Soutenance mémoire
Le Nucléole
Historique Le nucléole est le compartiment non-membranaire le plus proéminent du noyau des cellules eucaryotes. Il fut observé pour la première fois par Fontana (1781) dans des cellules « visqueuses » épidermales d’anguille. Il le décrivit alors comme « un corps oviforme, pourvu d’une tache en son milieu ». Puis c’est en 1836 qu’il fut nommé « nucléole », signifiant un noyau dans le noyau, par Valentin. Depuis lors, le nucléole a été l’objet de nombreuses études, et c’est dans les années 1930, avec l’arrivée des premries microscopes électroniques, qu’un premier lie n entre la formation du nucléole et la chromatine a été dévoilé (Heitz, 1931). Cette étude a permis de confirmer que la formation du nucléole suit le cycle cellulaire (observé en télophase), et de démontrer que cette formation se déroule au niveau de régions chromosomiques présentant des structures secondaires denses (« secondary constrictions »), telles que les knobs. Quelques années plus tard, McClintock ( 1934) confirma ces ana lyses et , par l ’étude de mutants de maïs, elle permit de démontrer que chacune de ces constrictions secondaires était à l’origine de la formation d’ un nucléole (Figure 1A ). Ainsi, elle dénomma ces régions chromosomiques les « éléments or ganisateurs du nu cléole » ( « nucleolar or ganizer elements »).
Les structures liées à la biogenèse des ribosomes
Historiquement, seules deux structures internes au nucléole étaient connues (Figure 2) : « les voies organisatrices », aussi appelées « nucleolonema » pour leur forme réticulaire, et le « reste ». Par la suite, ont été définies des régions dites « fibrillaire » et « granulaire » (Godward, 1950; Granboulan and Granboulan, 1964, 1965; Shawand J ordan, 1995; Stępiński, 2014). Nous savons maintenant qu’en fait, la composition, la taille et le nombre de nucléoles est très variable d’un organisme à l’autre (Montgomery, 1898; Shaw, 2015). Nous pouvons cependant faire ressortir quelques généralités, observables en Figures 3C et D : la majorité des nucléoles sont tripartites avec la région fibrillaire qui se subdivise en deux parties : les Centres Fibrillaires (Fibrillar Centers, FC) e t le Composé Fibrillaire D ense (D ense Fibrillar Component, DFC), et enfin la région granulaire qui est appelée le Composé Granulaire (Granular Component, GC). Il reste cependant deux grandes exceptions à cet te ré partition, les insectes, notamment Drosophila melanogaster, et la levure Saccharomyces cerevisiae. En effet, les FC ne sont pas observés chez les insectes (Figure 3B), mais une sorte de zone fibrillaire compacte pourrait partiellement remplacer les centres fibrillaires (Knibiehler et a l., 1984; Thiry et al., 1991) . Tandis que chez la levure (Figure 3A ), on ne distingue que les composés granulaire et fibrillaire, ce dernier ne pouvant pas être sous catégorisé en DFC et FC (Thiry and Lafontaine, 2005).
Formation et désassemblage du Nucléole
La formation et la dissociation du nucléole suivent le cycle cellulaire, lié à l’expression des gènes. C ’est e n 1898, par Montgomery, que ce cycle d’assemblage/désassemblage du nucléole fût observé en suivant le cycle cellulaire. A cette époque, le nucléole est clairement perçu lors de la télophase et sa dissolution est observée dans les autres phases de la mitose : prophase, métaphase et anaphase. Pendant toute l’interphase, le nucléole est actif, c’est-à-dire que les ADN ribosomiques, situés dans les centres fibrillaires (FC), sont transcrits par l’ARNPolI, à la périphérie FC/DFC, puis maturés, d’abord dans le DFC puis dans le composé granulaire. En revanche lors de la mitose, on observe un désassemblage progressif du nucléole (Figure 6, d’après Hernandez-Verdun et al., 2002). Lors de la dissociation du nucléole, ce sont d’abord les éléments servant à la maturation des ARN qui se désassemblent en tout début de prophase avant que la transcription par l’ARNPolI ne s’arrête. Cet arrêt est rendu possible par la phosphorylation des protéines incluses dans les complexes de maturation, comme la Nucléophosmine ( NPM) et les facteurs de transcription de l ’ARNPolI, TTF-1 ( transcription termination f actor 1) et SL1 (selectivity factor protein complex 1) par exemple (voir section – La transcription des ADNr 45S), par la Cdk1-cyclin B ki nase. La phosphorylation de ces protéines occasionne une perte d’affinité pour leur ligation à l’ARN et/ou ADN, ce qui entraine leur dissociation du nucléole. En fin d’anaphase, début de télophase, les phosphatases PP1 et PP2A inhibent l’activité de la Cdk1-cyclin B kinase. Elles permettent ainsi la déphosphorylation des facteurs de transcription de l’ARNPolI et celle d es protéines liées à la maturation des ARN ribosomiques, afin de rétablir ces processus et reformer un nucléole. Pourtant, la seule transcription des ARNr ne peut conduire à la reformation d’un nucléole. Cela nécessite la présence de précurseurs d’ARNr créés lors du cycle précédent et la présence de protéines ribosomales et snoRNA, nécessaires à la maturation des ARNr. Ces éléments vont alors s’assembler en corps pré-nucléolaires (prenucleolar bodies, PNB) autour des NOR (Hernandez-Verdun, 2011; Leung and Lamond, 2003; Sirri et al., 2008).
Texture du Nucléole
Le nucléole est très dynamique, d’ailleurs sa « structure physique » parait très malléable. En effet, on p eut observer la fusion de plusieurs nucléoles pour n’en former qu’un, plus conséquent et unique (Godward, 1950). De plus dans des embryons de C.elegans, la taille du nucléole est proportionnelle à celle des cellules, mais elle de vient inversement proportionnelle, des nucléoles plus gros dans des cellules plus petites et inversement, lorsque la taille de l’embryon elle-même est affectée (Weber and Brangwynne, 2015) . Aussi , une « suractivité » de l’ARNPolI induit une hypertrophie du nucléole, comme dans les cellules cancéreuses (Bailey et al., 1976; Cooper, 2000; Derenzini et al., 2009; Ma et al., 2016). Cette plasticité du nucléole pourrait être expliquée par une étude réalisée sur des oocytes de Xénope, dé montrant que l es nucléoles présentent un aspect visqueux in vivo, formant des sortes de « gouttes » d ’ARN e t de pr otéines (Figure 8A e t B); et confirme de précédentes observations de nucléoles entrant en contact et fusionnant en un seul (Brangwynne e t a l., 2011). Plus précisément, chaque compartiment à l’intérieur du nu cléole (FC, DFC et GC) présente cet aspect de gouttelettes (Figure 8B et C), qui cette fois sont non miscibles les unes avec les autres. Ceci, à cause de leurs propriétés physico-chimiques, notamment hydrophiles ou hydrophobes, qui s ont fonction du contenu en ARN et protéines de chaque compartiment (Feric et al., 2016). Ces pr opriétés physiques de s nucléoles peuvent en partie expliquer et déterminer le s structures du nucléole ainsi que leur taille (Brangwynne et al., 2011; Feric et al., 2016). De plus, ces observations sont étayées par les études sur les aluRNA, qui interagissent avec la nucléoline, la fibrillarine et la nucléophosmine, des protéines impliquées dans la transcription et la maturation des ARNr (Németh and Grummt, 2018).
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Table des matières
PRÉFACE
INTRODUCTION
Le Nucléole
Historique
Structures du Nucléole
Les structures liées à la biogenèse des ribosomes
Les autres structures du nucléole
Les structures s’associant au nucléole
Formation et désassemblage du Nucléole
Texture du Nucléole
Les autres rôles du Nucléole
Le nucléole dans l’organisation chromatinienne
Le nucléole et le métabolisme des ARN
Le nucléole un senseur de stress et remobilisateur des protéines
Le Nucléole et les ribosomes
Les protéines ribosomales
Les ARN ribosomiques 5S
Les gènes d’ARN ribosomiques 45S
Organisation des ADNr 45S
Gènes actifs et inactifs
La transcription des ADNr 45S
Promoteur des ADNr
L’ARN Polymérase ADN dépendante I (ARNPol I) et ses facteurs de transcription
Mécanismes de régulation de la transcription
Maturation des ARNr
Maturation par clivage
Maturation par modifications chimiques
Biogenèse / Assemblage
Le complexe pré-90S
Les pré-sous-unités 40S et 60S
Sous-unité matures et assemblage du ribosome
OBJECTIFS
RÉSULTATS
PARTIE 1 : LE NUCLEOLE, SON PROTEOME ET LE PROTEASOME
Présentation du 26S Protéasome
Composition
La voie de régulation Ubiquitine / 26S Protéasome
Rôle de l’ubiquitine et du protéasome dans la régulation de l’expression des gènes
Protéasome et nucléole
Partie 1-1 : Article publié dans Frontiers in Plant Science
Partie 1-2 : Le nucléole à 37°C chez A. thaliana
L’expérimentation
L’analyse structurale des nucléoles
Le protéome nucléolaire à 37°C
PARTIE 2 : LE FER DANS LE NUCLEOLE
Le Fer dans les plantes
Du sol aux racines
Dans la plante
Le fer acteur dans la cellule
Protéines à cœur fer-soufre et biogenèse des ribosomes
Article en préparation
DISCUSSION et PERSPECTIVES
Le protéome nucléolaire
Le protéasome dans le nucléole
Le nucléole face au stress
Le fer nucléolaire et son impact sur la biogenèse des ribosomes par l’étude du mutant nas1,2,4
MATÉRIEL et MÉTHODES
Matériel biologique
Les plantes
Les conditions de culture
Méthodes relatives à l’ADN et aux ARN
Extraction ADN / ARN / Chromatine
PCR / RT-PCR
Traitement de l’ADN au Bisulfite et analyses
Immuno-précipitation de la Chromatine (ChIP)
Northern Blot
Séparation des monosomes/polysomes : Gradients de sucrose
Méthodes relatives aux protéines
Extraction et Révélations
Tri des nucléoles : FANoS
Séparation noyau / cytoplasme pour les essais d’activité du protéasome
Extraction des protéines totales et mesure de l’activité protéasomale
Activité Redox
Méthodes de microscopie
DAB
Structure du nucléole par fluorescence
Structure du nucléole par microscopie électronique
BIBLIOLGRAPHIE
ANNEXES
Annexe 1 : Article publié dans The Plant Cell
Annexe 2 : Article en préparation
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