Soutenance mémoire
Le système nerveux
La CaMKII translocalise dans le neurone suite à l’activation des récepteurs NMDA Il a été démontré que suite à une activation des récepteurs NMDA, la GFP-CaMKII se concentre à différents endroits dans les dendrites et le corps cellulaire de neurones en culture dissociée ou en tranche de tissu maintenue in vitro (Shen et meyer, 1998; Hudmon et al, 2005; Bayer et al, 2006; Otmakhov et al, 2004). La figure 1, tirée de notre article (Hudmon et al., 2005), montre la translocalisation de GFP-CaMKII dans des neurones en culture. Ainsi, les neurones sont d’abord placés dans une solution de blocage (5mM Mg2+, 0.6mM Ca2+) où la fluorescence est principalement diffuse dans le neurone avec une légère concentration dans les épines post-synaptiques .Cette accumulation de la fluorescence dans les synapses est due à l’activité intrinsèque des neurones et de leurs récepteurs NMDA en culture (Bayer et al, 2006). Il est possible de diminuer cette prétranslocalisation par une incubation des neurones avec un antagoniste des récepteurs NMDA (AP5). Pour causer la translocalisation de la CaMKII, les neurones sont stimulés avec une solution régulière (ImM Mg2+, 1.2mM Ca2+) contenant du glutamate (lOOuM) et de la glycine (lOuM) pendant deux minutes. Suite à la stimulation, on peut observer un enrichissement de la fluorescence GFP-CaMKII dans les synapses (Figure 1B). Si la stimulation est plus longue (2-5 min), on peut aussi observer une translocalisation extrasynaptique de la GFP-CaMKII où des agrégats de fluorescence se produisent également dans le corps cellulaire des neurones. Afin de déterminer quelles interactions moléculaires peuvent contribuer à la translocalisation de la CaMKII dans les neurones, nous avons testé deux hypothèses : 1) la sous-unité NR2B du récepteur NMDA permet de concentrer la GFP-CaMKII dans des compartiments subcellulaires où cette sous-unité est présente et 2) l’interaction de plusieurs CaMKII ensemble permet de concentrer la CaMKII dans des agrégats dans la cellule incluant la synapse. Ces deux types d’interaction ne sont sans doute pas les seuls pouvant contribuer à la translocalisation de la CaMKII dans les neurones et d’autres protéines pourraient être impliquées dans ce phénomène.
L’interaction de la CaMKII avec le récepteur NMDA (via NR2B) dépend d’une élévation de la concentration de calcium Nous avons utilisé les cellules HEK (human embryogénie kidney cells) pour étudier les propriétés d’interaction de la CaMKII et de NR2B puisque ces cellules sont dépourvues des composants cellulaires strictement neuronaux. Pour étudier l’interaction de la CaMKII avec NR2B, nous avons tirés profit de la localisation subcellulaire périnucléaire de NR2B afin de visualiser l’interaction par un changement de la localisation de la fluorescence de la CaMKII. Notre hypothèse, qui se base sur des travaux déjà publiés (Bayer et al., 2001),postule que l’interaction de la CaMKII avec NR2B dépend, tout comme la translocalisation de la CaMKII à la synapse, d’une entrée de calcium dans la cellule. Ainsi, les cellules HEK co-transfectées avec GFP-CaMKII et NR2B ont été stimulées par un ionophore, l’ionomycine qui crée des pores perméables au Ca2+ dans la paroi cellulaire, en présence ou en absence de calcium, pendant 5 minutes. Immédiatement après la stimulation, les cellules on été fixées et la localisation de NR2B a été révélée par immunocytochimie.
Lorsque les cellules sont stimulées avec Ca2+, la fluorescence de la GFP-CaMKII adopte une localisation majoritairement périnucléaire qui colocalise avec NR2B (Figure 2). Ainsi, l’interaction de la CaMKII avec NR2B dépend d’une activation due au Ca2+ puisque que la GFP-CaMKII se distribue diffusément dans le cytoplasme après la stimulation contrôle sans Ca2+. Le mutant T286A est incapable de se s’auto-phosphoryler à T286 et d’être autonome par rapport au Ca +. Ce mutant colocalise avec NR2B suite à une stimulation avec Ca2+ ce qui montre que Pauto-phosphorylation de la T286 de la CaMKII n’est pas nécessaire pour l’interaction de la CaMKII avec NR2B. Le mutant T286D mime une autophosphorylation irréversible de la T286 de la CaMKII. Ce mutant colocalise aussi avec NR2B suite à une stimulation avec Ca2+ ce qui montre que l’auto-phosphorylation de la T286 de la CaMKII n’empêche pas l’interaction de la CaMKII avec NR2B. Le mutant I205K possède une mutation située dans le site de liaison du substrat où la charge de la lysine empêche des interactions hydrophobes de la CaMKII avec ses substrats. Ce mutant ne change pas sa localisation et il n’y a aucun enrichissement de fluorescence colocalisant avec NR2B après la stimulation avec Ca2+ ce qui suggère que la CaMKII I205K n’interagit pas avec NR2B.
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Constructions de CaM Kl I-GFP et de NR2B |
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Table des matières
A- Résumé
B- Avant propos
C- Table des matières
C1 – Liste des figures VI
D- Introduction
D1 – Le système nerveux
D2- Le neurone
D3- Les synapses
D4- La plasticité synaptique
D5- L’épine post-synaptique
D6-La CaMKII
D7- La CaMKII : sa structure et son activation
D8- La CaMKII : ses auto-phosphorylations
D9- La CaMKII : ses interactions protéiques
D10- La CaMKII : ses interactions au récepteur NMDA
DM- La CaMKII : son auto-association
D12- La CaMKII : sa localisation synaptique et ses changements de localisation
D13- La CaMKII : les enjeux de la régulation de sa localisation
E- Matériel et méthodes
El-Constructions de CaM Kl I-GFP et de NR2B
E2- Culture, transfection, stimulation et fixation des cellules HEK
E3- Immunocytochimie
E4- Microscopie confocale
E5- Analyse des images
E6- Cultures, transfections et imagerie de neurones
E7-Analyse du FRAP
F- Résultats
FI- La CaMKII translocalise dans le neurone suite à l’activation des récepteurs NMDA
F2- L’interaction de la CaMKII avec le récepteur NMDA (via NR2B) dépend d’une élévation de la concentration de calcium
F3- L’auto-association de la CaMKII dépend d’une élévation de la concentration de calcium et d’une baisse de pH
F4- L’auto-association de la CaMKII dépend de la structure multimérique de la CaMKII, de l’activation par le Ca2+/CaM et d’interactions du domaine catalytique, mais est inhibée par l’auto-phosphorylation de laT286 22
F5- L’auto-phosphorylation de la thréonine 286 de la CaMKlI diminue son auto-association mais des CaMKII auto-phosphorylées sont présentes dans les agrégats de CaMKII auto-associées
F6- Le FRAP permet de mesurer la mobilité de protéines dans les épines de neurones en culture
F7- FRAP de laGFP-CaMKII dans les épines de neurones en culture
F8- Caractérisation de l’étendue du photoblanchiment lors du FRAP
F9- Des protéines de différentes grosseurs ont des mobilités différentes dans les épines de neurones en culture 38 F10- Interprétation de la courbe du FRAP de la GFP-CaMKII dans les épines
Fil- Interprétation de la courbe du FRAP de la GFP-CaMKII 1-326 dans l’épine
FI2- Interprétation de la courbe du FRAP de laGFP dans l’épine
FI 3- La mobilité des protéines dépend de la morphologie compartimentée du neurone
F14- L’activation transitoire des récepteurs NMDA induit des changements pour la mobilité des protéines (GFP) dans l’épine post-synaptique
F15- L’effet de l’activation transitoire des récepteurs NMDA sur la mobilité de la CaMKII dans : – L’épine post-synaptique
– La dendrite
FI6- L’activation transitoire des récepteurs NMDA modifie la mobilité de la CaMKII 1-326 dans l’épine
G- Discussion
Gl- Étude des interactions de la CaMKII
G2- Étude de la mobilité de la CaMKII
H- Conclusion
I- Bibliographie
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