L’électrophorèse des protéines urinaires

L’électrophorèse des protéines urinaires 

 Synthèse critique sur les résultats de l’étude

Le but de cette expérimentation était de tester si l’analyse qualitative d’une protéinurie pouvait se faire à partir d’urines conservées sur papier absorbant.
Les étapes préliminaires et l’étude Procon ont montré :
1/ Que la réalisation d’électrophorèse SDS-AGE était possible sur des spécimens d’urine collectés sur papier absorbant conservés plusieurs jours à température ambiante.
Cependant, il est important de mentionner que sur les 19 chiens inclus, 11 ont été exclus car leurs profils électrophorétiques obtenus à partir des urines conservées sur papier absorbant étaient d’une intensité plus faible que les profils obtenus à partir des urines liquides. Deux hypothèses peuvent expliquer ces diminutions d’intensité
– Des erreurs de mesures de RPCU sur papier : la protéinurie a été fortement surestimée pour un certains nombres d’individus prélevés et la dilution appliquée par suite pour réaliser l’électrophorèse a été par conséquent surestimée
– Une resolubilisation insuffisante de l’urine à partir des spécimens papiers

2/ Que cette technique donne de moins bon résultats pour des protéinuries à faible poids moléculaire (tubulaire et mixte)
Ce dernier point nécessite d’être relativisé : à la fin des expériences, il n’a été possible de comparer les profils électrophorétiques entre spécimen papier et liquide que pour 3 individus à profil mixte et aucun individu à profil tubulaire n’a pu être inclus dans les résultats finaux. Les résultats électrophorétiques ont été insatisfaisants pour 2 de ces 3 individus à profil mixte, pour lesquels les bandes protéiques tubulaires (< 69 kDa) n’ont pas été visualisées. Le dernier individu présente un résultat satisfaisant mais incomplet : même si la visualisation d’une bande de faible poids moléculaire (LWM) a permis d’identifier un profil mixte, celle-ci était d’intensité fortement diminuée et toutes les bandes LWM n’ont pas été détectées.

Les défauts de l’étude

Les problèmes rencontrés au cours de l’étude sont principalement liés à l’étape de resolubilisation de l’urine stockée sur papier, qui pourrait engendrer une dilution trop importante de la concentration en protéine, et à la mesure de la protéinurie.
1/ Tous les animaux exclus de l’étude après obtention des gels électrophorétiques ont une concentration en protéine sur spécimen liquide < 1700 mg/L alors que les 8 animaux restants ont tous une protéinurie > 1700 mg/L. D’après les résultats des RPCU obtenus sur spécimen papier, la protéinurie est fortement diminuée du fait de la dilution et cela pourrait expliquer la diminution d’intensité des profils.
De même pour les 3 profils mixtes conservés en fin d’expérience, les bandes de faible poids moléculaire observées sur les spécimens liquides ont une intensité faible à modérée (parfois même à l’état de trace). En reliant l’intensité de chaque bande protéique à leur concentration respective, les protéines de faible poids moléculaire des 3 chiens à profil mixte étaient présentes en faible concentration : l’absence de ces bandes protéiques sur spécimen papier pourrait ainsi s’expliquer par une trop faible concentration suite à leur dilution lors de la resolubilisation de l’urine conservée sur papier.
Pour vérifier cette hypothèse, il serait nécessaire de réaliser de nouvelles expériences sur des chiens à forte protéinurie, tubulaire et mixte.
2/ Lors des manipulations techniques, de nombreuses erreurs concernant la mesure de la concentration de la protéinurie ont été détectées. Sur chaque spécimen liquide, les mesures ont été répétées deux fois, permettant ainsi d’éliminer les valeurs de protéinurie et de RPCU absurdes. Cependant, le protocole de resolubilisation établi pour notre étude ne nous permettait pas de doubler la mesure des RPCU sur spécimen papier. Des valeurs absurdes de protéinurie n’ont peut-être pas été relevées et des facteurs de dilutions ont pu être appliqués de manière erronée lors de la réalisation des électrophorèses, rendant les profils électrophorétiques sur papier moins intense et donc ininterprétable. Une nouvelle expérimentation avec une mesure plus fiable de la protéinurie serait donc utile pour vérifier cette hypothèse.
Enfin, la méthode utilisée d’extraction des protéines urinaires devrait être améliorée afin d’éviter leur dilution trop importante lors de la resolubilisation du papier absorbant avec de l’eau distillée, en essayant par exemple de diminuer la quantité d’eau distillée nécessaire au minimum pour qu’il y ait suffisamment de surnageant pour réaliser un RPCU et une électrophorèse. Afin de réaliser un RPCU et une électrophorèse il faut respectivement 200 µL et 80 µL de surnageant. En utilisant 0,5 mL d’eau distillée pour la resolubilisation des spécimens papiers, il restait toujours un surplus de surnageant à la fin des expériences. Ainsi, le volume d’eau distillée nécessaire pourrait être diminué afin de réduire l’effet d’une dilution trop importante sur la quantité de protéine.

CONCLUSION

La première évaluation de cette méthode d’électrophorèses SDS-AGE sur urines conservées sur spécimens papiers a permis d’en démontrer la faisabilité et d’en valider le principe et les grandes lignes techniques. Cette méthode faciliterait et simplifierait le mode de conservation de l’urine d’animaux protéinuriques. Cette méthode de réalisation d’électrophorèses SDS-AGE sur pécimens urinaires collectés sur papier absorbant présente donc des perspectives intéressantes, surtout dans le cadre d’une caractérisation de la protéinurie d’animaux suspects ou atteints de maladies rénales, mais des études complémentaires sont encore nécessaires afin de la rendre aisée et reproductible en laboratoire puis par le praticien à long terme.

Table des matières

LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES ABREVIATIONS
INTRODUCTION
PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE
1. L’électrophorèse des protéines urinaires
1.1 L’objectif de la qualification d’une protéinurie rénale
1.2 Technique de l’électrophorèse
2. Les facteurs pré-analytiques et analytiques
2.1 Variations liées au type et à la préparation des urines
2.2 Stockage et délai du traitement des urines
3. Interprétation des profils électrophorétiques
3.1 Principe de l’interprétation
3.2 Intérêt diagnostique et pronostique
PARTIE EXPÉRIMENTALE
1. Matériel et méthodes
1.1 Déroulement de l’expérience
1.2 Animaux / spécimens
Critères d’inclusion
Critères d’exclusion
1.3 Collecte des spécimens urinaires
1.4 Étapes pré-analytiques
Préparation des urines sur papier absorbant
Conservation et traitements des urines
1.4.2.1 Spécimens liquides
1.4.2.2 Spécimens sur papier absorbant
1.5 Étapes analytiques
Etapes analytiques immédiates au jour de l’inclusion (J0)
1.5.1.1 Analyse par bandelette urinaire et densité urinaire
1.5.1.2 Analyse du culot urinaire
1.5.1.3 Calcul initial du rapport Protéines urinaires/créatinine urinaire
1.5.1.4 Migration électrophorétique sur gel SDS-AGE
Analyses ultérieures
1.5.2.1 Resolubilisation des spécimens papiers
1.5.2.2 Réalisation des RPCU ultérieurs
1.5.2.3 Réalisation des SDS-AGE
1.6 Protocole expérimental
Essais préliminaires
1.6.1.1 Sur spécimens papier et eau distillée
1.6.1.2 Sur spécimens papier et urine
Comparaison des profils électrophorétiques obtenus à partir de spécimens liquides et spécimens papiers
Planning prévisionnel analytique par spécimen
2. Résultats
2.1 Essais préliminaires
Essai préliminaire eau distillée sur papier absorbant
Essai préliminaire urine sur papier absorbant
2.2 Comparaison des profils électrophorétiques obtenus par spécimens liquides et spécimens papiers
Exclusion des gels électrophorétiques ininterprétables
Interprétation des profils électrophorétiques à J0
Variation d’intensité des profils électrophorétiques entre spécimen liquide et papier
Stabilité des profils électrophorétiques sur 5 jours de conservation sur papier absorbant
3. Discussion
3.1 Synthèse critique sur les résultats de l’étude
3.2 Les défauts de l’étude
CONCLUSION
ANNEXES
1. Annexe 1 : Fiche d’accompagnement de prélèvement
2. Annexe 2 : Fiche d’analyse du prélèvement
3. Annexe 3 : Guide d’utilisation du Liquidcheck Urine Chemistry Control, BioRad _ Level 1, Bio RAD Laboratories, Marnes-la-Coquette, France
4. Annexe 4 : Résultats RPCU et électrophorétiques des 19 chiens protéinuriques

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