Le système GABAergique

Les astrocytes constituent la principale population de cellules gliales du système nerveux central (SNC). Depuis le milieu du XIXe siècle, où le tissu nerveux non-neuronal fut qualifié de « glue » par Virshow, et jusqu’à ces dernières années, les astrocytes ont été considérés comme des éléments de soutien relativement passifs ; une population de cellules homogènes capables de réguler l’homéostasie du réseau neuronal, de relayer la synthèse de protéines de la matrice extracellulaire, de molécules d’adhésion ou de facteurs trophiques, de contrôler la maturation neuronale et synaptique, et d’apporter le soutien métabolique indispensable au cerveau (Wang and Bordey, 2008). Avec le développement des outils électrophysiologiques, de biologie cellulaire, d’imagerie ou de génétique, il apparaît que les astrocytes représentent en réalité une population cellulaire hétérogène, pour laquelle on observe l’émergence de nouvelles fonctions, i.e. l’organisation de l’architecture synaptique, le contrôle de la prolifération des cellules souches neurales et la régulation du flux sanguin cérébral (Wang and Bordey, 2008). Bien que l’hypothèse de changements locaux de l’activité cérébrale couplés à la perfusion ait été apportée par Roy et Sherrington en 1890, ce n’est qu’au cours des 10 dernières années que l’interface entre le SNC et le système vasculaire − l’unité neurovasculaire − a été explorée et caractérisée. En effet, les astrocytes dits « protoplasmiques » de la substance grise, hautement polarisés, sont capables de contacter ou de projeter vers les synapses et/ou les vaisseaux sanguins cérébraux, ce qui leur permet d’intégrer et de co-réguler les activités synaptiques et les apports métaboliques .

Au sein de l’unité neurovasculaire, la perception de ces activités par les astrocytes s’opère via l’activation de canaux ioniques tels que le récepteur GABAA, de récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPG) ou de transporteurs, responsables d’une dépolarisation membranaire et/ou d’une augmentation de la concentration cytosolique de calcium ([Ca2+]c) . A l’heure actuelle, on estime que cette dynamique intracellulaire calcique représente le mode d’excitabilité des astrocytes relayé par des RCPG spécifiquement couplés aux protéines Gq/11 (Nimmerjahn, 2009), relayant la production d’inositols 1,4,5 trisphosphate (IP3) et l’activation des pools de calcium du réticulum endoplasmique (RE) (Figure 1). En conditions physiopathologiques, i.e. l’hémorragie sousarrachnoïdienne, l’ischémie cérébrale, l’hypertension ou les lésions traumatiques, la réaction des astrocytes, ou « astrogliose réactionnelle », se manifeste via des altérations caractéristiques de l’expression et de l’organisation des filaments gliaux, une hypertrophie cellulaire progressive, la prolifération et enfin, dans certains cas, la formation d’une glie cicatricielle. L’origine de ces astrocytes proliférants n’est pas bien comprise et pourrait inclure les astrocytes matures qui ré-entrent dans le cycle cellulaire, ainsi que des progéniteurs neuraux du parenchyme local ou des zones ventriculaires, considérés eux-aussi comme des astrocytes indifférenciés. Parmi les acteurs de régulation de l’astrogliose réactionnelle, les stimulateurs vasoactifs de la prolifération cellulaire tels que le vascular endothelial growth factor (VEGF) et l’endothéline jouent un rôle majeur. Dans ces conditions de prolifération astrocytaire, la disparition de l’expression fonctionnelle de l’aquaporine 4 (Koyama and Tanaka, 2010) ou du récepteur GABAA (Tateishi et al., 2007) semble associée aux effets de peptides vasoactifs surexprimés après des lésions post ischémiques.

Le Système GABAergique 

Le GABA est le principal neurotransmetteur inhibiteur du SNC et joue de ce fait un rôle majeur dans la modulation de l’activité neuronale. Les effets du GABA sont principalement relayés par 2 types de récepteurs, dénommés récepteurs GABAA et GABAB. Le récepteur GABAA est un récepteur ionotropique, perméable aux ions chlore, tandis que le récepteur GABAB est un RCPG hétéromérique, formé par l’assemblage de deux sous-unités GABAB1 (GB1a ou GB1b) et GABAB2 (Kaupman et al., 1997 ; Goei et al., 1998 ; Grifa et al., 1998), qui contrôle l’activité de l’adénylyl cyclase et régule l’ouverture de canaux calciques et potassiques (Bormann, 1988 ; Bowery, 1993 ; Misgeld et al., 1995 ; Rabow et al., 1995 ; Kaupmann et al., 1997 ; Bowery and Brown, 1997).

Structure du récepteur GABAA

Le récepteur GABAA est un complexe hétéro-oligomérique composé de 5 sous-unités protéiques dont l’organisation pseudo-symétrique délimite un pore central perméable majoritairement aux ions chlore. Ce récepteur appartient à la superfamille des récepteurscanaux à « boucle cystéine », appelée ainsi en raison de la présence d’un motif conservé contenant une paire de cystéines reliée par un pont-disulfure, dans la région N-terminale (Nterm) extracellulaire de chaque sous-unité (Schofield et al., 1987 ; Simon et al., 2004). Chez les vertébrés, cette famille de canaux ioniques regroupe les récepteurs glycinergiques (Barker and Ransom, 1978 ; Grenningloh et al., 1987 ; Breitinger and Becker, 2002), les récepteurs cholinergiques nicotiniques (Noda et al., 1983 ; Corringer et al., 2000 ; Lukas and Bencherif, 2006), le récepteur sérotoninergique 5-HT3 (Maricq et al., 1991 ; Davies et al., 1999 ; Thompson and Lummis, 2006), ainsi qu’un canal ionique spécifiquement activé par le zinc (Zn2+) (Davies et al., 2003). Tous ces récepteurs sont des pentamères dont les sous-unités possèdent entre elles au minimum 30% d’homologie de séquence en acides aminés.

Sous-unités du récepteur GABAA

Le criblage d’une banque d’ADNc de cerveau de bœuf a conduit aux premières caractérisations moléculaires des sous-unités du récepteur GABAA et ainsi au clonage des deux premières sous-unités dénommées α et β (Sigel and Barnard, 1984 ; Schofied et al., 1987). Les résultats du séquençage complet du génome humain (International Human Genome Sequencing Consortium, 2004) suivi d’une analyse in silico (Simon et al., 2004), permettent de conclure à l’existence, chez les Mammifères, de 19 gènes codant des sousunités distinctes du récepteur GABAA, réparties en 8 classes (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π et ρ1-3). Les différentes classes possèdent généralement 20 à 30% d’identité de séquence en acides aminés, contre 70 à 80% entre les isoformes de chaque classe (Figure 2) (Barnard et al., 1998 ; Hevers and Luddens, 1998 ; Bonnert et al., 1999 ; Darlison et al., 2005). La diversité moléculaire au sein des isoformes de sous-unités est encore accrue par le processus d’épissage alternatif, qui permet de générer des formes longues (L) et courtes (S) des sous-unités α5 (Kim et al., 1997), α6 (Korpi et al., 1994), β2 (Harvey et al., 1994), β3 (Kirkness and Fraser, 1993), β4 (Bateson et al., 1991), γ2 (Whiting et al., 1990 ; Kofuji et al., 1991) et γ3 (Poulsen et al., 2000). L’arbre phylogénétique des séquences de vertébrés révèle qu’une sous unité ancestrale d’un pseudo-récepteur GABAA a donné naissance à deux clades classés en sousunités (Figure 2), sensibles (α, γ et ε) ou non sensibles (β, θ, δ, π et ρ) aux benzodiazépines (BZ), des agents pharmacologiques exogènes modulateurs allostériques de la fonction GABAergique (Ortells and Lunt, 1995 ; Xue, 1998 ; Martyniuk et al., 2007). De plus, l’analyse phylogénétique réalisée par Martyniuk et al. (2007) démontre que les sous-unités ε et θ, spécifiques des Mammifères (Davies et al., 1997a ; Wilke et al., 1997 ; Whiting et al., 1997 ; Bonnert et al., 1999), dérivent respectivement des sous-unités γ4 et β4 clonées chez les oiseaux, les reptiles et les poissons (Bateson et al., 1991 ; Lasham et al., 1991 ; Harvey et al., 1993 ; Darlison et al., 2005 ; Thode et al., 2008). La majorité des sous-unités sont regroupées au sein de mêmes portions de gènes sous forme de clusters (Simon et al., 2004). Ainsi, chez l’Homme, des tandems de gènes des sous-unités γ1-α2-α4-β1, β2-α6-α1-γ2, ρ1-ρ2, β3-α5-γ3 et εα3-θ sont localisés sur les loci chromosomiques situés en 5q34, 15q13, 4p12, Xq28 et 6q15 respectivement. En revanche, les gènes codant les sous-unités π, ρ3 et δ sont quant à eux isolés, et localisés sur les loci chromosomiques 5q35, 3q12 et 1p36 (Figure 2) (Simon et al., 2004).

Toutes les sous-unités possèdent un large domaine Nterm extracellulaire constitué de 220 à 250 acides aminés, présentant 3 sites potentiels de N-glycosylation et une boucle peptidique formée par un pont disulfure reliant deux résidus cystéine conservés. Cette séquence est suivie de 4 domaines transmembranaires (DTM1-DTM4) hydrophobes structurés en hélice α, les DTM3 et DTM4 étant connectés par une large boucle intracellulaire variable (125 acides aminés), dont les séquences regroupent de nombreux sites consensus de phosphorylation et d’interaction spécifiques à des protéines cytosoliques régulatrices (Kittler and Moss, 2003 ; Lüscher and Keller, 2004). Les sous-unités possèdent une masse moléculaire apparente de 40 à 50 kDa, dont l’organisation spatiale est hautement conservée d’une sous-unité à l’autre  .

Assemblage et stœchiométrie des sous-unités du récepteur GABAA

L’observation en microscopie électronique de récepteurs purifiés à partir de cerveau de Porc, la comparaison de courbes dose-réponse réalisées sur des complexes recombinants formés de sous-unités sauvages et/ou mutées, et les études de Western blot ont permis de mettre en évidence l’association des différentes sous-unités du récepteur GABAA en pentamère (Figure 3) (Nayeem et al., 1994 ; Chang et al., 1996 ; Tretter et al., 1997). De nombreuses études révèlent que l’assemblage de sous-unités α et β est suffisante pour former un pentamère fonctionnel (Sieghart, 1995 ; Bencsits et al., 1999 ; Olsen and Sieghart, 2008). Cependant, il est désormais clairement établi que la grande majorité des récepteurs GABAA se composent de 3 types de sous-unités, i.e. α et β associées à une ou plusieurs sous-unités γ, δ, ε, θ et/ou π (Olsen and Sieghart, 2009). Les premières études, basées sur l’utilisation d’anticorps spécifiques, ont ainsi révélé que la combinaison la plus abondante rencontrée dans le cerveau était formée des sous-unités α1, β2 et γ2 (McKernan and Whiting, 1996 ; Sieghart and Sperk, 2002 ; Whiting, 2003 ; Benke et al., 2004). L’hypothèse selon laquelle le récepteur GABAA serait préférentiellement formé par l’assemblage de 2α+1β+2γ est étayée par des expériences montrant que la mutation des acides aminés chargés localisés en bordure du canal, dans une région homologue des sous-unités α3, β2 et γ2, modifie le degré de rectification sortante du courant évoqué par le GABA (Backus et al., 1993). Des travaux démontrant la coexistence au sein d’un même complexe de 2 isoformes des sous-unités α, mais aussi γ (α1α2, α1α3, α1α5, α1α6, α2α3, α3α5, γ2γ3, γ2Lγ2S), et d’une seule isoforme de la sous-unité β, confortent cette hypothèse (Duggan et al., 1991 ; Lüddens et al., 1991 ; Zezula and Sieghart, 1991 ; Mertens et al., 1993 ; Khan et al., 1994 ; Quirk et al., 1994 ; Li and De Blas, 1997 ; Fisher and Macdonald, 1997 ; Benke et al., 2004 ; Minier and Sigel, 2004). Cette hypothèse est cependant controversée puisque des données obtenues par immunoprécipitation (Tretter et al., 1997), Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET ; Farrar et al., 1999), ou l’utilisation de sous-unités liées en tandem (Baumann et al., 2001, 2002 ; Boileau et al., 2005 ; Baur et al., 2006) suggèrent une stœchiométrie de type 2α+2β+1γ, avec un agencement au sein du pentamère de type βαγβα (Baumann et al., 2001, 2002). De plus, des données de co-immunoprécipitation rapportent l’existence de 2 isoformes de β au sein d’un même complexe (Li and De Blas, 1997 ; Jechlinger et al., 1998). Dans de rares cas, 4 classes différentes peuvent être représentées au sein d’un même complexe, comme par exemple les sous-unités π et θ qui sont capables de s’assembler aux sous-unités α, β et γ (Bonnert et al., 1999 ; Neelands and Macdonald, 1999 ; Neelands et al., 1999 ; Sieghart and Sperk, 2002). Certaines sous-unités peuvent former des homomères fonctionnels, notamment les sous unités β qui, lorsqu’elles sont assemblées, délimitent un canal chlore capable de s’ouvrir spontanément (Sigel et al., 1989 ; Krishek et al., 1996 ; Cestari et al., 1996; Miko et al., 2004), et les sous-unités ρ formant un récepteur de pharmacologie particulière (Hackam et al., 1997 ; Koulen et al., 1998). Des études réalisées sur des récepteurs recombinants exprimés par des ovocytes de Xénope ou sur des récepteurs natifs neuronaux ont toutefois démontré que ces sous unités ρ pouvaient s’assembler à γ2 et/ou α1 et ainsi former des hétéromères de récepteurs fonctionnels (Qian and Ripps, 1999 ; Milligan et al., 2004 ; Pan and Qian, 2005).

Table des matières

Introduction
Chapitre 1 : Le système GABAergique
1. Structure du récepteur GABAA
1.1. Sous-unités du récepteur GABAA
1.2. Assemblage et stœchiométrie des sous-unités du récepteur GABAA
1.3. Topologie du canal chlore associé au récepteur GABAA
1.3.1. Ouverture du canal
1.3.2. Caractéristiques électrophysiologiques du courant évoqué par le GABA
1.4. Localisation des sous-unités
2. Modulation de la fonction du récepteur GABAA
2.1. Régulation allostérique par les ligands extracellulaires
2.1.1. Les benzodiazépines
2.1.2. Les anesthésiques
2.1.3. Les neurostéroïdes
2.1.4. L’éthanol
2.1.5. Les ions
2.2 Régulation par des mécanismes intracellulaires
2.2.1. La phosphorylation du récepteur GABAA
2.2.2. Régulation du récepteur GABAA par des protéines partenaires
Chapitre 2 : Le système urotensinergique
1. L’urotensine II et l’urotensin II-related peptide
1.1. Les gènes de l’UII et de l’URP
1.2. Structures de l’UII, de l’URP et de leur précurseur
1.3. Localisations périphérique et centrale de l’UII et de l’URP
1.3.1. Localisation périphérique
1.3.2. Localisation dans le système nerveux central
2. Le récepteur de l’urotensine II ou UT
2.1. Caractérisation de l’UT
2.2. Structure et pharmacologie de l’UT
2.2.1. Structure
2.2.2. Pharmacologie
2.3. Désensibilisation et internalisation de l’UT
2.4. Localisation de l’UT
2.4.1. Localisation périphérique
2.4.2. Localisation dans le SNC
2.5. Voies de transduction associées à l’UT
3. Activités biologiques de l’UII
3.1. Effets cardiovasculaires de l’UII
3.1.1. Effets ex vivo et in vitro
3.1.2. Effets in vivo
3.1.3. UII et maladies vasculaires
3.1.4. UII et maladies du myocarde
3.2. Effets sur le système immunitaire
3.3. Effets rénaux de l’UII
3.4. Effets sur le système endocrine
3.5. Effets comportementaux
Objectif de l’étude
Matériels et Méthodes
1. Culture cellulaire
1.1. Cultures d’astrocytes de Rat
1.2. Cultures de neurones en grain du cervelet
1.3. Cocultures astrocytes/neurones en grain
1.4. Lignées cellulaires
2. Biologie moléculaire
2.1. Plasmides recombinants
2.2. Sous-clonage des ADNc, transformation et amplification
3. Transfection des lignées cellulaires par nucléofection
4. Enregistrements électrophysiologiques
4.1. Technique du patch-clamp
4.2. Instrumentation
4.3. Configurations d’enregistrement
4.4. Microélectrodes de mesure et solutions
4.5. Analyse des données électrophysiologiques
5. Mesures des variations de la concentration cytosolique de calcium
5.1. Flexstation
5.2. Imagerie dynamique – Système MétaFluor
6. Microphotographies des cultures primaires – Système MétaMorph
7. Mesure du métabolisme des polyphosphoinositides
8. Mesure de la formation d’AMPc
9. Immunocytochimie et immunohistochimie
9.1. Protocoles d’immunocytochimie
9.1.1. Expression de l’UT et du récepteur GABAA dans les co-cultures astrocytes/neurones
9.1.2. Localisation subcellulaire de l’UT et du récepteur GABAA dans la lignée CHO
9.1.3. Internalisation du récepteur GABAA
9.2. Protocole d’immunohistochimie
9.2.1. Préparation des tranches organotypiques de cervelet
9.2.2. Expression de l’UT et du récepteur GABAA dans les tranches de cervelet
9.3. Acquisition et analyse des images confocales
10. Synthèse peptidique
11. Analyses statistiques
Résultats
Article I : Effect of GABAA receptor activation on UT-coupled signaling pathways in rat cortical astrocytes
Article II : Tight promiscuity between the GABAA receptor and the G protein- coupled receptor for urotensin II induced long-term inhibition of the GABAergic activity. Relevance for astrocyte plasticity
Discussion
1. Caractérisation des voies de couplage de l’UT
2. L’activation du récepteur GABAA inhibe le coulage de l’UT aux protéines Gs/Gq
3. Caractérisation de l’expression de l’UT et du récepteur GABAA
4. L’activation de l’UT inhibe la fonction du récepteur GABAA dans les astrocytes
5. Caractérisation des mécanismes impliqués dans l’interaction fonctionnelle bidirectionnelle entre l’UT et le récepteur GABAA dans une lignée CHO
6. Caractérisation des séquences d’interaction entre l’UT et le récepteur GABAA
Conclusion

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