Le récepteur glutamatergique AMPA

Modification synaptique à long terme (LTP/LTD) dans l’hippocampe

Les récepteurs inonotropiques glutamatergiques AMPA et NMDA

Récepteurs AMPA

Le récepteur glutamatergique AMPA est le principal responsable de la dépolarisation rapide de la cellule et ce principalement en laissant entrer le sodium extra cellulaire. Il laisse passer aussi le calcium mais sa contribution n’est que de un vingtième de celle du récepteur NMDA (Garaschuk, Schneggenburger et al. 1996). La sous-unité GLUR1 peut être phosphorylée par la CaMKII sur la serine 831 (Barria, Derkach et al. 1997). Ceci augmente la conductivité du récepteur (Derkach, Barria et al. 1999) et représente une des bases de l’expression du LTP.

Récepteur NMDA

Le récepteur NMDA (NMDAR) se démarque des autres canaux ioniques activés par liaison de ligand par le fait qu’il nécessite la présence de glutamate et de glycine pour être activé (Johnson and Ascher 1987). Étant donné le niveau basai de chacun de ces acides aminés et leur IC50 respectif, i.e. glutamate: niveau basai ~ 0.3 uM (Westergren, Nystrom et al. 1994), IC50 ~ 5 uM (Kew, Koester et al. 2000) et glycine: niveau basai 1.8 uM (Westergren, Nystrom et al. 1994), IC50 – 0.08 uM (Kew, Koester et al. 2000), le glutamate joue le rôle de neurotransmetteur alors que la glycine jouerait un rôle de modulateur. Le NMDAR est normalement bloqué par l’ion Mg2+ du côté extracellulaire (Mayer, Westbrook et al. 1984; Nowak, Bregestovski et al. 1984) mais aussi du côté intracellulaire (Johnson and Ascher 1987).

Lorsque la cellule se dépolarise suffisamment, grâce à l’action des récepteurs AMPA, l’ion Mg2+ dégage le canal pour laisser entrer l’ion Ca2+. Le récepteur NMDA possède plusieurs sites de liaison capables de moduler son action. Le récepteur NMDA laisse passer 20 fois plus de calcium que le récepteur AMPA (Garaschuk, Schneggenburger et al. 1996). En fait, la majorité du calcium dans la synapse passerait par le NMDAR (Kovalchuk, Eilers et al. 2000).

Le récepteur NMDA est composé de deux sous-unités NR1 et deux sous-unités NR2A/NR2B. Dans l’hippocampe du rat, la composition en NR2B prédomine chez le nouveau-né pour devenir minoritaire éventuellement chez l’adulte (Monyer, Burnashev et al. 1994). Une souris qui exprime beaucoup plus de NR2B a vu ses capacités cognitives nettement améliorées (Tang, Shimizu et al. 1999). Les sous-unités NR2A et NR2B ont des queues cytoplasmiques beaucoup plus grandes que la sous-unité NR1 ce qui leur permet des interactions avec diverses protéines dont la CaMKII. La CaMKII autophosphorylée a un site de liaison avec les sous-unités NR2A comme NR2B. Elle peut également phosphoryler le récepteur NR2B. La liaison avec NR2A serait en compétition avec la liaison NR2A-PSD95 (Gardoni, Schrama et al. 2001).

L’affinité qu’a la CaMKII pour le récepteur NMDA lui permet d’être positionnée de façon optimale pour « voir » les entrées de calcium synaptique. La CaMKII a une affinité moins grande pour l’extrémité C terminale de la sous-unité NR2A (Léonard, Lim et al. 1999; Strack, Robison et al. 2000; Mayadevi, Praseeda et al. 2002). La liaison de la CaMKII au récepteur NR2B peut aussi verrouiller l’enzyme dans un mode actif indépendamment du Ca2+ et de son niveau de phosphorylation (Bayer, De Koninck et al. 2001). On rapporte que 65% des NMDARs sont mobiles (Tovar and Westbrook 2002). Cette mobilité amène la possibilité d’une modulation assez rapide de l’entrée de calcium .

Méthode

Rappelons que l’hypothèse est que la translocalisation de la CaMKII à la synapse est nécessaire pour l’expression de la potentialisation. Des études précédentes utilisant des mutants de la CaMKII ont identifié des sites importants sur celle-ci lui permettant d’aller à la synapse. La stratégie pour tester cette hypothèse était de mesurer en électrophysiologie l’évolution des courants synaptiques spontanés dans des neurones transfectés avec les mutants susmentionnés suite à l’application d’un protocole visant à générer une potentialisation.

Modèle utilisé: cultures dissociées d’hippocampe du rat naissant
Un animal est un environnement étroitement contrôlé malgré la variabilité du milieu environnant. En culture, le phénotype des cellules est une fonction directe des conditions de culture: température, compositions chimiques, pH, lumière, patrons des concentrations dans le temps dont notamment les facteurs diffusibles sécrétés dans le milieu extracellulaire, prolifération de la glie, etc. Le modèle utilisé par le laboratoire est la culture des neurones de l’hippocampe de rats de Norvège de souche Sprague-Dawley nouveau-nés (1 à 3 jours) d’une même portée maintenus en culture pendant deux à trois semaines.

Protocole de culture

Les hippocampes de rats sont disséqués chez des rats naissants d’une même portée à un âge de un à trois jours. Il est à noter que la culture résultante est une chimère des rats autant mâles que femelles puisque les neurones sont mélangés. Quel peut être l’impact d’utiliser une chimère? Est-ce que ceci peut contribuer à la variabilité des résultats?

Le protocole complet est donné en annexe mais en voici un résumé simplifié. Les hippocampes sont dissociés de façon mécanique avec une pipette pasteur et de façon enzymatique avec une solution de papaïne et de solution balancée de sels de Hanks. Une certaine partie des neurones survivront à ce traitement sous la forme de sphères qui seront séparées des débris. Ces neurones sphéroïdes sont ensuite déposés par gravité sur les disques d’Aclar ou de verre couvert de polylysine, une substance biocompatible. Les cultures sont ensuite incubées pendant 2 à 3 semaines avant d’être utilisées pour les expériences. Pendant la période d’incubation, les cultures sont nourries deux fois par semaine en remplaçant la moitié du milieu de culture avec du neurobasal frais.

Milieu de culture

Cette section présente le milieu de culture et essaie d’identifier certains points qui peuvent amener une variabilité dans les résultats. Le milieu de culture utilisé est un milieu purement synthétique, c’est à dire qu’il est composé d’éléments à la composition précisément connue. L’alternative, qui est d’utiliser un milieu à base de sérum animal, apporte une variabilité importante. Il a été initialement développé et optimisé par Brewer pour avoir une survie maximale des neurones embryonnaires (Brewer, Torricelli et al. 1993).

Il baptisa ce milieu le « neurobasal ». Dans une publication subséquente, il optimisa la composition pour les neurones du rat adulte (Brewer 1997) « neurobasalA ». Il est a souligné ici que le modèle du laboratoire consiste en des neurones de rats nouveau-nés et se situe donc au milieu des deux situations étudiées par Brewer. Or, le milieu de culture utilisé dans notre cas est le neurobasal. Le milieu optimal pour notre modèle pourrait donc être à mi-chemin entre le neurobasal et le neurobasal A.

Table des matières

Résumé
Abstract
Avant-propos
Introduction
Le système nerveux
L’hippocampe
La mémoire et l’hippocampe
Architecture de l’hippocampe
Modification synaptique à long terme (LTP/LTD) dans l’hippocampe
L’épine dendritique
Le calcium
La calmoduline (CaM)
La kinase calmoduline dépendante II (CaMKII)
Autres kinases majeures : PKA et PKC
Les récepteurs inonotropiques glutamatergiques AMPA et NMDA
Récepteurs AMPA
Récepteur NMDA
Méthode
Modèle utilisé: cultures dissociées d’hippocampe du rat naissant
Protocole de culture
La technique du patch-clamp
Transport et mise en place de l’échantillon
Le choix des cellules
La perfusion
Obtention d’un « gigaseal »
Compensation
Le problème du bruit électrique
Le problème de la dérive de la pipette
Solution extracellulaire
Solution intracellulaire
Analyse des minis
Résultats
Tentatives de reproduction de protocoles de LTP en culture
Lu et al., 2001 42 Oh et al. 2005
Impact de la transfection de mutants de la CaMKII sur la force synaptique
Possible potentialisation des minis de types glutamatergiques par application prolongée d’une lumière intense
Discussion
Le mot de la fin Références Annexes Le projet Rig Le logiciel libre Rig
Le matériel Rig
Sites critiques de l’alpha CaMKII
Lys42 75 Thr286 75 Thr305 et Thr306
Le segment d’autorégulation de l’alpha-CaMKII
Quelques mutants intéressants de l’alpha CaMKII
1-290
1-326 (mCaMKII)
T286D
T286A
T305/306D
K42M
I205K
Méthode de dissociation et culture de neurones de l’hippocampe
Préparation des disques d’Aclar pour la culture de neurones

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