LE VIRUS ET LA REPONSE IMMUNITAIRE 

LE VIRUS ET LA REPONSE IMMUNITAIRE 

OBJECTIF

La vaccination obligatoire, en France, des ovins et des bovins contre le BTV-8 durant l’année 2008 a été pratiquée avec des vaccins inactivés qui ne bénéficiaient que d’autorisation temporaire d’utilisation (ATU). Les laboratoires ont prouvé l’efficacité clinique des vaccins, chez les ovins, à partir de 3 semaines après l’injection de primovaccination. En l’absence de suffisamment de vaccins disponibles, la vaccination a été réalisée en commençant par le nordest du pays, et en se dirigeant vers le sud-ouest, tout-à-fait en parallèle de la propagation de la maladie elle-même. Dans la mesure où la vaccination a été pratiquée en pleine épizootie, l’apparition de la maladie sur des animaux préalablement vaccinés a été souvent mal comprise par les éleveurs. L’objectif de cette étude était d’évaluer l’efficacité d’un vaccin inactivé lorsque l’infection virale apparaissait précocement, avant la date officielle de couverture vaccinale.
En outre, dans les ATU puis les AMM des vaccins anti BTV, la protection clinique est évaluée sur base de la réduction de l’hyperthermie et/ou des signes cliniques majeurs de la bluetongue. Ces vaccins n’ont aucune indication de protection des fonctions de reproduction des animaux. Le deuxième objectif de cette étude visait donc à évaluer l’impact d’une infection par BTV sur la qualité du sperme de béliers reproducteurs.

MATERIEL ET METHODES

Virus et cultures cellulaires

– Cultures cellulaires
Les cellules utilisées pour amplifier et titrer le virus ont été des fibroblastes de rein de bébé hamster BHK 21 (n°ATCC = CCL10). La culture de ces cellules a été effectuée en étuve à 37°C et 5% de CO2. Le milieu de culture de base était composé de 500 ml de Milieu Essentiel Minimum (MEM) contenant des sels de Earle et de la L-glutamine 1X, de 5 ml d’acides aminés non essentiels (AANE) 100X, de 5 ml de pénicilline à 10000 U/ ml et de streptomycine à 10000 U/ml. Les cellules ont été entretenues en flacons de 175 cm². Pour chaque passage, ces cellules ont été trypsinées sur un tapis confluent, puis diluées en milieu MEM de base contenant en plus 10 % de sérum de veau foetal.
– Souche virale
La souche virale utilisée est une souche de virus de la bluetongue sérotype huit (BTV- 8) isolée en Allemagne en 2007.
Cette souche virale a été mise en culture sur des flacons de 25 cm² (F25) de culture cellulaire préparés 48 heures auparavant : 1 ml d’inoculum a été déposé dans chaque F25, une agitation douce a été effectuée pendant deux heures à 37°C. L’inoculum a alors été retiré et remplacé par 5 ml de milieu complet à 3% de sérum de veau foetal (SVF) + 1% de fungizone. 24 heures plus tard, le milieu a de nouveau été changé. On a vérifié l’effet cytopathique : il était de 100% au bout de 48 heures. Une congélation à -80°C a alors eu lieu.
Trois passages successifs en culture cellulaire ont été réalisés afin d’amplifier le titre viral. Pour cela, les flacons précédents ont été rapidement décongelés (bain marie à 37°C) et 1 à 2 ml de ces suspensions cellulaires infectés ont été déposés dans des F25 de culture cellulaire. Les opérations « adsorption 2H 37°C sur l’agitateur bidirectionnel », « élimination de l’inoculum et remplacement par du milieu complet 3% de SVF » et « changement de milieu au bout de 24 heures » ont été répétées.
– Titrage du virus
L’inoculum ainsi obtenu a été décongelé rapidement et maintenu à 4°C. Des dilutions au dixième en série ont été effectuées (les concentrations allant de inoculum pur à 10-5, en milieu complet sans sérum). Sur des plaques de 24 puits, 200 μl de ces dilutions ont été déposés à raison de 4 à 8 puits par point de dilution. Les plaques ont été incubées 2 heures à 37°C sous CO2. L’inoculum a ensuite été enlevé et remplacé par 1 ml de milieu complet contenant 3% de SVF. Le milieu a à nouveau été changé au bout de 24 heures.
Quatre jours plus tard, ces cultures virales ont été fixées : pour cela : le surnageant de culture des puits a été éliminé, et chaque puit a été rincé avec du PBS (phosphate buffered saline) sans Ca²+ ni Mg²+. La nappe cellulaire a ensuite été recouverte par un fixateur(90% d’acétone et 10 % d’eau distillée, maintenu froid à -20°C). L’acétone est un solvant organique qui dénature les lipides et perméabilise la membrane plasmique. Les plaques ont été conservées 15 min à -20°C, l’acétone a été éliminée et les plaques séchées. La fixation a ainsi figé les structures dans un état stable analysable. Les plaques ont ainsi pu être révélées par immunocytochimie.

Table des matières

1. INTRODUCTION 
2. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 
2.1. LA FIEVRE CATARRHALE OVINE 
2.1.1. EPIDEMIOLOGIE DESCRIPTIVE
2.1.2. SIGNES CLINIQUES
2.1.3. LESIONS NECROPSIQUES
2.1.4. PATHOGENIE
2.1.5. EPIDEMIOLOGIE ANALYTIQUE
2.2. LE VIRUS ET LA REPONSE IMMUNITAIRE 
2.2.1. LE VIRUS DE LA BLUETONGUE
2.2.2. LA REPONSE IMMUNITAIRE CONTRE LE BTV
2.3. LES MOYENS DE LUTTE 
2.3.1. DIAGNOSTIC
2.3.2. VACCINATION
3. ETUDE EXPERIMENTALE 
3.1. OBJECTIF 
3.2. MATERIEL ET METHODES 
3.2.1. VIRUS ET CULTURES CELLULAIRES
3.2.2. SCHEMA EXPERIMENTAL
3.2.3. ANALYSES
3.2.4. ANALYSES STATISTIQUES
3.3. RESULTATS 
3.3.1. SIGNES CLINIQUES
3.3.2. QUANTITE ET QUALITE DU SPERME
3.3.3. LESIONS
3.3.4. VIROLOGIE
3.3.5. SEROLOGIE
3.4. DISCUSSION 
4. CONCLUSION 
5. BIBLIOGRAPHIE 
6. ANNEXES 
6.1. GRILLE DE NOTIFICATION DES SIGNES CLINIQUES
6.2. EXTRACTION DE L’ARN DES TISSUS CONSERVES EN RNA-LATER
6.3. PROTOCOLE EXPERIMENTAL DE LA RT-PCR QUANTITATIVE
6.4. PROTOCOLE EXPERIMENTAL DU TEST ELISA PAR COMPETITION
6.5. LISTE DES ORGANES PRELEVES EN AUTOPSIE

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