Le virus de l’immunodéficience humaine

Le virus de l’immunodéficience humaine

Le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) fait partie de la famille des rétrovirus et du genre des lentivirus. L’infection par le VIH cause le syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA) qui se caractérise par une diminution progressive du taux de lymphocytes T CD4+ circulants (200cellules/µl) résultant en une plus grande susceptibilité face aux infections opportunistes (Girard P.M. et al., 2011).

Structure du VIH
Le VIH est un lentivirus faisant partie de la famille des Retroviridae. Les rétrovirus sont des particules sphériques enveloppées d’une bicouche phospholipidique recouverte par des protéines de surface (SU) et transmembranaires (TM). L’intérieur de l’enveloppe est tapissé d’une matrice protéique (MA). Vient ensuite une capside virale protéique (CA) à l’intérieur de laquelle se trouve la nucléocapside (NC) qui protège les ARNs génomiques de polarité positive, associés a différentes enzymes virales telles que la transcriptase inverse (RT), l’intrégrase (IN) et la protéase (PR) ainsi que des protéines régulatrices et d’interaction avec l’hôte telles que Vpr ou Vpx (Goujon et al., 2007).
Génome viral
Le génome rétroviral est diploïde, formé par deux brins d’ARN mono caténaires d’environ 9,7 kpb (Muesing et al., 1985; Ratner et al., 1985). Il est constitué de trois gènes de structures, gag, pol, env et de six gènes codant pour des protéines d’interaction avec l’hôte (vif, vpr, vpu et nef) et régulatrices (tat et rev) (McCune et al., 1991). Après la transcription inverse, on retrouve de part et d’autre du génome viral une région non codante longue et répétée (Marcello et al., 2004).

Variabilité génétique du VIH

Depuis sa découverte, plusieurs variantes génétiques du virus ont été identifiées. Le VIH appartient aux groupes VIH-1 et VIH-2. Le type 1 est largement majoritaire et disséminé sur l’ensemble du globe alors que le type 2, minoritaire, est localisé principalement en Afrique de l’Ouest et plus modérément en Europe de l’Ouest.

L’écart de virulence entre ces deux souches virales s’explique en partie par une différence au niveau (1) de la vitesse de propagation du virus dans les cellules, (2) de la charge virale dans le sang et les fluides génitaux, (3) du degré d’activation immunitaire et d’apoptose cellulaire chez les individus infectés (Gilbert et al., 2003, Levy et al. ,2007). li est aujourd’hui admis que le VIH-2 est beaucoup moins pathogène que le VIH-1 (Kanki et al., 1994; Gilbert et al., 2003). L’organisation des deux types de VIH est globalement identique excepté la présence du gène vpx pour le VIH-2. On observe également des variations au niveau de certains gènes, notamment env qui présente seulement 42 % d’homologie entre les deux types. Les autres gènes sont globalement identiques.

Les variations au sein des gènes gag, pol, env ont pennis de classer le VIH-1 en trois groupes, le groupe M (majoritaire), lui-même subdivisé en 10 sous-groupes (notés A-J), le groupe 0 (outlier) présent en Afrique de l’Ouest et le groupe N (ni M ni 0) présent au Cameroun. (plantier et al., 2009). Les trois premiers groupes (les M, 0 et N) proviennent de transmissions indépendantes inter-espèces (zoonose) du virus de l’immunodéficience simienne chez le chimpanzé Pan troglodyte troglodyte (SIVcpz) à l’homme (Gao et al., 1999) alors que le groupe P est plus proche du SIV infectant le gorille (Plantier et al., 2009). Le VIH-2, quant-à-Iui est seulement classé en deux groupes A et B et dérive du SIV du singe sooty mangabey (Reeves et al., 2002).

Les facteurs de restriction

Les facteurs de restriction sont un ensemble de protéines anti -rétro virales qui forment un aspect important du système immunitaire inné. Leur expression constitutive permet une réponse immédiate à une infection virale. Parmi les facteurs de restriction identifiés au cours de la dernière décennie, les plus étudiés sont TRIM5a, tétherineIBST-2, APOBEC3G et SAMHD1 . Ces protéines constitutives sont typiquement exprimées à de faibles niveaux permettant une réponse immunitaire immédiate. Par contre, l’expression de ces facteurs peut être régulée à la hausse par les Interférons (lFN) suite à une infection virale (Chan et al., 2014). Les facteurs de restriction identifiés diffèrent grandement au niveau de leur structure, mais ils ont tous été soumis à des niveaux élevés de sélection naturelle au cours d’un processus d’évolution continue aux côtés des agents pathogènes viraux.

L’expression des facteurs de restriction est beaucoup plus répandue qu’on ne le pensait initialement et un large éventail de mammifères expriment ces protéines. Typiquement le VIH-1 , le VIH-2 et le SIV ne sont pas inhibés significativement par les facteurs de restriction de leurs espèces hôtes. Ces rétrovirus ont développé, au cours de leur évolution, des mécanismes pour contourner ces différents mécanismes de restriction. Toutefois, le VIH n’a pas de protéine spécialisée dans la résistance à TRIM5a, ce qui en fait un candidat prometteur pour des approches thérapeutiques (Chan et al., 2014).

Le crible génétique et l’isolation de mutants résistants au VIH-l

Dans ce travail, nous avons utilisé deux cribles génétiques (par évolution moléculaire) in vitro pour identifier et caractériser de nouveaux mutants de TRIM5a ayant une activité de restriction accrue contre le VIH -1. Ces expériences nous ont permis d’identifier deux nouvelles mutations ponctuelles (G330E et R335G) dans la région VI de TRIM5a humain diminuant l’infection du VIH-1 par un facteur de 10, semblable à ce qui a déjà été réalisé par la mutation ponctuelle Arg332 dans cette région. De plus, bien qu’une mutation ponctuelle au niveau de Gly330, Arg332 ou Arg335 permette d’augmenter l’activité de restriction de TRIM5ahu, elle ne suffit pas à restreindre efficacement la réplication du VIH-1. Seule la double mutation en positions 332 et 335 décrite dans cette étude semble conférer une résistance accrue et similaire à son homologue TRIM5a du singe rhésus, l’un des facteurs de restriction le l’lus efficace contre le VIH-1 décrit à ce jour. Étonnamment, alors que les mutations R332G et R335G ont des effets additifs sur la restriction, l’addition de G330E à R332G et/ou R335G semble diminuer légèrement l’activité de restriction contre le VIH-1 par rapport au double mutant R332G1R335G.

Le double mutant R332G-R335G de TRIM5ahu est significativement plus efficace que le simple mutant R332G à inhiber l’infection par le VIH-1 infectieux et à augmenter la survie des cellules génétiquement modifiées (pham et al., 2010; Pham et al., 2013;Veillette et al., 2013, Jung et al., 2015).-La possibilité d’avoir un transgène encore plus actif nous a poussés à réaliser un crible par mutagénèse aléatoire dans la région variable 1 du domaine de reconnaissance de la capside virale de TRIM5ahu. Ceci nous a permis d’identifier une autre mutation, G330E, qui permet de restreindre le VIH-l. Cependant, la combinaison de cette nouvelle mutation avec R332G-R335G n’est pas parvenue à augmenter le potentiel de ce transgène. Au contraire, une réduction de l’efficacité a été observée sous certaines conditions. Le meilleur candidat, R332G-R335G, a donc été retenu pour nos études subséquentes (pham et al., 2013; Veillette et al., 2013).

La résistance virale: le cas de CA-V86M et de CTL

Des mutations de la CA virale au niveau de la Val86 et à d’autres positions confèrent un certain degré de résistance à TRIM5arh (pacheco et al., 2010; SolI et al.,2013; Veillette et al. , 2013). Ces mutations affectent directement la boucle de liaison CypA-CA (V86A et M96I), qui est connue pour jouer un rôle important dans la restriction médiée par TRIM5a (Berthoux et al. , 2004; 2005b; Keckesova et al., 2006;Stremlau et al. , 2006b). Ces résultats soulèvent la possibilité que certaines souches de VIH-1 très divergentes du sous-groupe B, grandement utilisées dans la majorité des études précliniques sur le VIH -1 , puissent échapper à la restriction par nos mutants de TRIM5ahu. Bien que le mutant CA-V86M n’ ait pas été l’objet de mes études, des expériences publiées récemment dans nos laboratoires semblent démontrer que la mutation V86M du VIH-l peut conférer une résistance partielle contre la restriction rétrovirale par TRIM5arh et nos mutants de TRIM5ahu. V86M altèrerait les mécanismes d’interaction entre la CypA et la capside virale, résultant en une augmentation du transport nucléaire de l’ADN du VIH dans des conditions restrictives. Cependant, il est important de noter qu’aucune augmentation de la résistance virale n’a été observée pour nos mutants R322G/R335G lorsque testée sur des virus infectieux (plusieurs cycles d’infection) (Veillette et al., 2013).

Pour comprendre la disparité entre l’effet de V86M sur la restriction des souches réplicatives et non-réplicatives, il est important de noter que la région de la boucle de liaison à CypA de la CA semble être importante pour diverses fonctions virales. n’a été récemment démontré que CypA avait en autre un rôle dans la protection du VIH-1 contre la détection par les capteurs d’ADN cGAS du système immunitaire inné de la cellule (Rasaiyaah et al. , 2013). Dans cette expérience, alors que la mutation P90A de la 96 capside virale procure une résistance à TRlM5a, elle entraîne une augmentation de la sensibilité à cGAS qui conduit à la production de seconds messagers et d’IFN de type l, supprimant ultimement la réplication du VIH -1. Ainsi, les mutations dans la boucle d’interaction CypAlCA, permettant au virus d’échapper à la restriction par TR1M5a conduisent souvent à une diminution de la capacité d’infection et de réplication du virus (Rasaiyaah et al., 2013).

Table des matières

CHAPITRE 1 :INTRODUCTION 
1.1 Le virus de l’immunodéficience humaine 
1.1.1 Épidémiologie et problématique
1.1.2 Structure du VIH
1.1.3 Génome viral
1.1.4 Variabilité génétique du VIH
1.1.5 Le cycle viral
1.2 Les facteurs de restriction
1.2.1 APOBEC3G
1.2.2 TétherinelBST-2
1.2.3 SAMHD 1
1.2.4 TRIM5a
1.3 Hypothèses et objectifs
CHAPITRE II :GENERATION OF HUMAN TRIM5a MUTANTS WITH HIGH HIV-l RESTRICTION ACTIVITY 
2.1 Résumé 
2.2 Premier article scientifique 
Abstract
Introduction
Results
A screen based on random mutagenesis ofTRIM5a
Targeted mutagenesis of Arg332 and Arg335 within PRYSPRY first variable region
Restriction of HIV -1 by wild-type and mutant TRIM5ahu
Restriction of other retroviruses
Restriction of HIV -1 in a T -cellline
Restriction over multiple replication cycles
Discussion
Materials and methods
Cells and plasmids DNAs
Production of retroviral vectors
Library construction
Site-directed mutagenesis
Generation of cells stably expressing TRIM5a variants
Viral challenge
References
CHAPITRE III :A NOVEL AMINOACID DETERMINANT OF HIV-l RESTRICTION IN THE TRIM5a VARIABLE 1 REGION ISOLATED IN A RANDOM MUTAGENIC SCREEN 
3.1 Résumé 
3.2 Deuxième article scientifique
Abstract
Introduction
Material and methods
Plasmid DNAs
Cells and retroviral vectors production
Library construction and screening
Site-directed mutagenesis
Viral challenges
RIV -1 CA-NC expression and purification
In vitro assembly of HIV -1 CA-NC complexes and binding to TRIM5a variants
Structural models ofthe PRYSPRY domain
Results
A vl-focused mutagenic screen
Effect of alternative mutations at Gly330
Combining G330E with mutations at Arg332 or Arg335
In vitro binding analysis
Restriction in other viral and cellular environments
Restriction of a propagating infection
Modeling the effect of V1 mutations on the TRIM5aHu PRYSPRY domain
Discussion
Conclusion
References
CHAPITRE IV :DISCUSSION ET PERSPECTIVES
4.1 Le crible génétique et l’isolation de mutants résistants au VIH-l
4.2 Surexpression de TRIM5a
4.2.1 L’effet dominant négatif
4.2.2 L’activation incontrôlée du système immunitaire
4.2.3 La résistance virale: le cas de CA-V86M et de CTL
4.2.4 Mutation dans la région V1 TRIM5a
4.2.5 Flexibilité conformationnelle de la glycine
4.3 Perspectives 
4.3.1 . Poursuivre le crible génétique
4.3.2 L’implication des mutations sur la structure de PRYSPRY
4.3.3 La thérapie génique exploitant le mutant R332GIR335G de TRIM5a
4.4 Conclusion 

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