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Formation et caractérisation des espèces réactives de l’oxygène chez les organismes photosynthétiques
La formation des espèces réactives de l’oxygène (ERO) est importante dans la chaîne photosynthétique procaryote ou eucaryote. Cette dernière peut laisser échapper une certaine proportion d’électrons qui vont alors réduire que partiellement l’oxygène et ainsi former des ERO (Revue: Asada, 1994, 2006a).
En condition de forte lumière, la chaîne de transport d’électrons est saturée et les ERO se forment au sein des photosystèmes I et II. La fuite d’électrons sur l’oxygène moléculaire forme le radical superoxyde (O2 .-), connu pour initier une cascade de réactions conduisant à la formation du peroxyde d’hydrogène (H2O2) et au très oxydant hydroxyle (.OH-).
L’oxygène subissant une réduction monoélectronique, par l’addition d’un seul électron, conduit à la formation du radical superoxyde (O2 .-) : O2+ e- à O2
Le peroxyde d’hydrogène H2O2 peut se former par réduction non-enzymatique du superoxyde. Le superoxyde se dismuterait spontanément en H2O2 et en oxygène moléculaire par interaction entre deux radicaux superoxydes: O2 .-+ O2 .- à H2O2 + O2. Si le superoxyde s’est formé au sein du site accepteur d’électrons du PSII, au PQ pool, il est réduit par la plastoquinol pour former l’H2O2 : O2 .- + PQH2 à H2O2 + PQ.-, mais il peut aussi être formé par réduction enzymatique, par la superoxyde dismutase (McCord and Fridovich, 1969a).
Le radical hydroxyle, puissant oxydant, est formé par la réduction mono-électronique du H2O2. Selon le mécanisme de Fenton, le H2O2 est réduit par des métaux libres. Dans la réaction de Fenton (Fenton, 1876), le H2O2 serait réduit par le Fe2+ libre provenant du PSII endommagé sous de fortes illuminations : H2O2+ Fe2+ —> Fe3+ + .OH + -OH. Ce radical attaque tout ce qui l’entoure et est très toxique (Gutteridge and Halliwell, 1990). C’est le radical le plus réactif, il est largement incriminé dans le processus du stress oxydant.
Le cas de l’oxygène singulet (1O2) est un peu différent. L’oxygène singulet est un état instable de l’oxygène. L’oxygène, dans son état fondamental, est à l’état triplet. L’oxygène triplet peut devenir singulet après absorption d’un photon (Figure 2). Sa durée de vie est courte, de l’ordre de quelques micro-secondes. C’est un oxydant fort, impliqué dans de nombreux processus de photo-oxydation. L’oxygène fondamental O2 (gauche), se caractérise par une configuration électronique 3Σg – et correspond à deux électrons à spins parallèles ( ) répartis entre deux orbitales π* et π*.
L’oxygène singulet (droite) est un état instable de l’oxygène O2 et se caractérise par une configuration électronique particulière, notée 1Δg, dans laquelle les deux électrons possèdent des spins opposés ( ) et se trouvent sur une même orbitale antiliante π*.
Au sein des organismes photosynthétiques, en condition de forte lumière, l’oxygène singulet est généré par l’énergie d’excitation triplet-singulet transférée depuis la chlorophylle excitée, état triplet, à l’oxygène moléculaire : O2(3Σg -) + 3Chl* à O2(1Δg) + Chl (Figure 3). La chlorophylle triplet est formée de deux façons : la première est depuis la chlorophylle singulet au sein du complexe antennaire du PSII ou par recombinaison de charges au sein du centre réactionnel du PSII (Revue :Krieger-Liszkay, 2005,Figure 3). L’organisme photosynthétique est soumis à un stress oxydant lorsque l’énergie lumineuse absorbée est plus importante que celle qui peut être utilisée dans la photosynthèse. L’oxygène singulet peut être neutralisé par interaction avec les caroténoïdes (β-carotène, lutéine et zéaxanthine), l’α-tocophérol ou peut réagir avec la protéine D1 du photosystème II (Figure 3, d’après la revue :Krieger-Liszkay, 2005).
Malgré leur toxicité démontrée et incontestée, les ERO peuvent toutefois jouer un rôle au sein du fonctionnement cellulaire : elles sont aussi des messagers de la signalisation cellulaire (Figure 3). Elles ont des rôles multiples dans l’orchestration de l’expression des gènes de la plante. L’homéostasie redox est considérée comme un » intégrateur » des informations du métabolisme cellulaire et de l’environnement. Elle contrôle ainsi la prolifération cellulaire, la croissance de la plante, les réponses d’acclimatation, ainsi que l’événement de mort cellulaire programmée, l’apoptose (Foyer and Noctor, 2008; Krieger-Liszkay, 2005a; Triantaphylidès and Havaux, 2009).
Le vaste monde des Antioxydants
Les antioxydants enzymatiques
Les organismes tentent de « garder l’oxygène actif sous contrôle » (Noctor and Foyer, 1998).
Mais si les cellules sont soumises à un stress trop important, les ERO peuvent se former à partir de l’oxygène. Les organismes ont créé des systèmes de défense antioxydants hautement efficaces, chez les cellules de mammifères (Revue: Blokhina et al., 2003), comme chez les organismes photosynthétiques (Foyer et al., 1994). Le système d’élimination des ERO repose sur différents types de mécanismes enzymatiques tels que : la superoxyde dismutase (SOD), la glutathion peroxidase (GPX) et la catalase (CAT) (Livre : Halliwell and Gutteridge, 1999).
Les enzymes antioxydantes les plus étudiées sont : la superoxyde dismutase (SOD), la catalase (CAT), la glutathion peroxydase (GPX), la glutathion réductase (GR) et la glutathion S-transférase (GST). Les séquences génétiques de ces enzymes ont été conservées au cours de l’évolution, ce qui prouve leur importance au sein de la cellule (Revue: Blokhina et al., 2003).
La superoxyde dismutase (SOD) est une métalloprotéine qui a été découverte en premier chez les mammifère (McCord and Fridovich, 1969b) puis dans les cholorplastes des cellules végétales (Asada, 2006a). La SOD régule la concentration de l’O2-. intracellulaire en accélérant la dismutation du radical O2-. en H2O2. Les SOD représentent la première défense enzymatique contre les ERO (Scandalios, 1993).
La catalase (CAT) est une enzyme qui contient un groupe hème qui catalyse la décomposition du H2O2 en H2O et O2 (Vainshtein et al., 1981).
La glutathion peroxydase (GPX) est une enzyme permettant également la décomposition du H2O2. Elles permettent la décomposition de l’H2O2 par l’oxydation de son co-substrat, le GSH en GSSG, qui sera réduit par la suite par l’action de la glutathion réductase (Review : Blokhina et al., 2003).
La glutathion réductase (GR) n’est pas une enzyme antioxydante dans le sens étymologique du terme car elle n’agit pas directement sur les ERO. Son rôle intervient dans réduction du glutathion (GSSG à GSH), puissant antioxydant et co-substrat de la GPX. Elle fut identifiée la première fois chez les plantes (Foyer and Halliwell, 1976). La GR permet la régénération du glutathion sous sa forme réduite (GSH) via la consommation de NADPH, évitant ainsi la synthèse de novo du glutathion (GSSG) qui présente un coût énergétique plus élevé, dû à la consommation d’ATP (Foyer and Halliwell, 1976; Halliwell and Foyer, 1978).
La glutathion S-transférase (GST) bénéficie aussi d’une action indirecte sur l’élimination des ERO en transportant le glutathion réduit (GSH) vers les zones cellulaires exposés à des dommages oxydatifs (Frear and Swanson, 1970). La GST possède un rôle de détoxication des cellules. Avec la GPX et la GR, elle joue un rôle central dans la lutte des ERO par le glutathion réduit (GSH).
Les enzymes citées ci-dessus constituent les premières défenses antioxydantes directes ou indirectes via la régénération et le transport du GSH. Il existe également d’autres défenses antioxydantes telles que les transferrines, les ferritines, les métallotionéines (Chiancone et al., 2004). Ces enzymes inhibent la biodisponibilité cellulaire des métaux lourds en les complexant, ce qui prévient les processus de production de radicaux libres. Enfin, les enzymes de réparation des molécules endommagés par les ERO, telles que les méthionines sulfoxydes, les réductases, les endonucléases et les ADN glycosylases, peuvent également être considérées comme des défenses antioxydantes (Revue : B Demple and Harrison, 1994).
Les antioxydants non-enzymatiques
Les principaux antioxydants non-enzymatiques sont le glutathion, la vitamine E, la vitamine C, les caroténoïdes et les thiols (fonction SH) dont certains sont synthétisés in vivo comme le glutathion (Revue :Cadenas, 1989). Il est commun de définir un « bon » antioxydant comme étant un bon « quencher » de ERO. Toutefois il est aussi nécessaire que l’antioxydant soit disponible dans la cellule, donc régénéré, recyclé in vivo de façon à jouer son rôle plusieurs fois.
La glutamylcystéine synthétase et la glutathion synthétase sont les deux enzymes qui interviennent dans sa synthèse. Le glutathion est primordial pour détoxifier les métaux lourds.
Le groupement thiol réagit avec les métaux lourds en créant avec eux une liaison soufre-métal pour qu’ils soient ensuite excrétés sans causer de dommages à la cellule. La fonction thiol du GSH lui confère son rôle antioxydant, soit réducteur (donneur d’électron ou d’atome H). Il est le substrat de plusieurs enzymes antioxydantes et est largement généré dans la cellule de novo ou facilement régénéré par le NADPH. Il joue un rôle majeur dans la détoxication des ERO formées dans la cellule (Foyer and Noctor, 2011; Noctor and Foyer, 1998).
Elle est localisée parmi les chaînes d’acides gras des phospholipides constituant les membranes et les lipoprotéines. Le rôle de la vitamine E est de capter les radicaux peroxyles lipidiques RO2 . qui propagent à leur tour les chaînes de peroxydation ; elle prévient et stoppe la peroxydation lipidique. Elle permet aussi le captage du superoxyde, de l’hydroxyle, ainsi que l’oxygène singulet.
Le tocophérol est présent dans les chloroplastes des plantes où il désactive principalement l’oxygène singulet et le radical hydroxyle et empêche la propagation de la peroxydation lipidique en piégeant les radicaux peroxyles dans les membranes thylakoïdes (Munné-Bosch, 2005).
Les animaux, eux, ne la synthétise pas, ils doivent donc puiser cette ressource dans l’alimentation.
Elle est synthétisée par les plantes et la plupart des animaux, excepté chez certains mammifères comme l’homme. C’est une molécule antioxydante qui réagit avec tous les ERO, prévenant ainsi la peroxydation lipidique et l’oxydation des protéines et de l’ADN. Lavitamine C a également un pouvoir antioxydant indirect en recyclant les caroténoïdes et lavitamine E (Padayatty et al., 2003). Elle peut aussi être régénérée dans le chloroplaste chezles plantes par d’autres mécanismes dépendant de la ferrédoxine ou du NADPH (Asada,1999).
Les caroténoïdes sont des composés isoprénoïdes hydrophobes synthétisés dans lesmembranes cellulaires (Figure 7). La majorité s’accumule au sein de complexes protéiquesdans la membrane photosynthétique. Les caroténoïdes les plus répandus dans le règne végétalsont le β-carotène et la zéaxanthine, mais les cyanobactéries, elles, synthétisent des cétocaroténoïdesrares tels que l’échinénone, l’hydroxyéchinénone ou la canthaxanthine et descaroténoïdes glycosylés tels que les myxoxanthophylles (Revue : Takaichi and Mochimaru,2007a). Chez Synechocystis, les principaux caroténoïdes accumulés sont le β-carotène, lazéaxanthine, l’echinénone et les myxoxanthophylles (Bramley et Sandmann 1985). Le β-carotène est le substrat de deux enzymes qui catalysent la formation de l’echinenone et de lazéaxanthine. L’enzyme β-carotène mono-cétolase CrtO, codée par le gène slr0088 chez Synechocystis PCC 6803 et l’enzyme β-carotène hydroxylase codée par le gène sll1468 chez Synechocystis PCC 6803 catalysent respectivement la formation de l’echinenone et de la zéaxanthine (Revue:Takaichi and Mochimaru, 2007a). L’hydroxy echinenone est synthétisé à partir de l’echinénone par l’enzyme CrtR (Fernández-González et al., 1997; Takaichi and Mochimaru, 2007a) .
Chez les organismes photosynthétiques, ils jouent un rôle majeur dans la capture de l’énergie solaire. Parmi les nombreux caroténoïdes, pas moins de cinquante jouent un rôle au sein de la récolte de la lumière (revue :Polívka and Frank, 2010). Les couleurs des caroténoïdes varient du jaune pâle au brun rougeâtre. Cette variation provient de la structure même de la molécule, selon le nombre de doubles liaisons conjuguées le long du squelette de 40 atomes de carbones (C40), ainsi que des autres modifications cycliques et oxygénés. Pour illustrer leurs couleurs, citons que lors de la période automnale, les végétaux deviennent de plus en plus jaunâtresrougeâtres, caractéristique de la couleur des caroténoïdes collecteurs de lumière, comme la lutéine et la zéaxanthine. Cela est dû à la dégradation de la chlorophylle à l’automne, qui laisse alors apparaître la couleur vive des caroténoïdes.
Les caroténoïdes absorbent la lumière et transfèrent l’énergie d’excitation reçue à la chlorophylle, initiant alors les événements photochimiques de la photosynthèse (Revue :Polívka and Frank, 2010). Ils jouent aussi un rôle structural en étant nécessaires à l’assemblage des photosystèmes (Hendrickson et al., 2005). Chez les plantes, les caroténoïdes sont généralement liés à des complexes protéine-pigment nommés LHC pour « Light Harvesting Complex » pour transférer l’énergie d’excitation captée au niveau des antennes collectrices vers la chlorophylle des photosystèmes (Demmig-Adams and Adams, 2006; Hendrickson et al., 2005; Dall’Osto et al., 2010).
Les plantes sont en permanence en équilibre entre absorption de la lumière pour les processus phototochimiques et lutte contre les dommages photo-oxydatifs causés par un excès de lumière. Pour s’adapter, les caroténoïdes synthétisés par les plantes jouent plusieurs rôles : ils sont capables de quencher les triplets de chlorophylles formés au sein de l’appareil photosynthétique sous un excès de lumière, ils quenchent aussi les ERO comme l’oxygène singulet qui endommagent fortement les membranes et les protéines (P Di Mascio et al., 1989 ; Revue :Krieger-Liszkay, 2005a), se comportant ainsi comme de véritables antioxydants, avec l’ascorbate et le tocophérol. Leur potentiel antioxydant pour lutter contre la peroxydation lipidique a été démontré très tôt (Krinsky, 1989; Monaghan and Schmitt, 1932).
De nombreuses études sur l’importance du cycle des caroténoïdes au sein des végétaux ont été menées. Des mutants délétés de gènes codant des enzymes impliquées dans la voie de biosynthèse des caroténoïdes ont été crées et les phénotypes résultants furent drastiques. Les plantes mutantes exposent des couleurs très pâles jusqu’au blanchiment, un retard important de leur croissance et des phénotypes semi-létaux (Alboresi et al., 2011; Bailey and Grossman, 2008; Niyogi, 1999).
Les caroténoïdes jouent un rôle majeur dans la photoprotection de l’appareil photosynthétique (Revue : Cazzonelli, 2011).
Le caractère bénéfique des caroténoïdes pour la santé n’est plus à démontrer. Il est largement admis qu’ils protègent les cellules contre le stress oxydatif et les humains contre les maladies chroniques telles que le cancer, les maladies cardiovasculaires, l’ostéoporose et le diabète (Revue : Rao and Rao, 2007).
Les animaux accumulent les caroténoïdes parce qu’ils sont essentiels pour la reproduction, les comportements sexuels mais aussi pour stimuler leur système immunitaire et améliorer leur santé (Baron et al., 2008; McGraw, 2006).
Citons pour exemple le flamant rose, dont les plumes sont de couleur rose vif. La couleur de leur plume est due à leur alimentation riche en algues et invertébrés comme les écrevisses, qui sont gorgés de caroténoïdes, tels que la canthaxanthine et la β-cryptoxanthine. La source alimentaire en caroténoïde dicte, chez ces animaux, une attraction sexuelle. La nature esthétique de l’accumulation des caroténoïdes dans le plumage engendre chez leur partenaire un attrait physique pour la reproduction. Le plumage riche en caroténoïdes permet alors aux flamants roses de courtiser pendant le saison des accouplements (Amat et al., 2010). Citons aussi les crustacés, comme le homard, qui accumulent l’astaxanthine dont les propriétés spectrales sont modifiées par l’environnement protéique dans lequel il évolue : au sein de la protéine crustacyanine. L’astaxanthine en solvant est de couleur rougeâtre, mais au sein de la crustacyanine, elle nous apparaît bleue. Lors de sa cuisson, le crustacé passe du bleu foncé au rouge car la protéine crustacyanine se dénature, l’astaxanthine change d’environnement où elle se retrouve plus exposée, le crustacé nous apparaît alors rouge (Krawczyk and Britton, 2001).
Les caroténoïdes sont capables de régénérer la vitamine E et sont eux-mêmes régénérés par la vitamine C (Revue : Krinsky, 1989).
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Table des matières
Introduction
1- Les espèces réactives de l’oxygène
1.1- Le paradoxe de l’oxygène et le stress oxydant
1.2- Formation et caractérisation des espèces réactives de l’oxygène chez les organismes photosynthétiques
2- Le vaste monde des Antioxydants
2.1- Les antioxydants enzymatiques
2.2- Les antioxydants non-enzymatiques
3- Le monde photosynthétique cyanobactérien
3.1- Les cyanobactéries et la photosynthèse
3.2- Les antennes collectrices d’énergie et la photoprotection
4- L’Orange Carotenoid Protein « OCP »
4.1- Structure et Photoactivité
4.3- Quenching d’énergie- Activité photo-protectrice
4.4- Quenching d’oxygène singulet
5- Escherichia coli, organisme modèle et modèle de production
5.1- Escherichia coli, organisme modèle à usine de production
5.2- Production de caroténoides chez Escherichia coli
5.3- Production de protéines à pigments chez Escherichia coli
Résultats
Chapitre I Mise en oeuvre du système de production hétérologue de l’OCP chez E.coli
Création des souches E.coli capables de synthétiser les caroténoïdes
Création des souches E.coli capables de produire l’OCP
Chapitre II Biosynthèse et caractérisation des OCPs produites chez E.coli
Résumé de la publication
Publication
Brevet
Chapitre III Optimisation du système de production hérélogue de l’OCP
Création des souches E.coli produisant l’OCP avec 2 puis 1 plasmide
Création des souches E.coli produisant l’OCP liant l’hydroxyechinenone
Chapitre IV Applications du système de production hétérologue afin d’élucider la photo-activation de l’OCP
Rôle du bras N-terminal de l’OCP dans sa photo-activation
Résumé de la publication
Publication
Résolution de la structure de la forme active de l’OCP
Résumé de la publication
Conclusions & Perspectives
Matériels & Méthodes
Bibliographie
Résumés de la thèse
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