Le TBT en milieu marin

Le TBT en milieu marin

L’étoile de mer: un échinoderme

Évolution et écologie

Les étoiles de mer, embranchement des échinodermes, forment un groupe très ancien dont les premières traces fossiles remontent à la période cambrienne (700 millions d’années). Ils dérivent de formes à symétrie bilatérale, les hétérostèles. Les formes les plus anciennes sont sessiles. Ils ont laissé d’abondantes traces, en particulier avec les groupes des crinoïdes (plumes de mer) et des échinoïdes (oursins), présents dès l’ordovicien. Au total 23 classes et 13 000 espèces ont été identifiées (7 classes et 7000 espèces aujourd’hui). L’embranchement comprend 5 classes: les Astéries (Étoiles de mer) et les Ophiurides ou Stelleroidea (Ophiures), les Echinides (Oursins), les Holothurides (Comcombre de mer), les Crinoïdes (Plume de mer).
Ce sont des animaux marins benthiques, présents à toutes les profondeurs océaniques. Ils possèdent un certain nombre de caractéristiques uniques parmi le monde animal. Les principales sont la symétrie radiale et le système aquifère. La forme adulte est organisée autour d’une symétrie pentaradiée. C’est leur forme embryonnaire bilatérale qui les range aux cotés des chordés dans le groupe des deutérostomiens. Les deutérostomiens regroupent les organismes dont la bouch apparaît en second lors de la gastrulation de l’ embryon. De l’ancêtre marin deutérostomien a découlé les phylums hémichordés, échinodermes (phylums uniquement marins) et l’ancêtre des chordés.Grâce à leur structure extérieure calcaire, les échinodermes ne sont en général la proie d’aucun autre animal sauf de certains autres échinodermes (Astéridés). Ils se nourrissent de mollusques, crustacés, et d’autres invertébrés. Ils peuvent également jouer un rôle écologique clé de prédation dans certain écosystème (Boolootian 1966). On les retrouve dans tous les océans, de la zone intertidale aux profondeurs abyssales. Il s’agit souvent du phylum le plus abondant dans les grandes profondeurs. La température est un facteur expliquant la distribution des Astéries. En effet, leur distribution verticale peut être expliquée par leur état sténotherme. La salinité a un rôle décisif dans la restriction de la zone de répartition de l’étoile de mer puisqu’elles sont également sténohalines. Il semblerait que seules les espèces du genre Astéries soient tolérantes aux eaux saumâtres (Boolootian 1966).

L’immunité chez les échinodermes

L’étude comparée des systèmes de défense des vertébrés met en évidence une évolution progressive vers le système immunitaire sophistiqué des mammifères. Les origines phylogéniques du système immunitaire des invertébrés restent obscures, surtout au niveau moléculaire. L’étude des réactions immunitaires non spécifiques peut être approchée par l’étude des invertébrés qui représentent 95 % des espèces animales. Le choix de modèles d’étude reste presque illimité, mais se tourne très souvent vers les arthropodes et les mollusques (protostomiens). Notre compréhension de l’immunité des échinodermes, plus proche d’un point de vue évolutif des vertébrés (deutérostomiens), reste encore limitée (Smith et Davidson, 1994) mais pourtant si importante.

Évolution de l’inimunité

Les réponses immunitaires peuvent être de deux types: réponse innée (naturelle) et/ou réponse acquise (spécifique). La réponse innée sollicite les cellules phagocytaires tels les monocytes, les macrophages et les neutrophiles polynucléaires chez les vertébrés supérieurs.
Il s’agit de la reconnaissance primitive. D’un autre côté il y a les réponses acquises, spécifiques au type de dommage (bactérien, viral) et plus efficace après une deuxième exposition. Les cellules impliquées sont les lymphocytes B et T chez les vertébrés supérieurs.
Lorsque les deux types de réponses innées et acquises sont présents chez un organisme, il y a
interaction entre ces deux types de réponses. En effet, certaines cellules-phagocytes présentent
à leur surface un antigène pour stimuler la réponse acquise. Par la même occasion, des lymphocytes vont sécréter des cytokines stimulant la phagocytose (Roitt et al. 1997). Dans les
paragraphes suivants, l’état des connaissances immunitaires sur les invertébrés et  particulièrement les échinodermes est présenté. On retrouve uniquement une activité immunitaire de type innée chez les échinodermes (Chia et Xing 1996).
Selon Smith et Davidson (1994), les caractéristiques du système immunitaire des échinodermes semblent être un héritage des deutérostomiens. Ainsi, à cause de leur affinité phylogénique, le système de défense des échinodermes est entrevu comme un précurseur du système de défense des Vertébrés. Tous les deutérostomiens présentent une similitude dans leur système de défense naturelle. C’est la réponse cellulaire non spécifique effectuée par une cellule immunitaire: phagocytose, encapsulation, chémotaxie, cytotoxicité, dégranulation de composés bactéricides, de lectines, d’hémolysines, d’hémagglutinines et des réactions de cicatrisation. Tous les invertébrés multicellulaires ont cependant des cellules-phagocytes. La phagocytose est d’ailleurs une caractéristique de la réponse immunitaire présente dans tout le règne animal. Il s’agit de la première ligne de défense interne pour un organisme (Greenberg 1995). Son principe mécanique est resté intact à travers l’évolution. Elle s’effectue en quatre étapes: le chimiotactisme, l’adhésion, l’ingestion et la destruction (figure 4) (Ratcliffe et al 1985).

Immunité adaptative

Les échinodermes ne semblent pas avoir vraiment de mémoire immunitaire (immunité acquise) sauf peut être à court terme. Plusieurs travaux ont permis de démontrer une augmentation de la rapidité du rejet des allogreffes (Chia et Xing 1996). Mais comment ces invertébrés peuvent-ils survivre depuis tant d’années sans système acquis développé? Quelques auteurs ont tenté de répondre à cette énigme et plusieurs hypothèses ont été avancées. Même si les bactéries sont continuellement soumises à l’aléa des mutations, elles conservent toujours des protéines de structures comme les lipopolysaccharides (LPS) permettant leur reconnaissance (Loker et al. 2004). L’activité des cellules immunitaires des oursins est en effet stimulée par la présence des LPS (Courtney Smith et al. 1995). Les invertébrés reconnaîtraient d’ailleurs essentiellement ces structures (Loker et al. 2004).D’autres hypothèses sont cependant présentées pour pallier l’absence de système acquis. Il s’ agit de la collaboration avec un symbiote, ou le mosaïsme, ou encore la production de molécules immunitaires d’une variété surprenante, et pour finir, le mutualisme. Ces systèmes immunitaires adaptés ne semblent cependant pas avoir d’effet significatif sur la défense immunitaire (Loker et al. 2004). L’évolution des échinodermes nous laisse encore beaucoup à découvrir.

Reconnaissance du soi

Selon la revue de Loker et al. (2004), un système de reconnaissance du soi est présent chez les invertébrés, ou plutôt un système de reconnaissance de l’absence du soi. Ainsi, trois classes d’ échinodermes rejettent les greffes venant d’autres individus de la même espèce (Chia et Xing 1996). Le transplant est infiltré par les cellules phagocytaires qui perturbent l’architecture des cellules. En 1972, Hidelman et Dix ont démontré le rejet d’ allogreffes chez l’étoile de mer et le concombre de mer ainsi que l’acceptation d’autogreffes. Cependant, les mécanismes exacts de ce système de reconnaissance sont encore méconnus (Loker et al 2004). La découverte des molécules impliquées dans la reconnaissance du soi permettra de mieux comprendre la spécificité des pathogènes des invertébrés pour leurs hôtes.

Le TBT en milieu marin

En 1986, Goldberg déclarait que le tri(n-)butylétain (TBT) était le toxique le plus puissant rejeté délibérément dans l’océan. Aujourd’hui, 20 ans plus tard, le TBT est toujours un polluant d’actualité. Le TBT, de la classe des organoétains, fait parti de la formule toxique présente dans les peintures antisalissures des bateaux. C’est un biocide très efficace envers les espèces cibles et malheureusement, envers les espèces non ciblées également (de Mora 1996).
Voici dans un premier temps, un survol de la présence mondiale du TBT, puis, l’état des connaissances sur sa toxicité, particulièrement son immunotoxicité et sa cytotoxicité.

Le TBT dans l’environnement

La peinture antisalissure des bateaux est de loin la principale source d’organoétains retrouvés dans le milieu marin (Hashimoto et al. 1998). Les divers compartiments environnementaux, biologiques ou non, sont contaminés par le TBT (Batley 1996). On en retrouve, par exemple, dans les sédiments (St.-Louis et al. 1997 ; Hashimoto et al. 1998 ; Viglino et al. 2004), la colonne d’eau (Viglino 2005), les amphipodes (Takeuchi et al. 2004), les moules et les myes (Barakat 2004), les poissons pélagiquesetnémertaux (Kannan et al. 1995), les foies d’oiseaux marins (Guruge et al. 1997), et les mammifères marins (St-Louis et al. 2000). Le TBT a même été retrouvé dans les organes humains (Kannan et al. 1999 ; Gui-Bin et al. 2000 ;Nielsen et Strand 2002), sans que les effets toxicologiques des concentrations retrouvées sur l’organisme soient connus (Kannan et al. 1999). Malgré la restriction sur l’utilisation des peintures antisalissures à base de TB T, une étude au Japon a montré que sa concentration dans les amphipodes n’avait que très peu diminué en 9 ans. En effet, le polluant était encore présent dans le biote le long des côtes non habitées et peu industrielles (Takeuchi et al. 2004).La législation sur l’utilisation du TBT est très épineuse à cause de la difficulté à démontrer les effets néfastes sur l’homme (Bosselmann 1996). De · plus, l’efficacité du composé dans les peintures antisalissures permet l’économie de centaines de millions de dollars. Alors, malgré son impact important sur des organismes non ciblés, ayant même une valeur commerciale (Goldberg 1986), la réglementation sévère du TBT a tardé. En 1982, la France a été le premier pays à bannir ce toxique des peintures au TBT sur les bateaux de plaisance inférieur à 25 m.Ce bannissement a été suivi par la Grande-Bretagne dès 1987. Depuis, le Canada, les ÉtatsUnis, l’Australie, l’Afrique du Sud et la Nouvelle-Zélande ont adopté le même règlement (Bosselmann 1996). Une diminution de la concentration dans les eaux et les organismes cibles est observée dans les zones qui étaient très contaminées avant les mesures des années 80.
Cette diminution n’est cependant pas présente dans les sédiments (Waite et al. 1991).
L’Organisation Maritime Internationale (OMI) a adopté le bannissement des organoétains pour le 1
er janvier 2008. Déjà, depuis le 1 er janvier 2003, l’OMI a demandé le retrait du TBT des nouveaux composés antisalissures. Cette organisation a été mise en place par l’Organisation des Nations Unies en 1948 dans le but d’élaborer des dispositions relatives à la mer (IMO 2005). Cependant, le TBT continue d’inquiéter les scientifiques puisque, pour l’ instant, son introduction dans l’environnement continue à partir des bateaux de plus de 25 m (de Mora 1996) puisque l’utilisation est toujours permise sur autorisation spéciale, jusqu’en 2008. Il existe évidemment des pays où aucune législation n’existe. De plus, la dégradation du TBT est beaucoup plus faible dans les latitudes froides, où le compartiment sédimentaire est de plus en plus considéré comme une source importante de TBT pour le milieu océanique (Viglino et al. 2004).

La toxicité du TBT

Le comportement du TBT dans les divers compartiments biotiques et abiotiques est très bien documenté dans la littérature scientifique (Fent 1996 ; de Mora 1996 ; Dopp et al. 2004).Nous ne ferons que résumer les principaux effets biologiques du TBT qui portent atteintes à l’ intégrité de l’organisme.Le TBT est un perturbateur endocrinien (MacMaster 2001). Il perturbe la biotransformation des hormones mâles en hormones femelles (Baldwin et LeBlanc 1994, Oberdorster et al. 1998), provoquant la masculinisation des gastéropodes: l’ imposex (Morcillo et al. 1998 ;Matthiessen et Gibbs 1998 ; Alzieu 2000). La présence de l’imposex chez les gastéropodes est, par ailleurs, un indicateur de la contamination au TBT en milieu naturel (Evans et Nicholson 2000).Dans une revue exhaustive sur les organoétains, Fent (1996) résume que le TBT entre en interaction avec les mono-oxygénases des microsomes du foie, induisant l’inactivation de leur
principale composante, les cytochromes P-450, et l’inhibition de l’activité du cytochrome c réductase NAD(p)H. C’est-à-dire que le TBT atteint les enzymes responsables de la détoxification des polluants environnementaux ainsi que le métabolisme des substances endogènes. Les mêmes conclusions ont été rapportées lors d’études in vivo (Fent 1996).De plus en plus d’études suggèrent une neurotoxicité du TBT, peu soupçonnée il y 10 ans (Fent 1996). L’effet néfaste du TBT sur le système nerveux est maintenant évident. En effet, il agit sur la neurotransmission chez le rat (Kishimoto et al. 2001), traverse la barrière hémato-encéphalique chez un poisson (Rouleau et al. 2003). Une exposition à ce polluant engendre également une dépression des neurotransmetteurs et de l’activité des A TPases dans le cerveau chez le rat (Elsabbagh et al. 2002). Et enfin, l’inhibition même de l’aromatase du système enzymatique des P-450, en cas d’exposition au TBT, ne serait pas le facteur primordial de l’induction de l’imposex. Le TBT agirait comme neurotoxique en induisant la sécrétion d’un neuropeptide responsable de l’apparition des organes accessoires mâles directement tandis que l’effet inhibiteur de l’aromatase agirait dans le maintien de l’ imposex (Oberdorster et McClellan-Green 2002).
Le TBT est également un génotoxique. En effet, il génère une perturbation du matériel génétique chez les larves de deux espèces marines, Mytilus edulis et Platynereis dumerilli (Jha et al. 2000). Cette génotoxicité aurait une conséquence néfaste sur le développement de ces espèces (Jha et al. 2000). Le TBT provoque directement une erreur sur le brin de l’ADN chez les hémocytes de moules lors d’une exposition in vivo (Micié et al. 2001).
Le TBT a également un effet sur les différents stades de développement des larves de plusieurs invertébrés marins (Cima et al. 1996 ; Girard et al. 2000 ; Jha et al. 2000). La gastrulation est le stade de développement le plus sensible chez les tuniciers (Cima et al1996). Chez M edulis, il agit directement sur le matériel génétique des larves, ce qui perturbe leur développement (Jha et al. 2000). De plus, chez les oursins, quelques nM de TBT sont suffisants pour induire une perturbation du développement des larves, et ce, indépendamment de la bioaccumulation de l’animal (Girard et al. 2000). Finalement, le TBT est un immunotoxique bien connu (Chia et Xing 1996; Fent 1996). Chez les vertébrés, cet agent supprime les réactions immunitaires dépendantes du thymus sur lequel il semble avoir une action directe au niveau de la prolifération cellulaire (Snoeij et al. 1987).
La résistance spécifique de l’animal est également atteitne (Vos et al. 1984). Lorsque des rats sont exposés à de faibles doses de TBT lors de leur développement intra-utérin, une diminution du poids de la rate et du thymus est observée (Cooke et al. 2004). Un effet immunosupresseur a également été observé chez les poissons (O’Halloran et al. 1998). Chez les invertébrés, l’effet du TBT a beaucoup été étudié sur la phagocytose puisque celle-ci est leur principale fonction immunitaire (Galloway et Depledge 2001). Il a un effet inhibiteur sur la phagocytose des invertébrés marins comme les huîtres (Rice et Weeks 1990 ; Fisher et al 1990), les tuniciers (Cooper et al. 1995) ou encore les bivalves (Cima et al. 1999 ; St.-Jean et al. 2002). L’étoile de mer polaire, L. polaris, semble moins sensible au TBT lors d’exposition in vivo (Békri et Pelletier 2003). Aucune étude de la toxicité du TBT sur les cellules immunitaires, mises à part celles réalisées dans notre laboratoire, n’a été effectuée sur les échinodermes. Le mécanisme d’entrée du TBT dans la cellule reste encore flou puisque certaines études indiquent qu’il pénètre la cellule (Guolan et Yong 1995) et d’autres qu’ il s’insère dans la membrane cellulaire (Gray et al. 1987). Par contre, sa cytotoxicité se dessine parfaitement. Il stimule très clairement l’apoptose chez les vertébrés (Nakata et al. 1999 ; Umebayashi et al 2004) mais aussi chez les invertébrés marins (Micié et al. 2001). Une induction du système enzymatique des caspases, conduisant à l’apoptose, est observée après une exposition à de faibles concentrations de TBT (Stridh et al. 1999). De plus, en perturbant l’homéostasie du calcium, le TBT altère le cytosquelette (Cima et al. 1998). De manière générale, le TBT porte donc atteinte à l’intégrité cellulaire d’espèces aussi différentes que les tuniciers (Cima et al. 1998), la moule (Micié et al. 2001) et l’homme (Stridh et al. 1999). Peu d’ organismes restent apparemment insensibles à sa toxicité mais L. polaris fait partie de ceux là.

Table des matières

INTRODUCTION
1. Les étoiles de mer
a. L’étoile de mer: un échinoderme
i. Évolution et écologie
ii. Caractéristiques
b. L’immunité chez les échinodermes
i. Évolution de l’immunité
ii. Description et rôle des cellules du liquide cœlomique
iii. Immunité innée
iv. Molécules immunostimulantes
v. Immunité adaptative
vi. Reconnaissance du soi
2. Le TBT en milieu marin
a. Le TBT dans l’environnement
b. La toxicité du TBT
3. Les objectifs de cette étude
MATÉRIELS ET MÉTHODES
1. Entretien des astéries
2. Prélèvement du liquide cœlomique 
3. Étape A -Tests en microplaque
a. Préparation des microplaques
b. Exposition cellulaire
c. Test de viabilité cellulaire (VB)
i. Dosage des protéines
iL Métabolisation du FDA
d. Test de phagocytose
i. Marquage des bactéries
iL Phagocytose in vitro
4. Étape B- Test en cytométrie en flux 
a. Exposition cellulaire
b. Test de viabilité cellulaire
c. Test de phagocytose
5. Étape C- Incorporation du TBT 
6. Tests statistiques 
RÉSULTATS
1. Observation de la condition des étoiles
2. Mise au point des méthodes 
a. Adhérence cellulaire
i. Perte cellulaire
ii. Avec exposition au TBT
iii. Concentration en EDTA
b. Température d’incubation
c. La récupération cellulaire
d. Pré-test sur l’incorporation du TBT
3. Résultats obtenus 
a. VB en microplaque
i. Effets et statistiques
ii. CE50
b. Phagocytose en microplaque
c. Phagocytose en cytométrie
I. Viabilité des cellules
ii. La fraction 1 des amœbocytes
Ill. La fraction 2 des amœbocytes
d. Incorporation du TBT
i. Temps d’exposition au TBT
Il. Variation de la concentration d’ exposition au Morin
III . Variation de la concentration en TBT
DISCUSSION
1. La réponse au toxique
a. La viabilité cellulaire
I. Résistance des amœbocytes de l’ étoile de mer polaire au TBT
ii. L’évaluation de la viabilité de la cellule: une approche double pour une meilleure évaluation
b. Le TBT ne semble pas immunotoxique pour L. polaris
c. Toxicité du TBT : hypothèse d’une résistance membranaire
d. La variabilité individuelle peut être induite par de multiples facteurs
e. Le TBT ne semble pas perturber l’adhérence cellulaire
2. Des sous- populations ou une différence mécanique? 
3. La concentration cœlomique en amœbocytes pourrait suivre une tendance saisonnière
4. Un retour sur les méthodes analytiques 
a. Le maintien des cellules s’effectue à basse température
b. La phagocytose et les amœbocytes
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXE A: préparation des solutions
ANNEXE B : mise au point des méthodes
1. Mise au point du test de VB en microplaque
2. Mise au point du test de PHAG en microplaque
a. Arrêt de l’activité phagocytaire
b. Extinction de la fluorescence extracellulaire
c. Cinétique de la phagocytose
3. Mise au point du test de la phagocytose en cytométrie
a. Cinétique de la phagocytose
b. Conditions d’incubation

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