Le monoxyde d’azote (NO) et le dioxyde d’azote (NO2)

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Les feuilles

Les feuilles sont imparipennées alternes. Le rachis est long de 5 à 10 centimètres portant deux paires de folioles généralement bien opposées. Les folioles sont elliptiques, longues de 5 à 8 centimètres, larges de 3 à 4 centimètres avec une base arrondie. Les deux côtés du limbe sont réunis au sommet du pétiole. Ce sommet est en pointe acuminée courte et obtue avec 7 à 10 nervures latérales peu saillantes ; et un réseau très détaillé de nervures réticulées. Le limbe est glabre, devenant coriace, luisant dessus et bien vert, d’un vert mat dessus, et parfois puberulent. Le filet est marginal et translucide. Le pétiole est long de 1 à 2 centimètres avant la première paire de folioles. Les pétioles latéraux sont longs de 3 à 5 mm, apaissis et ridés. Le pétiolule et le pétiole sont parfois pubescents (Berhaut, 1975). La figure 3 montre les feuilles de Dialium guineense.

Les fleurs

Les fleurs de Dialium guineense sont hermaphrodites (à la fois males et femelles) et sont pollinisées par le vent et les insectes, notamment les mouches, les abeilles, les guêpes et les papillons. Les inflorescences comportent entre 13 et 59 fleurs, qui s’ouvrent pendant quatre à six jours. Chaque fleur est pollinisée lorsqu’elle s’ouvre, entre six heures du matin et midi (Ewedje, 2011 ; Tanjiekpon, 2011). Les fleurs sont blanchâtres portant des fruits noirs à velours dense qui sont plus ou moins circulaires et aplatis (Hutchinson et Daniel, 1958). Au Nigéria, l’arbre fleurit de septembre à octobre (Keay, 1989). Les fleurs comportent 8 à 10 étamines réparties en deux verticilles parmi lesquelles une à deux seulement sont fertiles (Adam, 1987). La figure 4 montre les fleurs de Dialium guineense.

Les fruits

Les fruits de Dialium guineense sont lenticulaires ou aplaties, globuleuses, d’environ 2 à 2,5cm de diamètre contenant 1 et parfois 2 graines incrustées dans une rougeâtre pulpe acidulée et délicieusement comestible (Ezeja et al., 2011). Les fruits noirs veloutés se produisent à partir de février à avril et sont généralement abondants (Assongba, 2013). Les figures 5 et 6 montrent les fruits de Dialium guineense.

Habitat et répartition géographique

Cette espèce est présente au Bénin, au Burkina Faso, au Cameroun, à la République Centrafricaine, en Côte d’Ivoire en Guinée Equatoriale, au Ghana, en Guinée Conakry, en Guinée Bissau, au Libéria, au Mali, au Niger, au Nigéria, à Sao Tomé, au Sénégal, en Sierra Leone, au Soudan, au Togo (Orwa et al., 2009).
Au Sénégal, elle est présente dans les Iles du Saloum, et surtout en Casamance au niveau des littoraux. En somme, c’est une espèce qui pousse en Afrique subsaharienne avec une répartition s’étendant de la presqu’Ile du Cap Vert, au Soudan en passant par les territoires du Sahel.
Les conditions les mieux adaptés du Tamarinier noir sont les suivantes : sols acides, riches en fer et bien drainés ; températures oscillant entre 25 et 32°C.

Composition chimique

La composition chimique des feuilles de Dialium guineense a fait l’objet de nombreux travaux et études. Au Nigéria, une étude réalisée sur l’extrait de feuilles a révélé la présence de tanins, d’alcaloïdes, de saponines, de flavonoïdes, de stéroïdes, d’hétérosides cardiotoniques et l’absence des sucres réducteurs (Akinpelu et al., 2011). Des travaux antérieurs réalisés au Laboratoire de Pharmacognosie de l’Université Cheikh Anta Diop de Dakar ont permis de mettre en évidence la présence dans les feuilles de flavonoïdes, de tanins, d’alcaloïdes et l’absence d’anthracènes et d’hétérosides cardiotoniques (Koumaré M, 1989).
Le criblage phytochimique fait par les méthodes classiques (Trease et al., 1998) a montré que l’extrait éthanolique d’écorce de tige de Dialium guineense contient des anthraquinones, des alcaloïdes, des flavonoïdes, des tanins, et des saponines (Olajubu et al., 2012).
Une étude faite sur l’extrait éthanolique des feuilles a montré la présence de beaucoup de composés chimiques dont les proportions sont présentées dans le tableau II (Osuagwu et al., 2013).

Pharmacologie

 Activité anticancéreuse
Les extraits de feuilles testés par « Water Reed Army Médical Center » et par « Cancer Chemotherapy National Service Center» ont une activité anti-tumorale modérée chez l’animal. Avec les extraits d’écorces, de meilleurs résultats ont été obtenus vis-à-vis des tumeurs du sarcome (Odukoya, 1996).
 Activité hypoglycémiante
L’étude de l’extrait méthanolique des feuilles de Dialium guineense fractionné par chromatographie d’exclusion-diffusion sur gel de sephadex a permis l’obtention de cinq fractions (F1, F2, F3, F4 et F5). Les essais pharmacologiques réalisés chez des rats normoglycémiques ont révélé un effet hypoglycémiant de la fraction F5. L’administration de la fraction F5 prévient l’apparition d’un pic d’hyperglycémie lié à l’administration de glucose. En effet l’effet sur le glucose sanguin des fractions de l’extrait méthanolique serait corrélé à la présence de flavonoïdes en grande quantité dans la fraction F5, ce qui suggère leur probable implication dans la régulation de la glycémie (Doupa, 2014).
 Activité antimicrobienne et anti-oxydante
Des études in vitro faites par Gidéon et al.( 2013) sur l’activité antimicrobienne de l’extrait des feuilles de Dialium guineense (willd) ont montré un effet inhibiteur sur la croissance d’isolats cliniques de Staphyloccus aureus, Streptococcus mutans, Escherichia coli, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Microsporum langeronii.

Toxicité

La méthode de Lorke 9 a été utilisée pour l’étude de la toxicité l’extrait méthanolique de Dialium guineense (Ezeja, 2011). Vingt-cinq souris des deux sexes ont été regroupées au hasard en cinq groupes (A à E) de cinq souris chacun. Les souris des groupes A, B, C, D et E ont reçu par voie orale les doses respectives de 100, 500, 1000, 2000 et 3000 mg/kg par gavage gastrique. Les animaux ont eu libre accès à la nourriture et à l’eau. Ils ont été observés sur une période de 24 heures à la recherche de signe de toxicité et de mortalité.
La méthode utilisée n’a révélé aucun décès ni signe de toxicité après vingt-quatre heures (24 heures) même à la dose de 3000 mg /kg, ce qui montre que l’extrait était bien toléré.

GENERALITES SUR LES RADICAUX LIBRES

Définitions

Les radicaux libres

Les radicaux libres sont des atomes, avec un nombre d’électrons impairs sur la loge extérieure. Ils se forment quand l’oxygène interagit avec certaines molécules (Kristina et Marka, 2003). Ils sont très instables et réagissent très rapidement avec d’autres composants, essayant de capturer l’électron nécessaire pour la stabilité. Une « réaction en chaine » commence quand un radical libre attaque la molécule stable la plus proche en lui « volant » son électron et « la molécule attaquée » devient un radical libre. Leur danger c’est qu’ils peuvent provoquer des dommages pour l’organisme lorsqu’ils réagissent avec des composants cellulaires importants tels que l’ADN ou la membrane cellulaire. Une prolifération anormale des cellules peut se produire entrainant un cancer, un dysfonctionnent cellulaire ou la mort des cellules (Quillien, 2002).
L’appellation ERO (espèce réactive de l’oxygène) inclut les radicaux libres de l’oxygène comme l’anion superoxyde (O2°-) et le radical hydroxyde (OH°), mais aussi certains dérivés oxygénés non radicalaires dont la toxicité est importante tel que le peroxyde d’hydrogène(H2O2) (Garait, 2006).

Le stress oxydatif

Le stress oxydatif peut être défini comme un déséquilibre de la balance entre les antioxydants et les espèces oxygénés pro-oxydants en faveur de ces derniers avec de nombreuses conséquences impactant sur le fonctionnement cellulaire et entrainant ainsi des maladies chroniques (Amin et Raziel, 2007 ; Bushra et al., 2007). La figure 8 montre l’équilibre d’espèces oxygénés activés (EOA) et les antioxydants. Un déséquilibre de ce système est à l’origine du stress oxydant impliquant plusieurs pathologies (Masson, 2009).
Un état de stress oxydant existe lorsqu’au moins une des trois conditions suivantes est présente (Mercan, 2010) :
– Excès des espèces réactives d’O2, N2 ou Cl2
– Défenses insuffisantes (endogènes et exogènes)
– Mécanismes de réparation insuffisants

Mécanisme du stress oxydant

Origine des radicaux libres

Les radicaux libres peuvent avoir une origine exogène (rayonnements UV, toxines…) ou endogène dû à un dysfonctionnement des sources de production de ERO ou de leurs systèmes d’élimination (système antioxydant) ou le stress.

Origine endogène

Dans les conditions normales in vivo, de nombreuses enzymes sont responsables de la production des EROs dans le cytosol, les membranes et les mitochondries de types cellulaires variés.

NADPH oxydase

C’est une enzyme transmembranaire capable de transférer des électrons à travers des membranes biologiques. Sur le plan topologique, les NADPH semblent posséder des domaines structuraux en commun, les parties N et C-terminales étant orientées vers le cytosol. Elle catalyse la réduction mono électronique de l’oxygène en utilisant le NADPH ou le NAD comme donneur d’électrons selon la réaction suivante : NADPH Oxydase 2O2 + NADPH 2 O2●- + NADP+ + H+
Cette réaction a été initialement décrite dans les cellules phagocytaires ou elle joue un rôle fondamental dans la réponse immunitaire et plus précisément dans la lutte contre les microorganismes (Delattre et al., 2007). Par ce phénomène, la NADPH oxydase phagocytaire représente une source majeure de production d’EROs dans le poumon (Krausse, 2004).

Xanthine oxydase (XO)

La XO catalyse la dégradation de l’hypoxanthine en acide urique en condition de forte demande d’ATP et de déficit en oxygène. Lorsque la concentration de l’ATP est diminuée, il se produit un déséquilibre dans le gradient ionique de part et d’autre de la membrane plasmique conduisant ainsi à une entrée de Ca2+ à l’intérieur de la cellule. L’augmentation de la concentration cytoplasmique en Ca2+ provoque une augmentation in vivo, en XO (Lebegue, 1999). Elle catalyse également l’oxydation de la xanthine en acide urique, notamment lors d’ischémie-reperfusion ou d’hypoxie. Dans cette réaction, l’oxygène moléculaire agit comme un accepteur d’électron produisant de l’O2●- (Garait, 2006). Xanthine oxydase Xanthine + O2 Acide urique + O2●-

NO synthase

L’espèce radicalaire le monoxyde d’azote est produite par des systèmes enzymatiques que sont les différents NO synthase (ou NOS) à des fins de médiations cellulaires. La production concomitante dans un même site de NO● et de superoxyde s’avère très dommageable en donnant naissance au radical peroxynitrite (Favier, 2003). Il est maintenant prouvé que lors d’une surproduction d’O2● -, ces derniers réagissent très rapidement avec le monoxyde d’azote pour former l’ion peroxynitrite ONOO● (Beckman, 2001).

La mitochondrie

La mitochondrie par l’intermédiaire de sa chaine respiratoire constitue la principale source d’EROs. Elle produirait en effet 90% d’EROs cellulaires (Balaban et al, 2005). La chaine respiratoire est constituée de 4 complexes dont 3 s’avèrent être des pompes à protons :
 Complexe I : NADH ubiquinone oxydoréductase
Le complexe I est le plus gros composant protéique de la membrane interne de la mitochondrie. Il possède de 46 sous unités dont 7 codés par l’ADN mitochondrial et 39 par l’ADN nucléaire (Di Mauro et al., 2003). Sa masse moléculaire est de 750kDa (Schagger et al., 1991).
 Complexe II : Succinate –déshydrogénase
Le complexe II catalase la ré-oxydation du succinate en fumarate qui par l’intermédiaire de l’oxydation du FADH et de la réduction d’ubiquinone permet le transfert de 2 électrons au complexe III (complexe b-c1).
 Complexe III : complexe b-c1 (ubiquinone –cytochrome c réductase) Le pool des quinones est un transfert libre d’électrons des complexes I et II vers le complexe III. Ce dernier permet un transfert d’électrons à un deuxième transporteur mobile situé dans l’espace intermédiaire, le cytochrome c qui relie le complexe III au complexe IV. Ce transfert d’électron, également associé à un efflux de protons fait du complexe III la deuxième à proton de la chaine respiratoire
 Complexe IV : Cytochrome oxydase
Le complexe IV catalyse la dernière réaction d’oxydoréduction entre le cytochrome c et l’oxygène qui est réduit en H2O par 4 électrons. Ce transfert d’électrons est irréversible contrairement à celui qui lieu dans le complexe I, II et
III mais aussi associé à un efflux de protons faisant de ce complexe le dernier site de couplage de la mitochondrie.

Origine exogène

Les rayonnements UV

Les radiations UV provoquent particulièrement des démâtements au niveau de l’ADN. Les radiations ionisantes induisent la synthèse de radicaux libres dérivés de l’oxygène et les molécules génératrices des radicaux libres par l’intermédiaires d’agents photo sensibilisants (Hu, 2006).

Le monoxyde d’azote (NO) et le dioxyde d’azote (NO2)

Ils sont formés par les Nitric Oxyde Synthase (NOS) et constituent des toxiques présents dans notre environnement : suie, goudron, tabac, polluants industriels. Ils sont responsables en plus de la synthèse des radicaux libres (Palot et al., 2008).

L’alimentation

L’alcool, le café, les aliments riches en protéines et en lipides peuvent être à l’origine de la production des radicaux libres (Mera, 2003).

Certains médicaments

Les médicaments quoi sont utilisés comme un traitement contre le cancer (anthracyclines) peuvent  provoquer aussi la production de radicaux libres par oxydations de ces composés au niveau du cytochrome P450 (Beckman, 1998).

Cibles biologiques des radicaux libres

Les lipides

Les lipides ont de nombreux rôles dans l’organisme (molécules énergétiques, réserve d’énergie, molécules signal) et font partie intégrante des membranes cellulaires. Parmi les lipides membranaires, les phospholipides sont les plus abondants. La partie hydrophobe des phospholipides est liée à la présence d’acides gras saturés, monoinsaturés ou polyinsaturés. Les acides gras polyinsaturés sont la cible privilégiée de l’attaque par le radical hydroxyle capable d’arracher un hydrogène sur les carbones situés entre les deux doubles liaisons, pour former un radical diène conjugué oxydé en radical péroxyle (Favier, 2003). Cette réaction appelée peroxydation lipidique forme une réaction en chaine car le radical peroxyle formé se transforme en peroxyde au contact d’un autre acide gras qui forme un nouveau radical diène conjugué (Esterbauer et al, 1992). Cette réaction de peroxydation lipidique, illustrée par la figure 10, se décompose en trois étapes : l’initiation, la propagation et la terminaison.

Les protéines

Les dommages des radicaux libres sur les protéines peuvent entrainer la mort de la cellule si les effets d’une attaque s’accumulent ou si les dommages sont concentrés sur un site particulier de certains enzymes (Guidet, 1992).
Les radicaux libres en agissant sur les acides aminés contenant des groupements thiols tels que la cystéine et la méthionine, conduisent à la formation de ponts disulfures et par conséquent à l’agrégation de plusieurs molécules de protéines. Ces protéines, même si quelques-unes voient leur activité augmenter suite à une oxydation, la plupart deviennent inactives (Ré et al., 2005 ; Koechlin-Ramontxo, 2006).
Certaines protéines oxydées sont peu dégradées et forment des agrégats qui s’accumulent dans les cellules et dans le compartiment extracellulaire (Haleng, 2007). La formation de groupements carbonyles survient lorsque les radicaux libres réagissent avec le groupement radical des acides aminés (Ismail, 2016).
Le dosage plasmatique de protéines carbonylées est actuellement le marqueur d’oxydation avancée des protéines le plus utilisé, aussi bien in vivo qu’in vitro (Esterbauer, 1992).

Les glucides

L’oxydation du glucose conduit à la formation de différents intermédiaires réactifs, dont les produits terminaux de la glycation protéique, les AGE (Advanced Glycosylation End Product) qui s’accumulent au niveau des protéines à durée de vie longue, entrainant notamment une perte d’élasticité tissulaire au niveau des vaisseaux sanguins et du cristallin, et pourraient ainsi participer au dysfonctionnement endothélial et aux complications vasculaires du diabète (Buysea et al., 2007).

L’ADN

L’ADN qu’il soit nucléaire ou mitochondrial, est également une cible majeure des ERO. Ceux-ci peuvent en effet interagir avec les désoxyriboses de l’ADN mais aussi avec des bases puriques et pyrimidiques. L’action des radicaux hydroxyles sur la guanine génère deux radicaux libres : R1 (centré sur l’atome de carbone 5) et R2 (centré sur l’atome d’azote 7). Ce dernier (R2) donne naissance à la 8-oxo-guanine, un des principaux marqueurs du stress oxydant dans l’ADN (Gardés-Albert et al., 2003). Ces attaques des ERO sur les protéines induisent l’apparition de groupement carbonyles, de cystéines oxydées, de fragment peptidiques (détachement d’acides aminés) ou d’agrégats protéiques (Kœchlin et al., 2006).
Ces altérations structurales lorsqu’elles ne sont pas réparées entrainent à long terme des altérations géniques : cassures chromosomiques, mutations, délétions,
à l’origine d’un dysfonctionnement au niveau du métabolisme protéique (Gros et al., 2002 ; Kœchlin et al., 2006)

Les défenses cellulaires contre le stress oxydant

Systèmes antioxydants enzymatiques

Les trois principaux représentants de l’équipement enzymatique antioxydant sont la catalase, la superoxyde dismutase et la glutathion peroxydase (Tessier et al., 1994).

La catalase

Ubiquitaire chez les mammifères, la catalase (CAT) est, au niveau cellulaire localisée uniquement dans les peroxysomes (Chance et al., 1979). Cette enzyme contenant du fer est particulièrement concentrée dans le foie et les érythrocytes, alors qu’elle est trouvée en faible quantité dans les muscles striés squelettiques, le cœur et le cerveau (Helliwell et al., 1989). La CAT neutralise de grandes quantités d’eau oxygénée (H2O2) issus de la mitochondrie (Chance et al., 1979). A faible concentration la CAT réduit le H2O2 en oxydant des substrats donneurs d’hydrogène tels que les phénols et alcools. Pour des fortes concentrations en H2O2, elle catalyse sa transformation en eau et en oxygène (Kattan, 2009) selon la réaction suivante : 2H2O2 O2 + 2H2O.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE I : GENERALITES SUR DIALIUM GUINEENSE
I.1. Eléments de taxonomie et dénominations
I.1.1. Classification
I.1.2. Dénominations
I.2. Description botanique
I.2.1. Le port
I.2.2. Les feuilles
I.2.3. Les fleurs
I.2.4. Les fruits
I.3. Habitat et répartition géographique
I.4. Composition chimique
I.5. Usages et pharmacologie
I.5.1. Usages
I.5.2. Pharmacologie
I.6. Toxicité
CHAPITRE II : GENERALITES SUR LES RADICAUX LIBRES
II.1. Définitions
II.1.1. Les radicaux libres
II.1.2. Le stress oxydatif
II.2. Mécanisme du stress oxydant
II.2.1. Origine des radicaux libres
II.2.1.1. Origine endogène
II.2.1.1.1. NADPH oxydase
II.2.1.1.2. Xanthine oxydase (XO)
II.2.1.1.3. NO synthase
II.2.1.1.4. La mitochondrie
II.2.1.2. Origine exogène
II.2.1.2.1. Les rayonnements UV
II.2.1.2.2. Le monoxyde d’azote (NO) et le dioxyde d’azote (NO2)
II.2.1.2.3. L’alimentation
II.2.1.2.4. Certains médicaments
II.2.2. Cibles biologiques des radicaux libres
II.2.2.1. Les lipides
II.2.2.2. Les protéines
II.2.2.3. Les glucides
II.2.2.4. L’ADN
II.3. Les défenses cellulaires contre le stress oxydant
II.3.1. Systèmes antioxydants enzymatiques
II.3.1.1. La catalase
II.3.1.2. La glutathion peroxydase et glutathion réductase
II.3.1.3. La superoxyde dismutase
II.3.1.4. Le système thiorédoxine
II.3.2. Système antioxydant non enzymatique
II.3.2.1. Les polyphénols
II.3.2.2. Les caroténoïdes
II.3.2.3. La vitamine C
II.3.2.4. La vitamine E
II.3.2.5. Le glutathion
II.3.2.6. Le sélénium
II.4. Rôle du stress oxydant dans certaines pathologies
II.4.1. Stress oxydant et obésité
II.4.2. Stress oxydant et diabète
II.4.3. Stress oxydant et athérosclérose
II.4.4. Stress oxydant et infertilité masculine
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
CHAPITRE I : MATERIEL ET METHODES
I.1. Matériel et Réactifs
I.1.1. Matériel végétal
I.1.2. Matériel de laboratoire
I.1.3. Principaux réactifs utilisés
I.2. Méthodes d’études
I.2.1. Dosage de l’eau
I.2.2. Extraction et fractionnement
I.2.2.1. Extraction
I.2.2.2. Fractionnement
I.2.3. Activité antioxydante par la méthode FRAP
I.2.3.1. Principe
I.2.3.2. Protocole opératoire
I.2.3.3. Expression des résultats
I.2.3.4. Analyses statistiques
CHAPITRE II : RESULTATS
II.1. Teneur en eau
II.2. Rendements d’extraction et de fractionnement
II.3. Activité antioxydante par la méthode FRAP
CHAPITRE III: DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCE BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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