Le système de réparation des cassures double brin de l’ADN par recombinaison homologue

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Les autres fonctions portées par les protéines BRCA

En plus de leurs rôles essentiels dans le processus de réparation des cassures double brin de l’ADN par recombinaison homologue, les protéines BRCA sont des protéines polyvalentes assurant de nombreuses fonctions au sein de la cellule en vue de maintenir l’intégrité du génome (Figure 5 ; Martinez et al., 2015 ; Gorodetska et al., 2019).
La protéine BRCA1 exerce la plupart de ces fonctions par l’intermédiaire d’interaction avec un très grand nombre de protéines (Figure 5). En fonction de la nature de ses partenaires protéiques, BRCA1 est capable de jouer un rôle dans différents processus cellulaires tels que (i) la régulation du cycle cellulaire, en assurant le passage d’une phase à l’autre ou l’arrêt de la progression du cycle (Ruffner and Verma, 1997 ; Wang et al., 2000), (ii) la régulation de la transcription, en modulant l’activité de différents facteurs de transcription (Monteiro et al., 1996 ; Nadeau et al., 2000) ou encore
(iii) le remodelage de la chromatine (Zhu et al., 2011). On peut notamment citer son interaction avec la protéine BARD1 (BRCA1 Associated Ring Domain 1) qui, par formation d’un complexe hétérodimérique avec BRCA1, permet d’induire l’activité ubiquitine ligase E3 de BRCA1, à l’origine de l’ubiquitination des histones mais également de nombreuses protéines interagissant avec BRCA1 ainsi que BRCA1 elle-même (Mallery et al., 2002 ; Xia et al., 2003). Selon le contexte cellulaire et les signaux perçus par la protéine, l’ubiquitination induite par ce complexe peut réguler différents processus cellulaires en modulant l’activité, la dégradation ou la localisation intracellulaire de certaines protéines (Mansour, 2018). La protéine BRCA1 est également capable de réguler le stress oxydatif induit par exposition aux espèces réactives de l’oxygène (ROS, Reactive Oxygen Stress). Le mécanisme de cette régulation n’est que peu compris mais il a été rapporté qu’en absence de BRCA1, le niveau des ROS augmente tandis qu’une surexpression de BRCA1 fait diminuer la concentration des ROS (Saha et al., 2009 ; Martinez-Outschoorn et al., 2012). La protéine BRCA1 joue également un rôle essentiel dans la mitophagie, une voie spécifique d’autophagie visant à dégrader les mitochondries défectueuses. En effet, il a été démontré que l’absence de protéine BRCA1 fonctionnelle conduit à l’inhibition de la voie de mitophagie compromettant ainsi tout le réseau mitochondrial et de ce fait, la survie cellulaire (Arun et al., 2015). La protéine BRCA1 intervient donc dans de très nombreux processus cellulaires, qu’ils soient nucléaires ou cytoplasmiques, grâce à son interaction avec une pléthore de partenaires et constitue de ce fait un gardien de l’intégrité du génome.
La protéine BRCA2, à l’instar de BRCA1, est impliquée dans de nombreux processus cellulaires tels que (i) la régulation du cycle cellulaire, en contrôlant le passage de la phase G2 à la phase M (Menzel et al., 2011), (ii) la régulation de la transcription, en médiant l’activité de facteurs de transcription (Milner et al., 1997) ainsi que (iii) la mitophagie (Arun et al., 2015) (Figure 5). De plus, BRCA2 permet de maintenir l’intégrité des télomères ce qui prévient la dégradation des chromosomes et leur fusion. En effet, la protéine BRCA2 en favorisant le recrutement de RAD51 sur l’ADN des télomères et ainsi l’activité de RH, facilite la réplication et la protection de ceux-ci (Min et al., 2012). De façon intéressante, il a été montré que dans les tumeurs déficientes en protéines BRCA2, mais pas dans celles déficientes en protéines BRCA1, les télomères sont plus courts et fragiles suggérant ainsi que l’absence de protéines BRCA2 promeut la tumorigenèse (Badie et al., 2010). Enfin, la protéine BRCA2 exerce également un rôle dans la protection des fourches de réplication (Lomonosov et al., 2003) et dans l’élimination des structures secondaires (Bathia et al., 2014). L’ensemble de ces fonctions supporte le fait que la protéine BRCA2 est essentielle au maintien de la stabilité du génome.

Les domaines fonctionnels des protéines BRCA

Comme illustré dans la figure 1, les protéines BRCA présentent des domaines fonctionnels spécifiques, importants pour leurs différentes fonctions (Roy et al., 2011). La protéine BRCA1 porte, dans sa région N-terminale, un domaine catalytique RING riche en cystéine qui permet l’interaction de BRCA1 avec la protéine BARD1 (Bienstock et al., 1996 ; Brzovic et al., 2001). Il a été montré que les altérations de ce domaine sont responsables de la perte d’activité ubiquitine ligase de BRCA1 et de ce fait, conduisent au développement tumoral (Hashizume et al., 2001). Cette observation souligne le rôle important du domaine RING dans l’activité suppresseur de tumeur de la protéine BRCA1. Au niveau de la région C-terminale, deux domaines BRCT (BRCA1 C-Terminal domain) permettent l’interaction de la protéine BRCA1 avec de nombreux partenaires (Huyton et al., 2000 ; Yu et al., 2003). La protéine BRCA1 possède deux signaux de localisation nucléaire (NLS, Nuclear Localization Signals) et un domaine superhélice (coiled coil). Ce dernier permet à BRCA1 d’interagir avec la protéine PALB2 lors du processus de réparation des DSB par RH. La protéine BRCA2 présente deux domaines de liaison au niveau de son extrémité N-terminale : le premier permet l’interaction de BRCA2 avec la protéine PALB2, assurant ainsi le recrutement de BRCA2 dans le processus de recombinaison homologue (Xia et al., 2006 ; Oliver et al., 2009) tandis que le second est un domaine de liaison à l’ADN assurant l’interaction de BRCA2 avec les cassures double brin de l’ADN (von Nicolai et al., 2016). La protéine BRCA2 peut également moduler indirectement la transcription via son interaction avec le facteur de co-activation de la transcription P/CAF (P300/CBP-Associated Factor) (Fuks et al., 1998). Localisé dans la région C-terminale, le deuxième domaine de liaison à l’ADN de BRCA2 est constitué d’un motif hélice-coude-hélice (HTH, Helix-Turn-Helix) et de 3 domaines OB (Oligonucleotide Binding) (Yang et al., 2002). Le motif HTH et le premier domaine OB forment également un domaine de liaison à la protéine DSS1 (Deleted in Split hand/Split foot 1) conduisant à la stabilité de BRCA2 et permettant de lier le complexe protéique BRCA2-RAD51 à la protéine RPA lors du processus de recombinaison homologue (Zhao et al., 2015). Dans la région C-terminale, BRCA2 possède également deux NLS et un domaine de liaison à RAD51. Au niveau de la région centrale de la protéine, 8 répétitions en tandem appelées BRC repeats permettent également l’interaction de BRCA2 avec RAD51, étape clé de l’activité de recombinaison homologue (Wong et al., 1997 ; Carreira et al., 2009). Il est toutefois important de noter que de larges régions dans les deux protéines ne sont a priori associées à aucune fonction, selon nos connaissances actuelles.

Les gènes de prédisposition au syndrome sein-ovaire non-BRCA

Les altérations des gènes BRCA ne peuvent expliquer à elles seules l’ensemble des cas suspectés de syndrome sein-ovaire (Kast et al., 2016 ; Castéra et al., 2018). En effet, il a été rapporté que seulement 24 à 51% des cas de syndrome sein-ovaire sont liés à une altération constitutionnelle d’un gène BRCA. Cette hérédité manquante a pu s’expliquer en partie à la suite de l’identification de variations pathogènes dans d’autres gènes qui se sont avérés impliqués dans ce syndrome (Figure 6 ; Mahdavi et al., 2018 ; Angeli et al., 2020).
Plusieurs autres gènes de susceptibilité au cancer du sein ont été identifiés et associés à une forte pénétrance parmi lesquels : (i) le gène PALB2 (Partner And Localizer of BRCA2) dont la fonction protéique dans la voie de réparation des cassures double brin par recombinaison homologue est primordiale et dont les altérations constitutionnelles confèrent un risque cumulé de 44% à 70 ans (Antoniou et al., 2014 ; Yang et al., 2019), (ii) le gène TP53 (Tumor Protein 53) impliqué dans le syndrome de Li-Fraumeni et prédisposant aux formes très précoces de cancers, avant 31 ans (Ruijs et al., 2009 ; Masciari et al., 2012), (iii) le gène PTEN (Phosphatase and TENsin homolog), gène suppresseur de tumeur dont l’altération conduit au syndrome de Cowden et confère un risque de 77% à 70 ans (Bubien et al., 2013 ; Ngeow et al., 2015) et (iv) le gène CDH1 (CaDHerin 1) dont l’altération prédispose au syndrome gastrique héréditaire diffus et conduit à un risque cumulé de 40% à 70 ans (Hansford et al., 2015). D’autres gènes sont plutôt associés à un risque élevé de cancer de l’ovaire dont les deux gènes paralogues de RAD51, RAD51C et RAD51D (Meindl et al., 2010 ; Loveday et al., 2016). La protéine RAD51 exerce un rôle essentiel dans la voie de réparation des cassures double brin par recombinaison homologue et, même si ses deux paralogues n’assurent pas le même rôle, RAD51C et RAD51D régulent positivement ce mécanisme. Une altération constitutionnelle de RAD51C ou RAD51D conduit donc à une augmentation du risque cumulé de cancer de l’ovaire à 80 ans de 9% et 10%, respectivement (Sopik et al., 2014 ; Loveday et al., 2016). Il a également été rapporté plusieurs autres gènes de susceptibilité associés à un risque modéré comme CHEK2, ATM, BRIP1, NF1 (Desrichard et al., 2011 ; Tavtigian et al., 2009 ; Rafnar et al., 2011 ; Madanikia et al., 2012). Certains gènes semblent également impliqués dans le déterminisme génétique du syndrome sein-ovaire, tels que BARD1, NBN, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EPCAM, mais la pénétrance reste à préciser (Easton et al., 2015 ; Cohen-Haguenauer, 2019).
Le développement des technologies de séquençage à haut débit de l’ADN a permis de mieux appréhender le rôle de certains gènes non-BRCA dans l’étiologie du syndrome sein-ovaire. Malgré tout, il existe toujours une hérédité manquante. Celle-ci pourrait éventuellement s’expliquer par la présence d’autres gènes de prédisposition au syndrome sein-ovaire encore non identifiés ou par l’existence de variations dans des gènes de susceptibilité connus mais localisés dans des régions non séquencées.

Le diagnostic du syndrome sein-ovaire

Le syndrome sein-ovaire est désormais très largement documenté dans la littérature et la caractérisation de ce syndrome repose aujourd’hui sur différents éléments évocateurs tels que le contexte clinique individuel, les antécédents familiaux et les caractéristiques tumorales. Néanmoins, le diagnostic définitif de ce syndrome dépend de l’identification, dans le génome du patient, de l’anomalie constitutionnelle hétérozygote à l’origine de la perte de fonction de l’un des gènes de prédisposition.

Identification des cas évocateurs

Une prédisposition héréditaire au cancer peut être suspectée devant certains critères spécifiques. Tout d’abord, il peut s’agir d’éléments propres à l’individu tels que : (i) la précocité de survenue d’un cancer du sein isolé (avant 36 ans) ou de l’ovaire (avant 70 ans), (ii) un cancer du sein triple négatif ou médullaire avant 51 ans, (iii) la bilatéralité des cancers du sein, (iv) la multiplicité de tumeurs primitives (plusieurs cancers dans le même tissu, sein ou ovaire, ou deuxième tumeur dans un tissu différent de celui d’origine, sein, ovaire, pancréas, prostate) et (v) le sexe de l’individu (homme atteint d’un cancer du sein quel que soit l’âge) (Eisinger et al., 2004 ; Cohen-Haguenauer, 2019). Le contexte familial de l’individu représente également un argument dans l’orientation du patient vers une consultation d’oncogénétique (Figure 7 ; Lynch et al., 2013). Une prédisposition héréditaire est ainsi envisagée devant l’agrégation de cas de cancers du sein et/ou de l’ovaire dans la même branche parentale au premier ou au second degré avec (i) au moins 3 cas de cancers du sein et /ou de l’ovaire ou (ii) 2 cas de cancers du sein ou de l’ovaire et au moins un cas de cancer du pancréas ou (iii) 2 cas de cancers passant par un homme et ayant développés soit un cancer du sein avant 40 ou un cancer bilatéral, soit un cancer du sein et un cancer de l’ovaire, soit deux cancers de l’ovaire, soit un cancer du sein identifié chez un homme (Eisinger et al., 2004 ; Cohen-Haguenauer, 2019).
Les cancers associés à un syndrome sein-ovaire présentent très peu de caractéristiques tumorales spécifiques par rapport aux cancers d’origine sporadique. Il est donc difficile de se baser sur les données tumorales dans le but de conclure à une prédisposition héréditaire. On peut toutefois distinguer quelques sous-types tumoraux plus fortement représentés au sein des patients présentant une forme héréditaire : le cancer du sein de type médullaire avant 50 ans, les cancers du sein de type canalaire infiltrant de grade élevé (grade III) (Chappuis et al., 2000) ou les cancers dits triples négatifs (i.e. ayant perdu l’expression des récepteurs aux œstrogènes (RO-) et à la progestérone (RP-) et ne présentant pas de surexpression du facteur de croissance HER2 (HER2-)) (Phuah et al., 2012 ; Spurdle et al., 2014).

Le diagnostic moléculaire du syndrome sein-ovaire

Face à un contexte personnel et familial évocateur d’un syndrome sein-ovaire, associé ou non  à l’observation d’un élément tumoral potentiellement concordant, il peut être proposé au patient un diagnostic moléculaire et ce afin de confirmer un cas de syndrome sein-ovaire. L’objectif est alors l’identification de l’anomalie constitutionnelle hétérozygote pathogène à l’origine de la perte de fonction de l’un des gènes majeurs de prédisposition. Les variations constitutionnelles bi-alléliques de BRCA1, BRCA2 ou PALB2 à l’état homozygote ou hétérozygote composite sont à l’origine d’un autre syndrome héréditaire, l’anémie de Fanconi, celui-ci à transmission autosomique récessive et caractérisé par des malformations congénitales variables, des aplasies médullaires ainsi que des hémopathies et des tumeurs solides (D’Andrea and Grompe, 2003 ; Xia et al., 2007). L’identification de la variation causale est indispensable à la bonne orientation du conseil génétique pour le patient et ses apparentés, d’un point de vue diagnostique et pronostique mais également thérapeutique. Initialement, la recherche d’une variation ponctuelle dans les régions codantes et introniques flanquantes des gènes de prédisposition s’effectuait par séquençage Sanger alors que la recherche de réarrangements génomiques de grande taille était réalisée par la technique de MLPA (Multiplex Ligand dependent-Probe Amplification) ou de QMPSF (Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent fragments). Grâce à l’avènement du séquençage à haut débit (NGS, Next-Generation Sequencing), la recherche de l’anomalie pathogène repose désormais sur une analyse en panel ciblant simultanément plusieurs gènes (Castéra et al., 2018 ; Moretta et al., 2018). Cette technique a permis de révolutionner le diagnostic moléculaire du syndrome sein-ovaire en séquençant très rapidement plusieurs gènes en même temps, à moindre coût, améliorant ainsi la détection des variations (Castéra et al., 2014). En France, dans un contexte de suspicion de syndrome sein-ovaire, l’anomalie pathogène sera recherchée dans les principaux gènes de prédisposition, BRCA1 et BRCA2, gènes associés à un risque élevé de cancer, mais également au sein de 11 autres gènes associés à des risques plus ou moins élevés : PALB2, TP53, CDH1, PTEN, RAD51C, RAD51D, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 et EPCAM. Ce panel de 13 gènes a été établi sous l’égide du Groupe Génétique et Cancer ayant statué sur leur relevance clinique (Moretta et al., 2018).

Le syndrome de Lynch, prédisposition génétique au cancer colorectal

Le cancer colorectal (CCR) est le troisième cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez l’homme et le second chez la femme, avec plus de 1,8 millions de nouveaux cas dans le monde en 2018 représentant ainsi plus de 10% des cas de cancers (Bray et al., 2018 ; https://gco.iarc.fr). Il constitue également la deuxième cause de mortalité par cancer dans le monde en 2018 avec près de 900 000 décès. Les taux d’incidence et de mortalité du cancer colorectal varient considérablement dans le monde. En France, cela représente plus de 47 000 nouveaux cas et près de 20 000 décès pour l’année 2018 (https://gco.iarc.fr). Dans 60 à 65% des cas, les CCR sont d’origine sporadique, c’est-à-dire qu’ils résultent d’anomalies somatiques acquises au cours de la vie de l’individu (Figure 9 ; Keum and Giovannucci, 2019). En revanche, 35 à 40% des cas de CCR sont associés à une composante familiale, c’est-à-dire qu’un, deux ou plusieurs apparentés au premier et/ou au second degré du cas index présentent également un CCR, suggérant ainsi une contribution génétique ou l’intervention de facteurs environnementaux, ou encore, une combinaison des deux (Lichtenstein et al., 2000 ; Graff et al., 2017). Parmi ces formes familiales de CCR, 25% d’entre elles présentent une agrégation familiale avec une fréquence élevée de CCR mais dont la transmission n’est pas compatible avec un modèle héréditaire tandis que seulement 5% d’entre elles résultent d’une prédisposition héréditaire avérée (Figure 9 ; Jasperson et al., 2010 ; Keum and Giovannucci, 2019). Parmi les prédispositions héréditaires au cancer colorectal, on peut distinguer : (i) la polypose adénomateuse familiale (PAF) transmise de façon autosomique dominante (altération constitutionnelle hétérozygote du gène APC) et récessive (altérations constitutionnelles bi-alléliques du gène MUTYH) correspondant à moins de 1% des cas de CCR et (ii) le syndrome de Lynch, anciennement dénommé HNPCC (Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer), transmis de façon autosomique dominante constituant environ 2 à 4% des cas de CCR (Baert-Desurmont et al., 2018 ; Keum and Giovannucci, 2019).
Le syndrome de Lynch est l’une des plus anciennes formes décrites de prédisposition héréditaire au cancer (Lynch et al., 1977 ; Lynch et al., 2015). C’est en 1895 qu‘Alfred Warthin, médecin américain, fait l’observation d’un très grand nombre de décès par cancer dans la famille de sa couturière. Il rapporte dans ses travaux publiés en 1913 que la famille G, ainsi nommée du fait de son origine germanique, présente de nombreux cas de cancers colorectaux, de l’utérus et de l’estomac et ce, dans toutes les générations. Il émet alors l’hypothèse selon laquelle le cancer se transmet dans cette famille via un facteur héréditaire, avec un mode de transmission mendélien (Lynch et al., 2015). Dans les années 1960, le médecin américain Henry Lynch fait l’observation de deux familles avec les mêmes traits phénotypiques que la famille G, validant ainsi l’hypothèse d’une transmission héréditaire du cancer selon un mode de transmission autosomique dominant. Ce « syndrome du cancer familial » (cancer family syndrome) est renommé en 1984 « syndrome de Lynch » par le médecin américain Richard Boland avant d’être appelé HNPCC par la suite (Boland and Troncale, 1984). Il a également été mis en évidence que ce syndrome prédisposait non seulement aux cancers colorectaux, mais également à un large spectre tumoral (Vasen et al., 1990). En effet, ce syndrome touche majoritairement le côlon et le rectum mais il est également associé à un risque élevé de cancer de l’endomètre. En outre, il confère également des risques plus modérés de développer des tumeurs dites du spectre étroit telles que le cancer de l’intestin grêle et des voies excrétrices urinaires, mais aussi des tumeurs dites du spectre élargi telles que le cancer de l’estomac, des ovaires, du pancréas et des voies biliaires (Win et al., 2012 ; Medina-Arrana et al., 2012). Ainsi, la dénomination « syndrome de Lynch » est désormais préférée à celle de HNPCC. D’autres cancers héréditaires considérés comme de rares variantes de ce syndrome se caractérisent par des présentations phénotypiques particulières. Ainsi un syndrome de Muir-Torre est évoqué dans le cas d’une présentation familiale de CCR avec des tumeurs cutanées (Muir et al., 1967 ; Torre et al., 1968) alors qu’un syndrome de Turcot est suspecté lorsque des CCR et des tumeurs cérébrales sont identifiés au sein d’une même famille (Turcot et al., 1959).

Les gènes MMR, gènes majeurs de prédisposition au syndrome de Lynch

Le syndrome de Lynch résulte d’altérations génétiques constitutionnelles hétérozygotes conduisant à la perte de fonction de l’un des gènes codant des protéines impliquées dans la voie de réparation des mésappariements de l’ADN, aussi connu sous le nom de système MMR (MisMatch Repair). Quatre gènes ont ainsi été identifiés comme gènes majeurs de prédisposition au syndrome de Lynch et sont appelés, dans leur ensemble, gènes MMR. Le premier gène identifié comme étant associé à ce syndrome a été le gène MSH2 (MutS Homolog 2 of E. coli ; OMIM #609309) localisé au niveau de la région 2p21 et se composant de 16 exons codant une protéine de 934 acides aminés (Figure 10 ; Fishel et al., 1993). Au cours de la même année fût découvert un second gène de prédisposition, le gène MLH1 (MutL homolog 1 of E. coli ; OMIM #120436) localisé en 3p21-23 et constitué de 19 exons codant une protéine de 756 acides aminés (Figure 10 ; Lindblom et al., 1993 ; Papadopoulos et al., 1994). Concomitant à cette découverte, un troisième gène de prédisposition a été identifié, le gène PMS2 (PostMeiotic Segregation increased 2 ; OMIM #600259) localisé dans la région 7p22 et composé de 15 exons codant une protéine de 862 acides aminés (Figure 10 ; Nicolaides et al., 1994). Enfin, le quatrième gène associé au syndrome de Lynch a été découvert quelques années après les trois premiers, il s’agit du gène MSH6 (MutS Homolog 6 of E. coli ; OMIM #600678) localisé en 2p16 et constitué de 10 exons codant une protéine de 1 361 acides aminés (Figure 10 ; Miyaki et al., 1997). De façon intéressante, il a récemment été découvert que des délétions constitutionnelles dans la partie 3’ du gène EPCAM (EPithelial Cell Adhesion Molecule ; OMIM #185535), localisé au niveau de la région 2p21 en amont du gène MSH2, pouvaient conduire à une inactivation épigénétique de MSH2 et constituer ainsi, une nouvelle cause de syndrome de Lynch (Ligtenberg et al., 2009). L’expression des gènes MMR est ubiquitaire. Pourtant, le spectre tumoral associé à une défaillance d’un de ces gènes est restreint à certains tissus, comme explicité ci-dessus. A ce jour, l’origine de cette spécificité tissulaire tumorale associée à une défaillance du système MMR n’est pas complètement élucidée. Plusieurs hypothèses ont été avancées parmi lesquelles la vitesse de prolifération cellulaire des tissus touchés ou l’exposition à des agents environnementaux toxiques (Chao and Lipkin, 2006). (d’après les guidelines v.2.4. 2018 de l’organisation InSIGHT, https://www.insight-
Les altérations constitutionnelles hétérozygotes des gènes MMR sont associées à des pénétrances incomplètes variables selon le gène altéré (Moller et al., 2018 ; ten Broeke et al., 2018 ; Dominguez-Valentin et al., 2020). Une variation à l’origine d’une perte de fonction d’un de ces gènes conduira à un risque plus ou moins important de développer une tumeur. Ainsi, les risques cumulés de développer une tumeur du spectre associé à ce syndrome à 70 ans sont estimés à 79%, 77%, 62% et 22% pour une femme et 64%, 71%, 28% et 22% pour un homme lorsque MLH1, MSH2, MSH6 ou PMS2 sont mutés, respectivement (Tableau 3 ; Dominguez-Valentin et al., 2020). Cette variabilité d’incidence entre les hommes et les femmes peut s’expliquer par le fait que le spectre du syndrome de Lynch est caractérisé en grande partie par des cancers touchant des organes spécifiquement féminins tels que l’endomètre ou encore, les ovaires. L’incidence, en plus de varier selon le gène porteur de l’anomalie pathogène, peut donc également varier selon la nature du cancer ou selon le sexe de l’individu. En effet, le risque cumulé d’atteinte d’un cancer colorectal à l’âge de 70 ans est de 44%, 42%, 20% et 3% chez les femmes porteuses d’une variation délétère de MLH1, MSH2, MSH6 ou PMS2, respectivement, tandis que les individus masculins présenteront un risque cumulé de 53%, 46%, 12% ou 3%, respectivement (Tableau 3 ; Dominguez-Valentin et al., 2020). Après le cancer colorectal, le cancer de l’endomètre est le second cancer du spectre à présenter l’incidence la plus élevée avec un risque cumulé de développer une tumeur à 70 ans de 35%, 47%, 41% et 13% pour les femmes porteuses d’une variation causale de MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2 (Tableau 3 ; Dominguez-Valentin et al., 2020).

Les fonctions associées aux protéines MMR

Les gènes MMR codent des protéines aux fonctions multiples principalement connues pour leur rôle capital dans le maintien de l’intégrité de l’information génétique au cours des divisions cellulaires. Les fonctions essentielles du système MMR sont, d’une part, la réparation post-réplicative des mésappariements de l’ADN et, d’autre part, la signalisation apoptotique de certains dommages à l’ADN, mais elles interviennent également dans diverses fonctions cellulaires (Hsieh and Yamane, 2008 ; Edelbrock et al., 2013 ; Kunkel and Erie, 2015).

La réparation post-réplicative des mésappariements de l’ADN

Comme explicité dans la partie I.1.2.a. traitant de la fonction des protéines BRCA dans le système de réparation des cassures double brin par recombinaison homologue, la réplication de l’ADN est une étape charnière dans la transmission de l’information génétique aux cellules filles. Il est indispensable que l’intégrité de cette information soit maintenue au plus proche de l’information contenue dans l’ADN de la cellule mère. Le système MMR est un mécanisme bidirectionnel de réparation des mésappariements de l’ADN qui permet de corriger les erreurs survenues lors de la réplication de l’ADN ayant échappé au contrôle des polymérases (proofreading) (Hsieh and Yamane, 2008 ; Edelbrock et al., 2013 ; Kunkel and Erie, 2015 ; Liu et al., 2017). Cette voie de réparation permet de détecter et d’exciser précisément le mésappariement avant de resynthétiser correctement le brin néoformé. Grâce à ce système, le taux d’erreurs de la réplication diminue d’un facteur 1 000, aboutissant à moins d’une erreur par génome diploïde lors de la division d’une cellule. C’est en 1975 que l’équipe du biologiste et généticien américain Matthew Meselson a découvert cette voie de réparation dans la bactérie Escherichia coli (E. coli) (Wildenberg and Meselson, 1975 ; Wagner and Meselson). C’est ensuite l’équipe du biochimiste américain Paul Modrich qui a pleinement caractérisé le système MMR de E. coli, alors appelé système MutHLS (Mut, Mutator), en le reconstituant in vitro et en isolant les 11 protéines responsables de cette activité (Su and Modrich, 1986 ; Su et al., 1988). Par la suite, l’équipe de Paul Modrich a démontré qu’un système analogue existait dans les cellules eucaryotes (Fang and Modrich, 1993 ; Modrich, 2006). En effet, cette voie de réparation est très conservée de la bactérie aux mammifères ce qui se traduit par de très fortes homologies entre les systèmes MMR de la bactérie, de la levure et de l’homme (Eisein, 1998 ; Aravind et al., 1999 ; Fukui, 2010). Cette découverte fondamentale a été récompensée par un prix Nobel de Chimie en 2015.
Le système MMR met en jeu un grand nombre de protéines, souvent associées sous la forme d’hétérodimères, remplissant des rôles spécifiques et coordonnés dans ce processus complexe et séquentiel. Chez l’homme, deux principaux complexes peuvent être distingués : (i) le complexe MutS qui est à l’origine de la reconnaissance du mésappariement et (ii) le complexe MutL qui sert d’interface entre le premier complexe et les acteurs de la réparation de l’erreur de réplication. Selon le type de mésappariements de l’ADN, le complexe MutS recruté ne sera pas constitué des mêmes protéines. En effet, l’hétérodimère MutSα, composé des protéines MSH2 et MSH6, reconnaît principalement les erreurs de type substitutions ponctuelles et petites insertions/délétions tandis que l’hétérodimère MutSβ, formé des protéines MSH2 et MSH3, reconnaît exclusivement de larges insertions/délétions. Il est à noter que le complexe MSH2-MSH6 constitue l’hétérodimère MutS le plus abondant et à ce titre, reconnait la majorité des mésappariements de l’ADN (Reyes et al., 2015). Le complexe MutL, quant à lui, peut se former à partir des protéines MLH1 et PMS2, constituant ainsi l’hétérodimère MutLα, le plus connu chez l’homme, mais il peut également se composer des protéines MLH1-PMS1 et MLH1-MSH3 formant, respectivement, les hétérodimères MutLβ et MutLγ dont les rôles dans ce mécanisme sont mineurs. Les protéines MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2 exercent donc des fonctions essentielles dans le système MMR. La majorité des cas de syndrome de Lynch est associée à une altération pathogène des gènes MLH1 et MSH2 du fait de l’implication systématique des deux protéines résultantes dans la formation des hétéroduplexes MutS et MutL, respectivement (Plazzer et al., 2013).
La réparation des mésappariements de l’ADN par le système MMR est initiée avec la reconnaissance de l’erreur de réplication par l’hétérodimère MutSα (Figure 11). L’interaction avec le mésappariement induit un changement de conformation du complexe MutSα qui, après liaison à l’ATP, recrute l’hétérodimère MutLα formant ainsi un complexe tétramérique. L’activité endonucléase intrinsèque de MutLα est ensuite activée de manière stochastique par la protéine PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), chargée elle-même sur l’ADN par le facteur RFC (Replication Factor C), afin d’inciser le brin néosynthétisé, porteur du mésappariement (Figure 11 ; Reyes et al., 2015 ; Kunkel and Erie, 2015 ; Liu et al., 2017). Le mécanisme de discrimination du brin porteur du mésappariement n’est pas encore bien défini mais il a été suggéré que ce serait la liaison asymétrique de la protéine PCNA avec le brin néoformé qui permettrait à l’hétérodimère MutLα d’inciser spécifiquement le brin néo-synthétisé (Kadyrov et al., 2006). Cependant, il a également été proposé que MutLα soit en capacité d’identifier précisément l’un des brins néoformés du fait de sa nature discontinue. En effet, la réplication bidirectionnelle de l’ADN est intrinsèquement asymétrique conduisant ainsi à la production à la fois de segments longs sur un brin (leading strand) et de courts segments discontinus transitoires nommés fragments d’Okazaki sur l’autre brin (lagging strand) (Pavlov et al., 2003). Par la suite, les protéines MSH2 et MLH1 du complexe tétramérique vont recruter l’enzyme exonucléase 1 (EXO1) qui va se servir de l’incision réalisée par l’hétérodimère MutLα comme point d’ancrage afin d’éliminer une partie du brin néosynthétisé (Figure 11). Il apparait qu’une déficience en cette enzyme ne conduit pas nécessairement à une inactivation du système MMR, suggérant ainsi l’existence de deux voies au sein de ce système : l’une, EXO1-dépendante et l’autre, EXO1-indépendante (Jagmohan-Changur et al., 2003). Plusieurs hypothèses supportent l’existence de cette seconde voie dont, notamment, celle considérant MRE11, une exonucléase généralement associée au mécanisme de réparation des cassures double brin de l’ADN. En effet, il a été montré qu’une déficience en MRE11 ou une anomalie dans son domaine d’interaction avec la protéine MLH1, sont associées à une déficience du système MMR (Vo et al., 2005). Pendant la dégradation du brin néosynthétisé, des protéines RPA sont recrutées au niveau du brin d’ADN qui sert de matrice afin de le stabiliser. Enfin, une fois la dégradation du brin porteur du mésappariement effectuée, les ADN polymérases δ et ε pourront re-synthétiser fidèlement le brin d’ADN à partir de la séquence d’ADN complémentaire du brin matrice et l’ADN ainsi nouvellement synthétisé sera scellé au reste du brin grâce à une ligase d’ADN (Figure 11).

La signalisation apoptotique de certains dommages de l’ADN

En plus de sa fonction de réparation des mésappariements de l’ADN, le système MMR intervient également dans la réponse cellulaire à certains agents génotoxiques. En effet, les hétéroduplexes MutS sont capables de reconnaître des altérations de l’ADN induites par des agents chimiques de type antinéoplasiques ou alkylants, conditionnant ainsi l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose de la cellule (Jiricny, 2006 ; O’brien and Brown, 2006 ; Hsieh and Yamane, 2008 ; Gupta and Heinen, 2019). De façon intéressante, il a été montré que les cellules déficientes en protéines MMR exposées à des agents alkylants étaient 100 fois plus résistantes à la mort cellulaire illustrant ainsi le rôle important de ces protéines dans la signalisation apoptotique en réponse à des agents alkylants (Karran, 2001).
Les agents alkylants MNNG (N-méthyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine), MNU (N-méthyl-N-nitrosourée) et leurs analogues utilisés comme agents chimiothérapeutiques anticancéreux, le témozolomide et la dacarbazine, sont à l’origine d’une cytotoxicité cellulaire du fait de la méthylation de l’atome d’oxygène en position 6 des guanines de l’ADN (O6-meG, O6-méthylGuanine) (Swan et al., 1996 ; Karran, 2001). Classiquement, l’enzyme MGMT (O6-MéthylGuanine-Méthyltransférase) constitue la première défense contre les lésions O6-meg par transfert du groupement méthyle de la guanine altérée vers un de ses propres résidus cystéine, ce qui a pour conséquence de l’inactiver (Yarosh et al., 1984). Néanmoins, cette enzyme n’est pas infaillible et peut se retrouver saturée ou inactivée induisant ainsi une fuite du premier système de réparation de ce type d’altérations. Pendant la réplication, la base modifiée O6-meG n’est pas correctement reconnue par la polymérase qui va incorporer une thymine au lieu d’une cytosine, base complémentaire de la guanine, générant un mésappariement. L’hétéroduplexe MutS reconnaît alors le mésappariement apparu sur le brin néosynthétisé et induit l’apoptose (Duckett et al., 1996 ; Karran, 2001 ; Mojas et al., 2007).
Aujourd’hui, le mécanisme à l’origine de la mort cellulaire à la suite de la reconnaissance d’un mésappariement O6-meG par le système MMR n’est pas complètement élucidé et deux modèles non exclusifs sont généralement discutés (Figure 12 ; Edelbrock et al., 2013 ; Gupta and Heinen, 2019). Dans le premier modèle appelé « modèle de signalisation directe », il est proposé que le système MMR soit directement à l’origine de l’activation de la voie de signalisation des dommages à l’ADN par interaction des protéines MSH2 et ATR (Ataxia-Telangiectasia mutated and Rad3-Related) et/ou de la protéine MLH1 avec la protéine ATM (Brown et al., 2003 ; Wang and Qin, 2003 ; Yoshioka et al., 2006 ; Jiricny, 2006). L’arrêt du cycle cellulaire serait médié par les protéines CHK1 et CHK2 (CHeckpoint Kinase 1/2) à la suite de leur interaction avec les protéines ATR et ATM, ou encore directement par liaison avec la protéine MSH2 (Hawn et al., 1995 ; Adamson et al., 2005). Dans ce modèle, il semblerait que l’apoptose soit provoquée par phosphorylation de la protéine p53 (Duckett et al., 1999 ; Hickman and Samson, 1999). Le second modèle, nommé « modèle de réparation futile » ou « modèle des cycles futiles », suggère que ce sont les multiples tentatives de réparation du mésappariement par le système MMR qui génèrent des portions d’ADN simple brin puis double brin, au fur et à mesure des cycles de réplication, conduisant à terme à l’arrêt du cycle cellulaire et à l’apoptose (Figure 12 ; York and Modrich, 2006 ; Mojas et al., 2007). Dans ce modèle, le système MMR ne peut réparer la véritable lésion car celle-ci est localisée sur le brin matrice et pas sur le brin néosynthétisé.
Il est à noter que le système MMR est également impliqué dans la réponse cellulaire aux lésions oxydatives de type 8-oxoguanine (Colussi et al., 2002 ; Mazurek et al., 2002) ou encore, aux dommages induits pas des rayonnements ultraviolets (Young et al., 2004 ; van Oosten et al., 2005). Ainsi, les protéines majeures du système MMR, en plus de leur rôle au sein de la voie de réparation des mésappariements de l’ADN, modulent plusieurs mécanismes de contrôle de l’intégrité du génome. La déficience d’une de ces protéines conduit non seulement à l’accumulation d’anomalies mais aussi à la croissance sélective de cellules mutées, conduisant ainsi à la tumorigenèse.

Les autres fonctions portées par les protéines MMR

Outre la correction des mésappariements de l’ADN lors de la réplication et la signalisation apoptotique de certains dommages à l’ADN, les protéines MMR interviennent également au sein d’autres voies de réparation de l’ADN (Jiricny, 2006 ; Gupta and Heinen, 2019). En effet, toute altération de la conformation hélicoïdale de l’ADN constitue une cible potentielle pour les composants du système MMR. Par exemple, au cours de la réparation des cassures double brin de l’ADN par recombinaison homologue, il est essentiel que le chromosome porteur de l’anomalie recombine spécifiquement avec la séquence homologue associée. Dans le cas d’une recombinaison hétérologue, la réunion de deux portions d’ADN ne présentant pas ou peu d’homologie de séquence conduira à l’introduction de mésappariements (George and Alani, 2012 ; Chakraborty and Alani, 2016). Les hétéroduplexes MutSα ou β, dépendants du type de mésappariements, sont en capacité d’identifier ces anomalies, de s’y fixer et de recruter un complexe protéique spécifique permettant le déroulement de la molécule d’ADN et ce, afin d’initier une nouvelle recherche d’homologie de séquence. Ce processus, appelé anti-recombinaison, joue un rôle indispensable dans le maintien de l’intégrité du génome.
De plus, certaines protéines MMR sont amenées à jouer un rôle dans diverses fonctions cellulaires telles que la recombinaison mitotique (Datta et al., 1996 ; Rizki and Lundblad, 2001) et méiotique (Hunter and Borts, 1997 ; Wang et al., 1999b) ainsi que la commutation de classes des immunoglobulines (Ehrenstein and Neuberger, 1999 ; Schrader et al., 1999).

Table des matières

Introduction
I. Les prédispositions héréditaires aux cancers
I.1. La prédisposition génétique aux cancers du sein et de l’ovaire : le syndrome sein-ovaire
I.1.1. Les gènes majeurs de prédisposition au syndrome sein-ovaire, BRCA1 et BRCA2
I.1.2. Les fonctions associées aux protéines BRCA
I.1.2.a. Le système de réparation des cassures double brin de l’ADN par recombinaison homologue
I.1.2.b. Les autres fonctions portées par les protéines BRCA
I.1.2.c. Les domaines fonctionnels des protéines BRCA
I.1.3. Les gènes de prédisposition au syndrome sein-ovaire non-BRCA
I.1.4. Le diagnostic du syndrome sein-ovaire
I.1.4.a. Identification des cas évocateurs
I.1.4.b. Le diagnostic moléculaire du syndrome sein-ovaire
I.2. Le syndrome de Lynch, prédisposition génétique au cancer colorectal
I.2.1. Les gènes MMR, gènes majeurs de prédisposition au syndrome de Lynch
I.2.2. Les fonctions associées aux protéines MMR
I.2.2.a. La réparation post-réplicative des mésappariements de l’ADN
I.2.2.b. La signalisation apoptotique de certains dommages de l’ADN
I.2.2.c. Les autres fonctions portées par les protéines MMR
I.2.2.d. Les domaines fonctionnels des protéines MMR
I.2.3. Le diagnostic du syndrome de Lynch
I.2.3.a. Identification des cas évocateurs
I.2.3.b. Le diagnostic moléculaire du syndrome de Lynch
II. La problématique de la classification des variations génétiques
II.1. Les recommandations générales dans un contexte de maladies mendéliennes
II.2. Les recommandations spécifiques dans le contexte du syndrome sein-ovaire
II.3. Les recommandations spécifiques dans le contexte du syndrome de Lynch
III. L’épissage, étape clé de la maturation des ARN pré-messagers
III.1. La réaction catalytique d’épissage
III.2. La machinerie d’épissage : le splicéosome
III.2.1. Le splicéosome majeur
III.2.1. Le splicéosome mineur
III.3. Les signaux d’épissage
III.3.1. Les signaux principaux
III.3.2. Les signaux auxiliaires
III.4. L’épissage alternatif de l’ARNm
III.4.1. La régulation de l’épissage alternatif
III.4.2. Le rôle de l’épissage alternatif dans la régulation de l’expression génique
III.4.3. Le système de surveillance des ARNm : nonsense mediated decay ou NMD
III.4.4. L’épissage alternatif des gènes BRCA et MMR
IV. Les défauts d’épissage induits par des variations génétiques
IV.1. Les mécanismes d’altération de l’épissage
IV.1.1. Altération des signaux cis d’épissage
IV.1.1.a. Altération des signaux principaux
IV.1.1.b. Altération des signaux auxiliaires
IV.1.2. Altération des facteurs trans d’épissage
IV.2. Les outils de prédiction de l’impact des variations splicéogéniques
IV.2.1. Outils de prédiction dédiés aux sites d’épissage
IV.2.2. Outils de prédiction dédiés au site de branchement
IV.2.3. Outils de prédiction dédiés aux éléments de régulation de l’épissage
IV.2.4. Outils de prédiction combinés
IV.3. Les approches expérimentales de détection des anomalies d’épissage
IV.3.1. Analyses expérimentales à partir du matériel biologique des patients
IV.3.1.a. Analyse des profils d’épissage des transcrits par RT-PCR
IV.3.1.b. Analyse de l’expression allélique
IV.3.1.c. Analyses des défauts d’épissage par la technique de RNA-seq
IV.3.2. Analyses expérimentales alternatives
IV.3.2.a. Test indicateur d’anomalies d’épissage basé sur l’utilisation de minigènes
IV.3.2.b. Test indicateur d’anomalies d’épissage basé sur l’utilisation de transgènes ou de modifications du génome
Objectifs des travaux de thèse
Résultats
I. Toutes les variations non-sens ne conduisent pas à une perte totale de fonction : le paradigme de l’exon 12 de BRCA2
II. Caractérisation fonctionnelle des variations à l’origine d’une anomalie en phase de l’épissage : le modèle MSH2
Discussion
I. Les variations présumées pathogènes sont susceptibles de maintenir une fonction par le biais de leur impact sur l’épissage
I.1. Les variations IVS±1/2 responsables d’un défaut d’épissage en phase et leurs conséquences fonctionnelles au niveau de la protéine
I.1.1. Les variations IVS±1/2 à l’origine d’un saut d’exon en phase
I.1.2. Les variations IVS±1/2 à l’origine de délétions exoniques ou de rétentions introniques en phase
I.1.3. Autres mécanismes à l’origine du maintien d’une fonction dans le contexte de variations IVS±1/2
I.2. Les variations non-sens à l’origine d’un épissage en phase et responsables du maintien d’une fonction au niveau de la protéine
I.2.1. Les variations non-sens à l’origine d’un saut d’exon en phase
I.2.2. Autres mécanismes à l’origine d’un maintien d’une fonction dans le contexte de variations non-sens
II. La problématique de l’interprétation clinique des variations hypomorphes
Références bibliographiques

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