Soutenance mémoire
La décidualisation survient en seconde phase du cycle menstruel
Le cycle menstruel chez la femme est d’une durée moyenne de 28 jours . Celui-ci débute par une première phase, la phase proliférative, où l’œstrogène circulante favorise la prolifération des cellules de l’endomètre. Ensuite, autour du quatorzième jour, l’ovulation est déclenchée suite au pic de l’hormone lutéinisante (LH). Par la suite a lieu la seconde phase du cycle menstruel, appelée phase sécrétoire. Au cours de cette dernière, il y a formation et persistance du corps jaune qui sécrète une hormone stéroïdienne très importante, la progestérone (P4). Cette hormone est responsable du remodelage utérin, et donc de la décidualisation, qui survient au cours de la phase sécrétoire du cycle menstruel, en vue de préparer l’endomètre à une grossesse. Six jours après l’ovulation, donc au jour du cycle menstruel, l’endomètre devient réceptif et donc, apte à accueillir un embryon.
La décidualisation, qui est nécessaire pour soutenir l’embryon qui s’implante, survient entre les jours 23 et 28 du cycle, ce qui coïncide avec la période où l’endomètre est réceptif. Cependant, il est à noter que, contrairement à plusieurs espèces, la décidualisation du stroma endométrial chez l’humain est initiée indépendamment de l’implantation d’un embryon : elle est donc initiée lors de chaque cycle menstruel.
Régulation négative de l’activité de p53
L’oncoprotéine « mouse double minute 2 » (MDM2) joue un rôle clé dans la régulation négative de l’activité de p53. Les niveaux intracellulaires des deux protéines sont intimement liés par une boucle de rétroaction négative . Au niveau du promoteur de MDM2, se trouve une séquence consensus sur laquelle la protéine p53 active se lie afin d’induire l’expression génique de MDM2 . Une fois traduite et phosphorylée, MDM2 peut être transportée au noyau et se lier à la partie N-tenninale de p53, ce qui entrave l’activité de celle-ci . De plus, MDM2 possède une activité de ligase de l’ubiquitine très spécifique pour p53 : elle fixe des chaînes d’ubiquitine sur des résidus lysine de la partie C-terminale de p53, entraînant la dégradation de celle-ci par le protéasome cytoplasmique . Toutefois, une étude réalisée chez les souris ayant une délétion constitutive de MDM2 a démontré que, bien que les niveaux intracellulaires de p53 soient élevés, celle-ci est quand même dégradée dans la cellule . Ceci suggère l’existence d’une voie alternative de dégradation de p53, indépendante de MDM2 in vivo. En effet, des recherches in vitro ont révélé que d’autres ligases de l’ubiquitine telles que COPI, PIRH2 , Arf-BPI et MDM4 sont impliquées dans le contrôle de la quantité de p53 intracellulaire. Néanmoins, le rôle précis de ces voies de dégradation indépendantes de MDM2 in vivo n’est pas clairement établi à ce jour.
Activité de p53 et son rôle de régulation du cycle cellulaire
Une des fonctions de la protéine p53 est d’inhiber la prolifération cellulaire en transactivant de nombreux gènes impliqués dans le cycle cellulaire. Par exemple, en réponse à un dommage à l’ADN, l’augmentation de l’expression de p53 active la synthèse d’inhibiteurs de kinases cycline-dépendante, tel que p2l, ce qui provoque un arrêt du cycle cellulaire en phase G1. La protéine p2l est une importante régulatrice du cycle cellulaire: elle a la capacité d’inhiber des kinases cycline-dépendante aussi bien en phase G1 qu’en phase G2/M du cycle . Lorsque l’arrêt du cycle cellulaire se produit en phase G2, l’activation de p53 augmente l’expression de p2l, puis inactive Cdc2 et cycline BI, inhibant ainsi la formation du complexe Cdc2/cycline BI nécessaire au passage de la phase G2 à M du cycle. Ces protéines peuvent servir de marqueurs de 16 l’activité de p53. Il est donc possible pour p53 activée de réguler le cycle cellulaire durant les phases Giet G2/M .
Activité de p53 et son rôle dans l’induction de l’apoptose
Lors de dommages irréversibles à l’ADN, le facteur de transcription p53 module l’expression de gènes cibles afin d’induire l’apoptose de la cellule. Pour se faire, p53 réprime l’expression génique de BCL-2, une molécule au rôle anti-apoptotique, en plus de favoriser l’expression de plusieurs gènes pro-apoptotiques tels que PUMA, NOXA et BAX.Ceci enclenche une cascade de signalisation provoquant la mort de la cellule : PUMA interfère avec la séquestration de p53 par BCL-XL dans le cytoplasme, permettant ainsi la libération de p53 sous sa forme activée. Cette dernière peut alors interagir avec BAX et induire sa translocation au niveau de la membrane mitochodriale, ce qui contrecarre l’effet antiapoptotique de BCL-2 et BCL-XL. Des changements de la perméabilité des membranes mitochondriales s’ensuivent qui entrainent la relâche de facteurs apoptotiques (smacDIABLO, cytochrome c … ), l’activation des caspases et ultimement l’apoptose de la cellule. Ainsi, l’expression de gènes pro-apoptotiques tels que PUMA, NOXA et BAX peut servir de marqueur de l’activité pro-apoptotique de p53 dans la cellule.
Modèle cellulaire et approches expérimentales
Le modèle cellulaire employé provenait d’une lignée de cellules stromales de l’endomètre humain (HIESC) transformées à l’aide de l’antigène T large de SV40 par Dr Michel A. Fortier et son équipe du Centre de recherche du Centre hospitalier de l’Université Laval (CHUL). L’induction de la décidualisation in vitro a été réalisée en se basant sur un modèle déjà bien établi qui consiste à ajouter 1 µM d’acétate de médroxyprogestérone (MP A) et 0,5 mM de 8-bromo-AMPc (Br-AMPc) pour des durées pré-défmies . La validation de l’efficacité du procédé de décidualisation a été faite en deux étapes : premièrement en documentant les changements morphologiques des cellules par microscopie optique en contraste de phase et deuxièmement, en mesurant la quantité de PRL sécrétée, marqueur spécifique de décidualisation, par la technique «enzyme immunoassay» (EIA). Une fois la validité du modèle de décidualisation établie, l’analyse des protéines d’intérêt, dont p53, a été réalisée par WB. L’inhibiteur pharmacologique H89 a été employé pour investiguer le rôle de la voie de la PKA dans la régulation de p53 au fil de la décidualisation. Finalement, la localisation intracellulaire de p53 a été observée par immunofluorescence.
Évaluation de la localisation intracellulaire de p53 par immunofluorescence
Les cellules ont été cultivées sur lamelles avant d’ être traitées tel que mentionné précédemment. Les cellules ont ensuite été fixées à l’ aide de paraformaldéhyde 4 % pendant 10 minutes puis lavées deux fois avec du PBS (phosphate buffered saline) et finalement perméabilisées pendant trois minutes à température ambiante, dans une solution de sodium citrate 0.1 %, Triton X-100 0.1% dans du PBS. Ensuite, ces cellules ont été incubées à température ambiante pendant une heure, avec l’anticorps primaire p53 dilué à 1/2000 dans le PBS. Finalement, une deuxième incubation a été pratiquée, avec l’ anticorps secondaire « Alexa Fluor 594 conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody, A-21206 » d’Invitrogen (Burlington, ON), dilué à 1/200 dans le PBS. L’ADN du noyau cellulaire a été contrecoloré à l’ aide de Hoechst 0,25 mg/ml (Sigma) pendant trois minutes avant que les cellules soient recouvertes d’une lamelle. Enfin, les cellules colorées ont pu être observées par microscopie à fluorescence à l’ aide d’un microscope Carl Zeiss Axio Observer ZI. Le grossissement final était de 630X.
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Table des matières
CHAPITRE 1 :INTRODUCTION
1.1 Décidualisation
1.1.1 La décidualisation survient en seconde phase du cycle menstruel
1.1.2 La biologie cellulaire et moléculaire de la décidualisation
1.1.2.1 Régulation du cycle cellulaire des CSE humaines durant la décidualisation
1.1.3 Problématique de recherche liée à la décidualisation
1.2 p53
1.2.1 Historique de la protéine p53
1.2.2 Biochimie de la protéine p53
1.2.2.1 Domaines fonctionnels de p53
1.2.3 Rôle général de p53 dans la cellule
1.2.4 Régulation de p53
1.2.4.1 Régulation négative de l’activité de p53
1.2.4.2 Activation de la protéine p53
1.2.4.3 Régulation de p53 par des modifications post-traductionnelles
1.2.4.4 Régulation de l’activité transactivatrice de p53
1.2.5 Activité de p53 et son rôle de régulation du cycle cellulaire
1.2.6 Activité de p53 et son rôle dans l’induction de l’apoptose
1.2.7 Localisation intracellulaire de p53
1.3 Le rôle potentiel de p53 dans la décidualisation
1.4 Problématique de recherche
1.5 Objectifs et hypothèses
1.6 Modèle cellulaire et approches expérimentales
CHAPITRE II :MATERIEL ET METHODES
2.1 Cellules et réactifs
2.2 Procédures expérimentales
2.2.1 Décidualisation in vitro des HIESC
2.2.2 Validation de la décidualisation par le dosage de la prolactine sécrétée
2.2.3 Inhibition pharmacologique de la voie de la PKA à l’aide du H89
2.2.4 Validation de la décidualisation par microscopie en contraste de phase
2.2.5 Immunobuvardage de type Western (WB)
2.2.6 Évaluation de la localisation intracellulaire de p53 par immunofluorescence
2.2.7 Analyses statistiques
CHAPITRE III: RESULTATS
3.1 Validation de la décidualisation des HIESC
3.1.1 Changements morphologiques des HIESC décidualisées
3.1.2 Sécrétion du marqueur protéique prolactine par les HIESC décidualisées
3.2 Accumulation de p53 dans les HIESC au fil de la décidualisation
3.3 Implication de la voie de la PKA dans la régulation de p53 durant la décidualisation
3.3.1 Inhibition de la voie de la PKA dans les HIESC
3.3.2 Inhibition de la voie de la PKA dans les HIESC en décidualisation
3.4 Régulation de p53 par des modifications post-traductionnelles dans les HIESC au fil de la décidualisation
3.4.1 Analyse de la variation de la phosphorylation de la sérine 15 de p53
3.4.2 Analyse de la variation de l’acétylation de la lysine 382 de p53
3.5 Étude de l’activité de p53 à travers l’analyse de gènes cibles pendant la décidualisation
3.5.1 Mesure des niveaux de la protéine p21 dans les HIESC
3.5.2 Mesure des niveaux de la protéine cycline BI dans les HIESC
3.5.3 Mesure des niveaux de la protéine Cdc2 dans les HIESC
3.6 Localisation intracellulaire de p53 au cours de la décidualisation
CHAPITRE IV :DISCUSSION
CHAPITRE V :CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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