comme modèles et comparées. Il apparaît qu’OmpF montre des potentiels électriques de 10 mV/nm à l’entrée du canal et 200 mV/nm dans la zone de constriction. Les deux types de porines présentent une dépendance au voltage au-delà d’un certain potentiel seuil, le canal se ferme, de plus ce phénomène est asymétrique, dépendant du sens d’application du courant.
Les porines assurent aussi d’autres fonctions : elles servent en effet de récepteurs aux bactériophages (TC 45 pour PhoE, Tul a pour OmpF, Tul b pour OmpC) et aux colicines. Les porines jouent aussi un rôle clé dans la pénétration des -lactamines; ces petites molécules (300-600 daltons), chargées et hydrophiles utilisent la porine comme voie de pénétration [76, 128].

Régulation de l’expression des porines

Les entérobactéries peuvent se développer dans des conditions environnementales très différentes en pH, osmolarité, température, nutriments… Pour la bactérie, ces variations se traduisent par une contrainte ou une sélection sur les composants de l’enveloppe qui vont assurer sa survie et sa croissance. Un des processus physiologiques les plus importants qualitativement et quantitativement associé à l’enveloppe est le contrôle de l’imperméabilité et plus précisément la mise en place des systèmes de diffusion passive assurant l’entrée des nutriments, c’est les porines non spécifiques [52, 127, 129, 155].
La présence simultanée des deux porines OmpF et OmpC dans la membrane de E.coli a posé le problème de leur régulation et leur rôle. OmpF est décrite comme la porine la plus efficace avec un diamètre plus important [129] assurant donc l’approvisionnement de la bactérie en condition de carence à l’opposé la diffusion est plus réstrictive via OmpC qui possède un diamètre plus restreint.
Après analyse des propriétés physico-chimiques du canal membranaire et la résolution de la structure tridimensionnelle (3D) [155], la conservation de ces molécules peut s’expliquer par une stratégie bactérienne de régulation afin de contrôler rigoureusement et précisément la diffusion des éléments indispensables, sucres, sels… ou dangereux, acides, détergents… pour la cellule à travers la barrière membranaire dans le cas des porines [132].
Différentes étapes interviennent pour assurer la réponse à ces stimulis, et réguler l’expression des porines adaptées à ces conditions du milieu. Au cours de ces processus interviennent :
– des senseurs qui sont sensibles au milieu exterieur
– des effecteurs qui sont modifiés directement par le signal reçu des senseurs, ou modifiés indirectement via l’action de transmetteurs/ transducteurs et qui modulent l’expression des gènes et qui sont :
 EnvZ- OmpR :
Pour les porines non spécifiques, la régulation la plus étudiée concerne le système d’osmorégulation : un système à deux composants, EnvZ- OmpR, qui intervient au niveau de la transcription et gouverne l’expression des porines [118, 142].
EnvZ est une protéine agissant comme un senseur membranaire qui détecte les variations de l’osmolarité externe (peut être via le MDO, un oligo-saccharide périplasmique qui pourrait jouer un rôle de piège à ions et de tampons). Cette protéine sous l’action du signal, transmet l’information, par phosphorylation du régulateur, OmpR.
OmpR phosphorylé présente une affinité élevée pour des sites à haute et basse affinité, situés dans la région promotrice des gènes ompC et ompF. A faible osmolarité, peu de OmpR est phosphorylé : il se fixe préférentiellement sur les sites de forte affinité activant la transcription de ompF. Une phosphorylation importante de OmpR se produit à forte osmolarité, ces molécules se lient aux deux types de sites et bloquent ainsi la transcription de ompF favorisant celle de ompC
(Figure7).
 IHF :
IHF est une protéine similaire aux histones : affine pour certains sites de l’ADN, elle joue un rôle clé dans la régulation de la réplication, la transcription et la recombinaison spécifique. Certains de ces sites présents en aval des gènes ompC, ompFet envZ/ ompR.
IHF facilite ainsi la répression de la transcription de ompF par OmpR-P alors qu’elle semble faiblement agir sur celle de ompC [142].
 micF :
micF( mRNA Interfering Complementary RNA), est un petit ARN anti-sens [118, 142] localisé en amont du gène ompC et transcrit dans la direction opposée et présente un autre aspect de la régulation des porines ; par la température. L’existance de deux promoteurs en tandem génère deux espèces d’ARN (4,5 S et 6 S) contenant des séquences complémentaires de la Shine-Dalgarno et des régions d’initiation de la traduction de l’ARN messager ompF.
L’ARN 4,5 S crée un duplex stable avec le site de fixation du chromosome de ompF inhibant la traduction et sans doute déstabilisant le messager. La transcription de micF est stimulée d’un facteur 10 à 37°C et au delà (Figure 8) [132].

Résistance et perméabilité membranaire

 -lactamines et porines :
Les porines jouent un rôle clé dans la pénétration des antibiotiques. En effet les -lactamines représentent le soluté idéal : petite molécule (<600 daltons), chargée (anionique, dianionique, zwitterionique…) et hydrophile pour diffuser dans le canal [76,128].
Actuellement, les études les plus récentes ont permis d’évaluer les régions du canal, la zone de constriction chez OmpF on PhoE, qui participent au passage des β-lactamines chez E.coli. Dans ce contexte, il faut mentionner le cas particulier de la porine D2 de P.aeruginosa et son implication dans la pénétration des carbapénèmes [151], en ce qui concerne les quinolones les résultats sont moins évidents, même si les porines pourraient intervenir dans le cas des fluoroquinolones, cela semble moins exclusif que pour la classe des β-lactamines et l’absence de données cinétiques précises ne permet pas d’élucider clairement la voie d’entrée.
Les études entreprises sur diverses espèces bactériennes exprimant leur porines spécifiques ont mis en lumière la relation entre canal et pénétration des céphalosporines dans la cellule. Ainsi, les travaux entrepris sur la diffusion de céphalosporines ont établi clairement que le cœfficient de perméabilité, donc de pénétration dans la bactérie, varie considérablement d’une espèce à l’autre. L’exemple le plus remarquable est celui de la céphaloridine qui voit son coefficient chuter dramatiquement lorsque l’on passe d’Escherichia à Pseudomonas puis Mycobacteruim [87, 126, 170]. Dans ces conditions, les études sur la structure de la membrane et du canal sont nécessaires afin de comprendre l’aspect cinétique et donc d’approcher la sensibilité à l’antibiotique.
Tous ces travaux ont assuré le développement de techniques biochimiques et immunologiques qui ont à leur tour permis de caractériser, chez les souches cliniques, l’importance de la perméabilité membranaire dans la sensibilité aux antibiotiques [132]. Actuellement, le nombre de souches résistantes aux -lactamines et dépourvues de porines est impressionnant. Au cours de ces dernières années plusieurs travaux ont montré la relation entre la disparition des porines et la résistance chez Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia…[28, 31, 106, 170]. En fait, il faut noter que si les cas de souches documentées comme porines déficientes sont nombreux une seule enquête sur la relation « résistance/porine » a été réalisée et elle ne s’adressait qu’à une population restreinte lors de cette étude, une proportion élevée d’isolats d’E.aerogenes multi-résistants aux céphalosporines manifeste le phénotype porine-déficient [31].
Enfin, la résistance aux dernières molécules, céfépime ou céfpirome, semble intimement associée à ce phénotype, tout au moins chez Enterobacter. Cette absence est très souvent associée à la production d’enzymes, stratégies qui traduit une résistance élevée aux céphalosporines. Le défaut de porine apparaît fructueux à un plus d’un titre pour la bactérie, par la barrière membranaire qui limite alors la concentration intracellulaire d’antibiotiques en dessous de la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice), mais aussi par cette faible quantité qui peut alors déréprimer l’expression de la céphalosporinase inductible [132].
Ce problème d’expression interpelle les chercheurs sur le mécanisme responsable de la disparition des porines chez les isolats. Malgré le nombre d’isolats présentant le profil porine-éficient, peu d’informations sont disponibles concernant l’origine du phénotype. Dans certains cas il semble que la disparition des porines soit la conséquence de mutations dans le LPS qui pourraient altérer alors la voie d’assemblage des protéines dans la membrane externe [144].
Un phénomène plus général est ainsi observé touchant l’équilibre physiologique de l’enveloppe et pouvant se traduire par des changements de la morphologie bactérienne, ces modifications pouvant générer les phénotypes de type leaky (libération de matériel périplasmique dans le milieu), rugueux (altérations des LPS)… qui traduisent une «pathologie» de l’enveloppe bactérienne.
A côté de ces modifications importantes de la physiologie de l’enveloppe, il semble que la régulation de l’expression des porines via OmpX intervienne dans certains cas. Il a été observé chez des isolats d’E.cloacae résistants aux céphalosporines, que la perte des porines s’accompagnait de l’expression d’une protéine de taille voisine de OmpX ; dans certains isolats, la protéine exprimée présenterait une parenté immunologique avec OmpX [164, 165].
En fait, dans les travaux entrepris récemment, une comparaison est réalisée entre l’expression des porines et d’autres protéines standards de la membrane externe, cette démarche permet la discrimination entre un effet pléiotropique sur la structure pariétale, incluant de larges alternations de constituants de base, et un effet spécifique s’adressant à la régulation d’une classe particulière de protéines, les porines [132].

Les différentes infections nosocomiales à Enterobacter aerogenes

Enterobacter aerogenes est responsable d’infections nosocomiales dont les plus habituelles sont des pneumopathies [61], des infections urinaires et peut être à l’origine de septicémies dont la fréquence relative varie de 3,8% à 6,3% suivant les études [3, 7, 9, 24, 64, 177, 179]. La mortalité associée est de 30 à 42% [27, 152, 179].
E.aerogenes peut être également responsable de méningites, le premier cas décrit remontant à 1978 [55], de cellulites [111], d’endophtalmies [115, 152] d’infections ostéo-articulaire, de péritonites et de suppuration diverses [22, 152]. On la retrouve actuellement avec une forte prévalence dans les unités de pédiatrie comme colonisant du tractus urinaire.
 Septicémie et infection du cathéter :
La septicémie est le plus souvent secondaire à un foyer primitif responsable de décharge bactérienne (peau, tube digestif, voies biliaires, poumons, endocarde, voies génito-urinaires, systèmes nerveux central, os) [5]. En dehors de ces cas, il s’agit le plus souvent d’une infection du cathéter [174], plus d’un tiers des bactériémies nosocomiales (37,1%). Quelques fois la porte d’entrée reste inconnue. Dans ce cas la mortalité est plus élevée [147, 174]. E.aerogenes est la cinquième cause de septicémies nosocomiales aux USA, 5 à 7% [185, 152].
La démarche diagnostique doit être systématique et repose sur l’examen clinique, l’imagerie et les prélèvements microbiologiques [5].
Les infections sur cathéter, fréquentes, représentent 15% des infections nosocomiales, doivent être envisagées devant tout syndrome septique survenant chez un patient porteur d’un cathéter vasculaire [146].
L’infection peut être locale (concernant le cathéter lui même) ou générale (bactériémie dont le cathéter constitue la porte d’entrée) [5, 146]. 3 à 7 des cathéters vasculaires se compliquent d’une infection, ce taux n’est que 1 à 2% en ce qui concerne les cathéters implantables de longue durée. Les micro-organismes les plus fréquemment responsables d’infection sur cathéter sont les Staphylocoques coagulase négative (Staphylococcus epidermis en 1er lieu) et les Staphylococcus aureus. En second lieu viennent les bacilles à Gram négatif (E.cloacae, E.aerogenes, K. pneumoniae…) et chez les patients présentant une immunodépression, les levures (Candida spp. essentiellement) [5, 146].
Le diagnostic est suspecté sur des signes cliniques d’infection locale : pus autour de l’orifice cutané du cathéter, cellulite le long d’un trajet sous cutané de tunnélisation, et d’infections systémiques : fièvre ou hypothermie, frissons, hypotension artérielle.
L’absence d’autres causes de sepsis, la résistance de l’infection au traitement antibiotique, la disparition des symptômes dans les 48 heures suivant l’ablation du cathéter sont des éléments évocateurs de septicémie sur cathéter.
La confirmation du diagnostic repose sur la réalisation d’hémocultures périphériques et sur le cathéter répétées et sur la mise en culture du cathéter [5, 146].
 Infection pulmonaire (pneumopathie) :
Les pneumopathies nosocomiales sont des infections acquises dans un établissement de soins plus de 48 heures après l’admission. La contamination se fait essentiellement par voie aérienne et le plus rarement par inhalation. Elle représente une cause importante de mortalité en secteur de réanimation. La pneumopathie peut être lobaire ou alvéolaire [146, 152].
Le diagnostic microbiologique repose sur les hémocultures en période fébrile et l’examen bactériologique des crachats. Cependant cet examen reste toujours difficile à affirmer. La colonisation des voies aériennes est constante au bout de huit jours de ventilation.
En effet, il existe des modifications de l’épithélium de surface favorisant l’adhérence des bactéries pathogènes par le biais d’une activité protéolytique salivaire accentuée, d’une déplétion en fibronéctine à la surface de l’épithélium associée à des modifications de l’effet de barrière des germes saprophytes oropharyngés sur l’action des antibiotiques et des déficits locaux en facteur de défense (Ig A, lysozyme) [5].
 Infection urinaire :
C’est l’infection nosocomiale la plus fréquente, dont le principal facteur de risque est le sondage vésical à demeure. C’est la présence à l’examen cytobactériologique des urines (ECBU) d’au moins 105 bactéries/ ml indépendamment des signes cliniques infectieux et de l’existence d’une pyurie. Les taux les plus élevés se retrouvent en réanimation. Les infections urinaires nosocomiales sont la cause d’environ 5% des bactériémies nosocomiales, elles représentent le principal réservoir de micro-organismes hospitaliers et surtout de bactéries multirésistantes [5, 152].
La colonisation urinaire représente actuellement, le principal réservoir d’E.aerogenes chez les personnes âgées en unités de long séjour et qui peut donner lieu à des infections urinaires dans ces services ou au cours d’une réhospitalisation.
 Cystite nosocomiale :
Il s’agit d’une infection urinaire basse (infection des urines de la vessie) survenant chez des patients homme ou femme avec un terrain particulier tel que l’obstacle sur les voies urinaires (calculs, adénomes de la prostate ou anomalie congénitale de l’appareil urinaire), ou une maladie générale prédisposante telle que le diabète, la drépanocytose ou la polykystose rénale. Cette infection est acquise à l’hôpital et elle est essentiellement représentée par des infections sur sondes urinaires (80%). La cystite nosocomiale à E.aerogenes est très fréquente (40%) [146].

RESISTANCE D’Enterobacter aerogenes AUX ANTIBIOTIQUES

Pour être efficace, un antibiotique doit parvenir au contact de la bactérie, ce qui implique qu’on tienne compte dans la prescription des données pharmacologiques telle que la pathologie, la voie d’introduction, la diffusion tissulaire et le métabolisme de la molécule.
Il doit ensuite pénétrer dans la bactérie, n’y être ni détruit ni modifié, se fixer à une cible et perturber ainsi la physiologie bactérienne. Si l’une de ces conditions n’est pas remplie l’antibiotique, même correctement administré se révélée inefficace. Ce phénomène appelé résistance est lourd de conséquences et doit être si possible, dépisté au laboratoire [186].

Les types de résistance

Il existe deux types de résistance :
 Résistance naturelle ; programmée sur le génome bactérien, donc fixe et constante à l’intérieur du taxon. A ce titre, elle constitue un critère d’identification [186].
 Résistance acquise ; consécutive à des modifications de l’équipement génétique chromosomique ou plasmidique. Elle ne concerne que quelques souches d’une même espèce mais peut s’étendre : – sa fréquence varie dans le temps mais aussi dans l’espace – région, ville, hôpital ou même service. Elle constitue un marqueur épidémiologique [186].

Mécanisme d’action des antibiotiques

Les -lactamines et les aminosides sont les antibiotiques les plus utilisés en thérapeutique hospitalière seuls ou le plus souvent associés aux fluoroquinolones dans le traitement des infections sévères à E.aerogenes.

Mécanisme d’action des -lactamines

La famille des -lactamines comprend un grand nombre de molécules, le représentant le plus ancien étant la pénicilline G [113, 167]. Toutes partagent une structure commune, le cycle -lactame, structure chimique indispensable à l’activité antibiotique. Sont classées en quatre grands groupes : les pénicillines, les céphalosporines, les carbapénèmes (dont l’imipénème) et les monobactames (dont l’aztréonam).
Les -lactamines inhibent la dernière étape de la synthèse du peptidoglycane, plus précisément la formation des ponts interpeptidiques, leurs cibles étant les PLP.
Les -lactamines n’ont pas à traverser la membrane cytoplasmique pour accéder à leurs cibles, puisque celles-ci sont situées à la face externe de la membrane cytoplasmique.
Par ailleurs, la plupart d’entre elles (exceptés les pénicillines G, V et M) ont un degré d’hydrophilie et une taille leur permettant de franchir la membrane externe des bactéries à Gram négatif par la voie des porines. Les -lactamines présentent une analogie de structure avec le dipeptide terminal D-alanine- D-alanine faisant partie du pentapeptide qui constitue le substrat naturel des transpeptidases et, accessoirement, des carboxypeptidases [167].
L’antibiotique est donc capable de se lier au site actif de l’enzyme; il y a alors ouverture du cycle -lactame et formation d’un complexe covalent dont la durée de vie est longue. A l’inverse, quand ce complexe n’est pas stable, la PLP se comporte alors comme une -lactamase; l’antibiotique est alors hydrolysé et l’enzyme restitué sous forme active [54, 112].
L’effet direct de l’inhibition de la synthèse du peptidoglycane due aux -lactamines est l’arrêt de la croissance bactérienne, ou bactériostase. Or ces antibiotiques ont habituellement un effet bactéricide sur les bactéries sensibles. L’action bactéricide des -lactamines se manifeste le plus souvent par une dégradation du peptidoglycane conduisant à une lyse de la bactérie. L’effet des ß-lactamines serait :
– de déréguler l’activité des autolysines et d’induire ainsi l’autolyse de la paroi (dégradation progressive et rapide du peptidoglycane),
– de sensibiliser la -lactamine aux variations de pression osmotique en créant un peptidoglycane fragile.

Mécanisme d’action des Quinolones

On distingue les produits les plus anciens, comme l’acide nalidixique, actifs uniquement sur les bacilles à Gram négatif, et les fluoroquinolones (leur formule incluant un atome de fluor et un cycle pipérazine) douées d’une activité antibactérienne plus élevée et d’un spectre plus large [167].
Ces molécules pénètrent dans le cytoplasme bactérien par diffusion passive et vont agir sur leur cible spécifique, l’ ADN gyrase. Cette enzyme possède une structure tétramérique codée par les gènes gyrA et gyrB. L’ADN gyrase fait partie du groupe des topo-isomérases, enzymes qui modifient le degré de torsion de l’ADN.
L’ADN bactérien est naturellement légèrement surenroulé négativement ; cet état facilitant la séparation des deux brins de la double hélice, préalable à la réplication et à la transcription. L’ADN gyrase est la seule topo-isomérase bactérienne capable de surenrouler négativement l’ADN. Cette action de la gyrase est ATP-dépendante. Au moment de la formation de la coupure double-brin, l’ADN et la gyrase sont liés de manière covalente. La cible des quinolones est ce complexe covalent ADN-enzyme normalement transitoire mais qui est stabilisé par l’antibiotique. Il y a donc formation d’un complexe ternaire ADN – gyrase – quinolone, le fonctionnement de l’enzyme est inhibé et elle reste fixée sur l’ADN. De plus la coupure double-brin de l’ADN n’est pas réparée [167].
Les quinolones sont aussi capables d’inhiber une deuxième topo-isomérase bactérienne, l’ADN topo-isomérase IV, qui présente des homologies structurales avec l’ADN gyrase [167]. Son rôle physiologique essentiel in vivo est la décaténation, qui permet notamment la séparation des deux ADN fils en fin de réplication. L’inhibition de cette enzyme semble aussi intervenir dans l’activité antibactérienne des quinolones.
Le complexe ternaire ADN-enzyme-quinolone agit en fait comme un « poison » en bloquant la progression sur l’ADN des ADN- et ARN- polymérases bactériennes, d’où arrêt de la réplication et de la transcription et donc inhibition de croissance [182]. Ainsi, l’inhibition d’une minorité des molécules de gyrase présentes dans la bactérie suffit à inhiber la croissance bactérienne.
L’action bactéricide des quinolones serait déclenchée par la dissociation secondaire de l’ADN et de l’enzyme au niveau du complexe de clivage, sans que la coupure double-brin puisse être réparée. La présence de ces lésions irréversibles de l’ADN qui étaient auparavant masquées par la fixation à l’enzyme, déclencherait des phénomènes secondaires encore mal connus, liés à l’activation de certaines synthèses protéiques et aboutissant à la mort de la bactérie [54, 167].
Les quinolones possèdent donc deux cibles intracellulaires. Il semble toutefois que pour la plupart des espèces bactériennes, l’une des deux constitue la cible préférentielle. La gyrase apparaît comme la cible primaire pour les bacilles à Gram négatif.

Mécanismes d’action des aminosides 

Ceux sont des sucres ou sucres aminés et polycationiques. Le ribosome constitue leur cible principale, mais les aminosides ont aussi une action au niveau des membranes externe et cytoplasmique et au niveau du complexe d’initiation de la réplication de l’ADN.
De par leur structure poycationique, les aminosides sont capables de perturber l’organisation membranaire du LPS et de promouvoir ainsi leur propre passage à travers la membrane externe. Le passage de aminosides à travers les porines est possible. Le transport des aminosides hydrophiles à travers la membrane cytoplasmiques nécessite de l’énergie. Il se fait en deux phases (« Energy Dependent Phase » ou EDP). La première phase (EDP I) aboutit
à une accumulation lente et a un effet bactériostatique. Pendant la seconde phase (EDP II), les aminosides s’accumulent rapidement et ont un effet bactéricide. Classiquement on considère que les aminosides ayant pénétré la cellule pendant EDP I seraient responsables d’erreurs de lecture au cours de la traduction de l’ARNm qui conduiraient à la synthèse de protéines de membranes anormales. Ces protéines donneraient naissance à des canaux non spécifiques qui seraient empruntés par les aminosides lors de la phase de pénétration accélérée EDP II.
En ce qui concerne l’action des aminosides sur le ribosome, il est admis que les différents aminosides n’ont pas les mêmes sites de fixation. Cette fixation va dans tous les cas engendrer des distorsions au niveau de la structure du ribosome et aura pour conséquence une altération de toutes les étapes de la traduction de l’ARNm. La bactéricidie de cette classe d’antibiotiques semble être principalement due à deux processus : perte de l’intégrité membranaire (par incorporation de protéines anormales) et blocage complet des synthèses protéiques [54].

Mécanismes de résistance aux antibiotiques

Actuellement, différents mécanismes de résistance sont décrit chez E.aerogenes et sont classés en quatre catégories (Figure 10).
Ces mécanismes ont un impact sur la fréquence des étapes bactériennes responsable des infections surtout des infections nosocomiales [32, 56, 85, 103, 133];
– inactivation enzymatique
– altération de la perméabilité membranaire
– mécanisme d’efflux
– modification de la cible d’antibiotique

Table des matières

INTRODUCTION
PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE
1. CLASSIFICATION
2. HABITAT
3. CARACTERES BACTERIOLOGIQUES
3. 1. CARACTERES MORPHOLOGIQUES
3. 2. CARACTERES CULTURAUX
3. 3. CARACTERES BIOCHIMIQUES
3. 4. CARACTERES ANTIGENIQUES
4. MARQUEURS EPIDEMIOLOGIQUES D’Enterobacter aerogenes
4. 1. MARQUEURS PHENOTYPIQUES
4. 1. 1. LA BIOTYPIE
4. 1. 2. LA SEROTYPIE
4. 1. 3. LA LYSOTYPIE
4. 1. 4. L’ANTIBIOTYPIE
4. 1. 5. LA BACTERIOCYNOTYPIE
4. 2. MARQUEURS GENOTYPIQUES
4. 2. 1. L’ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE OU PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS  (PFGE)
4. 2. 2. TYPAGE APRES AMPLIFICATION PAR PCR
5. STRUCTURE MEMBRANAIRE D’Enterobacter aerogenes
5. 1. PEPTIDOGLYCANE (OU MUREINE)
5. 2. MEMBRANE EXTERNE
5. 3. LES PORINES
5. 3. 1. STRUCTURE DES PORINES
5. 3. 2. FONCTIONS DES PORINES
5. 3. 3. REGULATION DE L’EXPRESSION DES PORINES
5. 3. 4. RESISTANCE ET PERMEABILITE MEMBRANAIRE
6. EPIDEMIOLOGIE D’Enterobacter aerogenes
7. INFECTIONS NOSOCOMIALES A Enterobacter aerogenes
7. 1. FACTEURS PREDISPOSANTS
7. 2. LES DIFFERENTES INFECTIONS NOSOCOMIALES A ENTEROBACTER AEROGENES
8. RESISTANCE D’Enterobacter aerogenes AUX ANTIBIOTIQUES
8. 1. LES TYPES DE RESISTANCE
8. 2. MECANISME D’ACTION DES ANTIBIOTIQUES
8. 2. 1. MECANISME D’ACTION DES -LACTAMINES
8. 2. 2. Mécanisme d’action des Quinolones
8. 2. 3. Mécanismes d’action des aminosides [167, 182]
8. 3. MECANISMES DE RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES
8. 3. 1. INACTIVATION ENZYMATIQUE
8. 3. 2. ALTERATION DE LA PERMEABILITE MEMBRANAIRE
8. 3. 3. MECANISME D’EFFLUX
8. 3. 4. MODIFICATION DE LA CIBLE DE L’ANTIBIOTIQUE
8. 4. RESISTANCE MULTIPLE AUX ANTIBIOTIQUES (MULTI DRUG RESISTANT) (MDR)
8. 4. 1. GENERALITES
8. 4. 2. ASPECTS PHYSIOLOGIQUES DE LA MULTI-DRUG RESISTANCE
8. 5. SITUATION ACTUELLE
8. 5. 1. STRATEGIE THERAPEUTIQUE ET POLITIQUE DE PREVENTION
8. 5. 2. STRATEGIE THERAPEUTIQUE
8. 5. 3. POLITIQUE D’HYGIENE
PARTIE PRATIQUE MATERIEL
1. MATERIEL BIOLOGIQUE
1. 1. SOUCHE DE REFERENCE
1. 2. SOUCHES CLINIQUES
2. MATERIEL UTILISE AU LABORATOIRE
2. 1. OUTILS BIOLOGIQUES
2. 2. Appareillage
2. 3. Milieux de culture et réactifs utilisés
2. 4. Autre matériel
METHODES
1. VERIFICATION DE LA PURETE DES SOUCHES
2. ETUDE MICROSCOPIQUE
3. IDENTIFICATION BIOCHIMIQUE
3. 1. PRINCIPE
3. 2. MODE OPERATOIRE
3. 3. LECTURE
4. TEST DE SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES
4. 1. LES ANTIBIOTIQUES TESTES
4. 2. TECHNIQUE
4. 2. 1. PREPARATION DES SUSPENSIONS BACTERIENNES
4. 2. 2. PREPARATION DES DIFFERENTES CONCENTRATIONS D’ANTIBIOTIQUES
4. 2. 3. ENSEMENCEMENT
4. 2. 4. LECTURE
5. EXTRACTION D’ADN GENOMIQUE
5. 1. PRINCIPE
5. 2. EXTRACTION A L’HEXADECYLTRIMETHYL AMMONIUM BROMURE (CTAB) [22, 168]
5. 2. 1. REACTIF UTILISES
5. 2. 2. TECHNIQUE
5. 3. EXTRACTION PAR KIT QIA QUICK QIAGEN
5. 3. 1. REACTIFS UTILISES
5. 3. 2. TECHNIQUE
5. 4. Migration électrophorétique
5. 4. 1. REACTIFS UTILISES
5. 4. 2. PREPARATION DU GEL
5. 4. 3. PREPARATION DES ECHANTILLONS A ANALYSER
5. 4. 4. LE DEPOT
5. 4. 5. MIGRATION
5. 4. 6. COLORATION AU B.E.T
5. 4. 7. VISUALISATION SOUS ULTRA- VIOLETS
6. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
6. 1. PRINCIPE
6. 2. APPLICATION DE LA TECHNIQUE D’AMPLIFICATION (PCR) SUR L’ADN DE LA SOUCHE DE REFERENCE ATCC 13048
6. 2. 1. OUTILS BIOLOGIQUES
6. 2. 2. TECHNIQUE
6. 3. PURIFICATION ET SEQUENÇAGE
7. CLONAGE DU GENE PARTIEL DE PORINE ANALOGUE A OmpK 35
7. 1. PRINCIPE
7. 2. REACTIFS UTILISES
7. 3. TECHNIQUE DE CLONAGE EN UTILISANT LE VECTEUR PGEM® –T
7. 4. INCORPORATION DU PLASMIDE RECOMBINANT A L’HOTE
7. 4. 1. PRINCIPE
7. 4. 2. REACTIFS UTILISES
7. 4. 3. CHOIX DE L’HOTE
7. 4. 4. PREPARATION DES CELLULES COMPETENTES
7. 4. 5. PROTOCOLE DE LA TRANSFORMATION
7. 4. 6. CHOIX DE CLONES : (DEPISTAGE BLEU-BLANC)
7. 5. AMPLIFICATION DES PRODUITS CLONES
8. EXTRACTION D’ADN PLASMIDIQUE
8. 1. PRINCIPE
8. 2. EXTRACTION PAR LE KIT « WIZARD PLUS SV MINI PREP » ( PROMEGA)
8. 3. REACTIFS UTILISES FOURNIS DANS LE KIT
8. 4. TECHNIQUE
9. SEQUENÇAGE PAR PROGRESSION SUR LE GENOME (GENOME WALKER)
9. 1. PRINCIPE
9. 2. REACTIFS UTILISES
9. 3. TECHNIQUE
9. 3. 1. RESTRICTION
9. 3. 2. LIGATION AVEC L’ADAPTATEUR GENOME WALKER
9. 3. 3. Détermination des amorces
9. 3. 4. Amplification par PCR (primaire et secondaire)
9. 3. 5. Séquençage du gène complet analogue à ompK 35
10. TRAITEMENT BIOINFORMATIQUE
10. 1. CHOIX DES AMORCES
10. 2. ASSEMBLAGE DE SEQUENCES
10. 3. RECHERCHE D’HOMOLOGIE ET ALIGNEMENT DE SEQUENCES
10. 4. CARTE DE RESTRICTION
11. ROLE DE LA PORINE OmpEa 35 DANS LE RETOUR A LA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES
11. 1. LA PORINE OmpEa 35 SOUS LE CONTROLE DE SON PROMOTEUR
11. 1. 1. Réactifs utilisés
11. 1. 2. Protocole
11. 2. LA PORINE OmpEa 35 SOUS LE CONTROLE DU PROMOTEUR LAC Z
11. 2. 1. Réactifs utilisés
11. 2. 2. Protocole
12. ETUDE DES SEQUENCES DES GENES DE SOUCHES CLINIQUES A E.aerogenes99
12. 1. AMPLIFICATION PAR PCR
12. 2. SEQUENÇAGE
12. 3. ALIGNEMENT DE SEQUENCES
13. SUREXPRESSION ET PURIFICATION DE LA PORINE OmpEa 35
13. 1. REACTIFS UTILISES
13. 2. PREPARATION DE L’INSERT
13. 2. 1. Amplification par PCR
13. 2. 2. Ligation avec le pGEM-T
13. 2. 3. Analyse des plasmides recombinants
13. 2. 4. Digestion enzymatique par Xho I et Nde I
13. 2. 5. Purification de bande par kit Concert Gel Extraction Systems GibcoBRL
13. 3. PREPARATION DU VECTEUR D’EXPRESSION pET 24 a+ (NOVAGEN):
13. 3. 1. Digestion enzymatique
13. 3. 2. Purification de bande à partir du gel
13. 4. SOUS- CLONAGE DE L’INSERT DANS LE VECTEUR PET 24 a+
13. 4. 1. Ligation
13. 4. 2. Transformation
13. 5. CONDITIONS D’EXPRESSION
13. 6. OBTENTION DES LYSATS CELLULAIRES TOTAUX
13. 7. PREPARATION DES FRACTIONS SOLUBLES ET INSOLUBLES
13. 8. EXTRACTION DE MEMBRANE EXTERNE
13. 9. PURIFICATION D’OMPEA 35- HIS TAG PAR KIT NI-NTA
13. 9. 1. Réactifs utilisés
13. 9. 2. Protocole
14. ELECTROPHORESE EN GEL DE POLYACRYLAMIDE (SDS-PAGE)
14. 1. PREPARATION
14. 2. MIGRATION
14. 3. COLORATION DES GELS AU BLEU
RESULTATS ET DISCUSSIONS
1. EXAMENS MICROSCOPIQUES
2. CARACTERES CULTURAUX
3. CARACTERES BIOCHIMIQUES
4. TEST DE SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES
5- PROFIL D’EXTRACTION D’ADN GENOMIQUE
6. AMPLIFICATION PAR PCR
7. CLONAGE
8. GNOME WALKER
9. SEQUENÇAGE
10. ALIGNEMENT DE SEQUENCES
11. DETERMINATION DE LA CARTE DE RESTRICTION
12. ROLE DE LA PORINE OmpEa 35 DANS LE RETOUR A LA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES
12. 1. LA PORINE OmpEa 35 SOUS LE CONTROLE DE SON PROMOTEUR
12. 2. LA PORINE OmpEa 35 SOUS LE CONTROLE DU PROMOTEUR LAC Z
13. ETUDE DES SEQUENCES DES GENES DE SOUCHES D’E. aerogenes
14. SUREXPRESSION ET PURIFICATION DE LA PORINE OmpEa 35
14. 1. AMPLIFICATION PAR PCR
14. 2. DIGESTION ENZYMATIQUE PAR NDE I, XHO I
14. 3. SURPRODUCTION DE LA PROTEINE MEMBRANAIRE CHEZ E.COLI
14. 4. PREPARATION DES FRACTIONS SOLUBLES ET INSOLUBLES
14. 5. PURIFICATION DE OmpEa 35 – 6HIS PAR CHROMATOGRAPHIE D’AFFINITE
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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