Le système nerveux

Le système nerveux

Matériel et méthode

Constructions de CaMKII-GFP et de NR2B

La CaMKII a été étiquetée avec une GFP contenant une mutation (A207K) empêchant la dimérisation de la GFP. De plus, différents mutants de la CaMKII sauvage (WT) ont été utilisés afin de comprendre l’effet de la structure de la CaMKII sur ses dynamiques spatiales et temporelles. Ainsi, le mutant 1-326 contient seulement le domaine catalytique de la CaMKII étiquetée avec une GFP (A207K). Le mutant T305/306D de la CaMKII a également été utilisé en fonction de son incapacité à lier et à être activé par la calmoduline. D’autres mutants de la CaMKII ont été utilisés pour mesurer l’auto-association de la CaMKII ou son interaction avec NR2B : T286A, T286D, I205K, A302R, T305/306A, T286/287D, 286D-305/306A et 315-478 (domaine d’association seulement). La description détaillée de ces mutants a été publiée (Yang et Schulman, 1998). De plus, pour tester l’interaction avec NR2B, la sous-unité NR2B a été transfectée avec la GFP-CaMKII (Bayer et al., 2001).

Culture, transfection, stimulation et fixation des cellules HEK

Les cellules HEK ont été cultivées et transfectées tel que décrit dans une publication précédente (Bayer et al., 2001). Le lendemain de la transfection les cellules ont été mises en culture sur des lamelles d’aclar. Le surlendemain de la transfection les cellules ont été lavées dans du PBS (20mM) sans Ca2+ pendant 1 minute, soumises au protocole de stimulation puis immédiatement fixées. La stimulation pour l’auto-association utilise une solution extracellulaire (20 mM HEPES, 140 mM KC1, 2 ÏÏIM CaCl2, 5 ITIM NaCl, 1 mg/ml glucose, pH 6.5 ou 7.5). Le protocole d’auto-association consiste à faire une première stimulation visant à tamponer le pH à 7.5 avec la nigericine lOug/ml (1 :1000 d’un stock dans le méthanol) pendant 3 minutes, à faire une seconde stimulation visant à faire entrer le calcium avec de l’ionomycine 10uM (1 :1000 d’un stock dans le méthanol) à pH 7.5 en présence de nigericine pendant 3 minutes et à faire une troisième stimulation visant à abaisser le pH à 6.5 (avec nigericine et ionomycine) pendant 3 minutes. Les stimulations contrôles utilisent le même protocole de stimulation mais avec des solutions où le Ca2+ a été omis. Le protocole de stimulation pour l’interaction à NR2B utilise une solution de HBSS (plus 25 mM HEPES, pH 7.4, avec 2 mM CaCb) contenant de l’ionomycine lOuM pendant 5 minutes avec un contrôle sans Ca2+.

Immunocytochimie

La localisation de NR2B a été révélée par immunocytochimie sur des cellules HEK transfectées, fixées avec de la paraformaldéhyde (PFA), lavées quatre fois dans du PBS, incubées dans une solution de blocage pendant 30 minutes (3% goat sérum et triton 0.05%), incubées avec anti-NR2B (1 :500 dans solution blocage) (Zymed) pendant 2h, lavées trois fois dans du PBS, incubées avec un anti-corps secondaire couplé à un alexa 546 (GaR546) et lavées trois fois avant d’être montées sur lame.

Microsopie confocale

Des images des cellules HEK ont été obtenues avec un microscope confocal Zeiss (Thornwood, NY) LSM510 META-Axioskop FS2 Plus équipé d’un objectif 63x d’immersion à l’huile (1.4 NA). Pour mesurer l’auto-association, des images 12-bits (1024×1024 pixels de O.lum x O.lum) ont été acquises de façon aléatoire avec comme seul critère d’avoir au moins 4 cellules fluorescentes dans le champ de vision. La GFP a été excitée avec un laser Argon (488nm) et détectée à travers un filtre long-pass (LP505) avec une ouverture de diaphragme de manière à donner une tranche optique de 0.5um sélectionnée au milieu des cellules.

Analyse des images

Les images ont été analysées avec le programme Metamorph dans lequel la plupart des procédures ont été automatisées. D’abord les cellules ont été isolées en images séparées, puis la fluorescence de chaque cellule a été séparée avec un seuil correspondant à trois fois la moyenne de la fluorescence totale. Cette fluorescence séparée a ensuite été utilisée pour la détection d’agrégats de fluorescence en utilisant un filtre morphométrique où un agrégat correspond à un groupe contigu de pixels correspondant à une aire de 0.1 à 1 u.m2 et dont le facteur forme (4*A/P2; A, aire; P, périmètre) >0.5 . Le facteur d’agglomération correspond à la fluorescence totale contenue dans les agrégats identifiés divisée par la fluorescence totale de la cellule.

Cultures, transfections et imagerie de neurones

Les expériences de FRAP ont été effectuées sur des neurones d’hippocampes de rat cultivés pendant deux semaines (12-16 jours) sur des lamelles d’Aclar (Bayer et al, 2001; Hudmon et al., 2005). La veille de l’expérience, les neurones ont été transfectés en matinée avec l’ADN de GFP-CaMKII (0.5ug) sauvage ou muté et de la lipofectamine 2000 (2ul). Par la suite (5h après), le milieu de transfection a été remplacé par du milieu neuf contenant ou non de l’AP-5 (100 U.M). Pour l’expérience de FRAP, une lamelle a été placée dans un bain perfusé avec une solution de blocage (HBSS, plus 10 ÏÏIM HEPES, pH 7.4, 0.6 mM CaCb , 5 ITIM MgCb). Les expériences avant stimulation ont été effectuées dans cette solution alors que les expériences après stimulation ont été effectuées après un lavage (solution de blocage) de 5, 10, 15, 20 ou 25 minutes suivant une stimulation de 2 minutes avec glutamate (100 U.M) et glycine (10 U.M) dans une solution régulière (HBSS, plus 10 mM HEPES, pH 7.4, 1.2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2).
Les expériences de FRAP ont été réalisées sur le LSM510 META (objectif 63x à l’eau), selon la procédure suivante : D’abord, un neurone possédant une fluorescence principalement diffuse avec plusieurs épines visibles est sélectionné et imagé. Ensuite, un segment de dendrite est sélectionné et des régions d’intérêt (circulaire, 10 pixels de diamètre) sont tracées sur 2 à 4 épines ou sur deux régions éloignées d’une dendrite. Une expérience de FRAP est réalisée en prenant 3 images du dendrite sélectionné (pré-photoblanchiment) à faible intensité où la GFP est excitée avec une ligne de laser Argon 488nm (0.25% transmission) et détectée à travers un filtre bande passante (500-550nm) ; pour chaque image, deux acquisitions sont moyennées et la résolution est réglée pour donner une grosseur de pixel de 0.15um x 0.15um. Immédiatement après la troisième image, les régions d’intérêts sont photoblanchies en les balayant 50 fois à la transmission maximale du laser pour une durée totale de photoblanchiment d’une à trois secondes. Suite au photoblanchiment, le recouvrement de fluorescence a été mesuré pendant 200 secondes (60 image/minute) ou pendant 500 secondes (12 image/minute) et l’intensité moyenne pour chaque région a été mesurée pour chaque image.

Analyse du FRAP

Les intensités mesurées pour chaque région ont été normalisées avec la fonction F(t) = Ft-FpOSt/Fpre-Fpost où Fpre est la fluorescence moyenne de la région sur les trois images avant le photoblanchiment et Fpost est la fluorescence de la région immédiatement après le photoblanchiment. Cette normalisation permet d’obtenir une forme fractionnelle de la courbe de recouvrement de la fluorescence, ce qui permet de rendre le recouvrement de fluorescence indépendant de la fluorescence initiale ou de la quantité de photoblanchiment induite (Soumpasis, 1983). La moyenne, la déviation standard et l’erreur standard ont été calculées pour chaque point en considérant toutes les expériences de FRAP d’une même condition. Les valeurs moyennes d’intensité normalisée de chaque point en fonction du temps ont été tracées avec l’erreur standard comme barre d’erreur et les données ont été modélisées par régression avec différentes fonctions exponentielles (voir section résultats) avec Igor Pro. Les régressions consistent à trouver les meilleures valeurs pour chaque coefficient des fonctions exponentielles utilisées afin de minimiser les valeurs de x2 où est défini comme X2 = S [(y-yO/ ai]2 où y est une valeur de régression obtenue pour un point donné, y, est la valeur mesurée de ce point et GJ est l’estimé de la déviation standard pour yj.

Table des matières

D- Introduction 
D1 – Le système nerveux
D2- Le neurone
D3- Les synapses
D4- La plasticité synaptique
D5- L’épine post-synaptique
D6-La CaMKII
D7- La CaMKII : sa structure et son activation
D8- La CaMKII : ses auto-phosphorylations
D9- La CaMKII : ses interactions protéiques
D10- La CaMKII : ses interactions au récepteur NMDA
DM- La CaMKII : son auto-association
D12- La CaMKII : sa localisation synaptique et ses changements de localisation
D13- La CaMKII : les enjeux de la régulation de sa localisation
E- Matériel et méthodes 
El-Constructions de CaM Kl I-GFP et de NR2B
E2- Culture, transfection, stimulation et fixation des cellules HEK
E3- Immunocytochimie
E4- Microscopie confocale
E5- Analyse des images
E6- Cultures, transfections et imagerie de neurones
E7-Analyse du FRAP
F- Résultats 
FI- La CaMKII translocalise dans le neurone suite à l’activation des récepteurs NMDA
F2- L’interaction de la CaMKII avec le récepteur NMDA (via NR2B) dépend d’une élévation de la concentration de calcium
F3- L’auto-association de la CaMKII dépend d’une élévation de la concentration de calcium et d’une baisse de pH
F4- L’auto-association de la CaMKII dépend de la structure multimérique de la CaMKII, de l’activation par le Ca2+/CaM et d’interactions du domaine catalytique, mais est inhibée par l’auto phosphorylation de laT286
F5- L’auto-phosphorylation de la thréonine 286 de la CaMKlI diminue son auto-association mais des CaMKII auto-phosphorylées sont présentes dans les agrégats de CaMKII auto-associées
F6- Le FRAP permet de mesurer la mobilité de protéines dans les épines de neurones en culture
F7- FRAP de laGFP-CaMKII dans les épines de neurones en culture
F8- Caractérisation de l’étendue du photoblanchiment lors du FRAP
F9- Des protéines de différentes grosseurs ont des mobilités différentes dans les épines de neurones en culture
F10- Interprétation de la courbe du FRAP de la GFP-CaMKII dans les épines
Fil- Interprétation de la courbe du FRAP de la GFP-CaMKII 1-326 dans l’épine
FI2- Interprétation de la courbe du FRAP de laGFP dans l’épine
FI 3- La mobilité des protéines dépend de la morphologie compartimentée du neurone
F14- L’activation transitoire des récepteurs NMDA induit des changements pour la mobilité des protéines (GFP) dans l’épine post-synaptique
F15- L’effet de l’activation transitoire des récepteurs NMDA sur la mobilité de la CaMKII dans : – L’épine post-synaptique
– La dendrite
FI6- L’activation transitoire des récepteurs NMDA modifie la mobilité de la CaMKII 1-326 dans l’épine
G- Discussion 5
Gl- Étude des interactions de la CaMKII
G2- Étude de la mobilité de la CaMKII
H- Conclusion
Bibliographie

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