Le Nicotinamide Adénine Dinucléotide

Le Nicotinamide Adénine Dinucléotide

Structure

Le Nicotinamide Adénine Dinucléotide (NAD) est composé de deux nucléotides reliés par un pont phosphate. Un des nucléotides contient une adénine tandis que l’autre contient un nicotinamide. Le NAD existe sous deux formes : NAD+ qui constitue la forme oxydée et NADH qui constitue la forme réduite. Le NAD désigne le couple NAD+ /NADH sans différentiation entre la forme oxydée et réduite (Pollak N., 2007).

Le NAD existe aussi sous une forme phosphorylée (NADP) au niveau du 2’hydroxyle du sucre du nucléotide portant l’adénine. D’une manière générale le NADP, comme le NAD, existe sous deux formes : NADP+ /NADPH, et il possède les mêmes fonctions redox que le NAD. La différence se fait au niveau de leur utilisation dans la cellule : le NADP est le plus souvent utilisé comme agent de réduction dans les processus de biosynthèse (photosynthèse, synthèse des acides gras…), alors que le NAD est impliqué dans les voies de catabolisme ou il agit comme oxydant.

Propriétés physico-chimiques du NAD

Dans le métabolisme cellulaire cette molécule est capable d’accepter ou de donner des électrons dans des réactions rédox. Ce transfert d’électrons est réalisé au niveau de la partie nicotinamide du NAD. La réduction du NAD+ correspond à l’apport de deux électrons et d’un hydrogène sous la forme d’un hydrure (2e- + H+) au niveau du C-4 du noyau nicotinamide du NAD (Metzler D.E., 2001).

Dans la cellule, le NAD+ est un agent d’oxydation et le NADH est un agent de réduction. Le potentiel standard du couple NAD+/NADH est de E°= -320 mV (par rapport ENH, pH 7). L’équilibre entre la forme oxydée et réduite est appelé rapport NAD+ /NADH. Ce rapport est une composante importante de ce qui est communément appelé état rédox de la cellule. La mesure de ce rapport permet de mettre en évidence les activités métaboliques ainsi que la « bonne santé » de la cellule. En général, il est constant dans un même compartiment cellulaire. Dans les cellules vivant en aérobiose, le coenzyme est plus souvent oxydé d’où un rapport [NAD+ ]/[NADH] de 8 à 10. Le potentiel réel d’oxydoréduction du couple NAD+ /NADH est alors plus élevé soit E° égal à -250 à -290 mV (par rapport ENH) (Schafer F., 2001).

Les molécules de NAD+ et de NADH absorbent fortement dans les UV grâce à leur partie adénine ce qui permet de déterminer facilement leur présence et leur quantité dans un milieu donné. Le NAD+ possède un maximum d’absorbance à 260 nm avec un coefficient d’extinction molaire ε260 nm = 16 900 M-1.cm-1. Le NADH possède en plus de cette bande d’absorbance un second pic d’absorbance à 340 nm avec un coefficient d’extinction molaire ε340 nm de 6 220 M-1.cm-1. Cette différence d’absorbance dans l’UV des deux formes, oxydée et réduite, permet de les quantifier facilement lors des tests enzymatiques (Dawson M.C., 1987).

Les différentes fonctions du NAD 

Le NAD a plusieurs rôles essentiels dans le métabolisme cellulaire. Pendant de nombreuses années, l’unique fonction décrite du NAD était son action comme cofacteur dans les réactions rédox. Depuis quelques années, son implication dans de nombreux processus non redox a été décrite, il est ainsi le substrat des ADN ligases bactériennes, des sirtuines ainsi que des ADP-ribosyltransférases.

Rôle dans le métabolisme rédox

• Coenzyme des oxydoréductases
Le rôle principal du NAD dans le métabolisme redox est représenté par une grande famille d’enzymes appelées oxydoréductases. Parmi ces enzymes, on peut citer par exemple l’alcool déshydrogénase, la lactate déshydrogénase, la NAD-ubiquinone réductase.

Sauf quelques exceptions, le NAD+ (ou NADH) se lie à la protéine, au niveau d’un motif caractéristique « motif de Rossman », ce motif de repliement contient au minimum trois feuillets β reliés par deux hélices α dans l’ordre β-α-β-α-β  (Lesk A.M., 1995).

La NAD(P) transdéshydrogénase est un membre particulier de la famille des oxydoréductases. Cette enzyme présente chez de nombreuses bactéries, située dans la mitochondrie chez les eucaryotes, est un complexe constitué de deux sous unités α et β. Codée par l’opéron pntA-pntB, elle couple la réaction de réduction du NADP+ en NADPH avec la réaction d’oxydation du NADH en NAD+ (Figure 5). Elle joue ainsi un rôle primordial dans le maintien de l’équilibre cellulaire qui existe entre les réactions de catabolisme liées à la production de NADH et les réactions d’anabolisme liées à la consommation de NADPH (Johansson T.C., 2005).

• Rôle central des oxydoréductases dans le métabolisme cellulaire Les réactions redox catalysées par les oxydoréductases sont essentielles dans le métabolisme cellulaire. Elles jouent un rôle prédominant dans les réactions de libération d’énergie à partir des nutriments. Une grande partie de l’énergie produite dans les voies de catabolisme (des protéines, des lipides et des sucres) se retrouve contenue dans le NADH. Cette énergie est convertie en ATP dans la mitochondrie au cours de la respiration cellulaire.

Ainsi chaque mole de NADH consommée par la mitochondrie peut fournir l’énergie nécessaire à la formation de 3 molécules d’ATP lors de l’étape ultime de phosphorylation oxydative  (Rich P.R., 2003).

Rôle dans le métabolisme non redox 

De récentes études ont permis de mettre en évidence la place centrale qu’occupe le NAD dans la régulation de diverses voies métaboliques. En effet, le NAD sert de substrat dans de nombreuses réactions non rédox en tant que substrat des ADP ribosyltransférases, des sirtuines ainsi que des ADN ligases bactériennes. Il sert également de précurseur dans la formation de l’ADP-ribose cyclique (Ziegler M., 2000 ; Belenky P., 2006).

• Le NAD comme substrat des réactions d’ADP-ribosylation
Le NAD+ est utilisé lors de réactions de transfert d’ADP-ribose. Les enzymes qui effectuent ces réactions sont les ADP-ribosyltransférases (ARTs) et les poly-(ADP-ribose) polymérase (PARPs) (Diefenbach J., 2005). Elles ajoutent une partie ADP ribose sur des protéines et/ou forment des polymères d’ADP-ribose. On peut trouver des réactions de mono-, ou de poly-ADP ribosylation (Figure 7, Cas 1). Cette modification constitue une modification post-traductionnelle appelée ADP-ribosylation. Les ADP-ribosylations sont impliquées dans la régulation de nombreux processus cellulaires dont la plus grande partie a lieu dans le noyau, les plus importants étant liés à la réparation de l’ADN ou au maintien des télomères (Burkle A., 2005).

• Le NAD comme précurseur de l’ADP-ribose cyclique
Une autre fonction de ce coenzyme dans la signalisation cellulaire est son utilisation comme un précurseur dans la formation d’ADP-ribose cyclique via l’ADP-ribose synthase . L’ADPc ribose joue un rôle clé dans le maintien de l’homéostasie du calcium en entraînant sa libération des stocks intracellulaires par liaison avec une classe de récepteurs à la ryanodine. Le Ca2+ libéré du réticulum endoplasmique va entre autres choses déclencher la contraction des muscles striés (Guse A.H., 2004a,b).

• Le NAD comme substrat des sirtuines
Les sirtuines forment une famille de désacétylases NAD dépendantes présentes chez les eucaryotes, les procaryotes ainsi que les archaebactéries. Le membre le plus connu de cette famille est Sir2 pour Silent information regulator, qui a été très étudié chez Saccharomyces cerevisiae (chez E. coli, elle est appelée CobB) (North B., 2004). Par la désacétylation d’histones et de facteurs de transcription , les sirtuines provoquent un remodelage de la structure chromatinienne et modulent l’activité transcriptionnelle contrôlant ainsi des phénomènes clés comme l’apoptose et le vieillissement cellulaire. De récentes études pointent Sir2 comme un « régulateur universel » de la longévité (Trapp J., 2006).

• Le NAD comme substrat de Ligases NAD dépendantes
Cette activité enzymatique n’est retrouvée que chez les bactéries. Chez les eucaryotes, l’activité des ligases est ATP dépendante (Schär P., 1997). Cette activité enzymatique est portée chez E. coli ou Salmonella par LigA et est impliquée dans la réparation de l’ADN en reformant la liaison pyrophosphate de l’ADN. De façon plus détaillée , la partie AMP du NAD est transférée sur une lysine située dans le site actif de LigA. L’étape suivante est un transfert de l’AMP au niveau de la lésion de l’ADN à réparer, une fois la liaison phosphodiester reformée, l’AMP est libéré et l’ADN est alors réparé (Wilkinson A., 2001).

Table des matières

Introduction
I- Le Nicotinamide Adénine Dinucléotide
I-1 Structure
I-2 Propriétés physico-chimiques du NAD
I-3 Les différentes fonctions du NAD
a- Rôle dans le métabolisme rédox
b- Rôle dans le métabolisme non rédox
I-4 Concentration physiologique du NAD et sa localisation cellulaire chez les eucaryotes
a- Localisation cellulaire
b- Concentration en NAD
II- La biosynthèse du NAD
II-1 Les voies principales ou de novo
a- La voie de novo chez la bactérie
b- La voie principale de novo chez les eucaryotes
c- De l’acide quinolinique au NAD
d- Aspects structuraux de la voie de biosynthèse de novo chez la bactérie
II-2 Les voies de secours ou de recyclage
a- Chez les procaryotes, les eucaryotes et les plantes (à l’exception des mammifères)
b- Chez les mammifères
II-3 La régulation de la biosynthèse du NAD
a- Régulation du métabolisme du NAD par le régulateur NadR
b- Régulation du métabolisme du NAD par le régulateur NiaR
c- Régulation du métabolisme du NAD par le régulateur NrtR
II-4 La voie de biosynthèse du NAD comme un modèle de l’évolution
III- Le NAD comme une cible pharmacologique
III-1 Le NAD comme cible de l’isoniazide
III-2 L’inhibition ou l’activation d’enzymes NAD dépendantes
III-3 L’inhibition d’enzyme de la biosynthèse du NAD
III-4 Les antibiotiques et les résistances
IV- Le système quinolinate synthase
IV-1 Historique : Mise en évidence de NadA et NadB comme des enzymes impliquées dans la voie de biosynthèse de novo du NAD
IV-2 Découverte des substrats
IV-3 Caractérisation de la L-Aspartate oxydase (NadB)
IV-4 La quinolinate synthase : une enzyme sensible à l’oxygène
IV-5 Purification et premières caractérisation de la quinolinate synthase
a- Purification de la protéine sous forme d’une apoprotéine
b- Purification de la protéine sous forme métallée (holoenzyme)
IV-6 Aspects structuraux : Première structure tridimensionnelle de la quinolinate synthase
IV-7 Le « complexe quinolinate synthase NadA-NadB »
IV-8 Un mécanisme complexe : les différentes propositions
a- La première hypothèse de mécanisme
b- La seconde hypothèse de mécanisme
Objectifs de la thèse
Matériels et Méthodes (M&M)
Conclusion

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