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Le monoxyde d’azote et les NO synthases
La chimie de NO
Description chimique de NO
Le monoxyde d’azote (NO) est l’une des 10 plus petites molécules stables se trouvant dans la Nature. Cette molécule se caractérise principalement par quatre propriétés : elle est gazeuse, petite, non chargée, et elle comporte un électron non apparié (impossibilité pour l’atome d’azote de remplir sa couche de valence). NO est donc un radical libre doué de paramagnétisme. Cette propriété détermine en grande partie sa réactivité chimique.
Cet électron non apparié présente une instabilité intrinsèque. Deux mécanismes permettent de remédier à cette instabilité et dominent la chimie de NO : l’appariement avec un autre électron non apparié, et la mise en résidence partielle dans l’orbitale d d’un métal de transition.
NO est considéré comme un radical libre relativement stable et faiblement réactif. Il ne se décompose pas spontanément et ne réagit pas non plus avec lui-même en conditions biologiques. L’oxydation/réduction mono-électronique de NO, donnant respectivement le cation nitrosonium NO+ et l’anion nitroxyle NOou son acide conjugué HNO, est thermodynamiquement très défavorable, ce qui prévient leur formation directe . NO réagit cependant rapidement avec de nombreuses cibles cellulaires, ce qui explique sa faible demi-vie biologique, la plupart du temps inférieure à 2 s . C’est un temps de vie extrêmement court en comparaison avec d’autres molécules de signalisation, mais c’est un temps relativement long si on le compare à celui des autres radicaux libres dont la durée de vie est plutôt de l’ordre de quelques millisecondes.
Propriétés physiques de NO
NO est une molécule non chargée, ce qui lui permet de traverser facilement les membranes biologiques par diffusion passive. Il est soluble à la fois en milieu hydrophobe et en milieu hydrophile (avec une solubilité 10 fois inférieure cependant). En raison de sa nature gazeuse, son coefficient de diffusion élevé (≈3800 µm²/s) lui permet de parcourir des distances considérables en une courte période temporelle (≈ longueur d’une cellule/25 ms) . Une fois synthétisé, le NO se déplace par diffusion aléatoire depuis son point d’origine, établissant un gradient spatial de concentration à partir de son site de production. Dans des cultures cellulaires, le NO libéré par des macrophages RAW 264.7 en réponse à l’interféron-γ a été détecté à une distance de 100 à 500 µm des cellules, soit un rayon de diffusion équivalent à 10-50 cellules . Dans des systèmes biologiques, la diffusion de NO est toutefois limitée par de nombreux facteurs : son interaction avec des protéines (hémoglobine, guanylate cyclase, etc.), la composition lipidique de la membrane plasmique (présence de cholestérol, de liposomes, etc.) ou bien sa réactivité avec des radicaux libres.
Réactivité de NO avec O2 et des espèces radicalaires
NO peut réagir très rapidement avec d’autres radicaux libres au moyen d’un appariement électronique favorable, formant des composés secondaires appelés espèces réactives de l’azote (RNS = Reactive nitrogen species) . Parmi les molécules possédant un électron non apparié, le dioxygène (O2) est largement prédominant. Si O2 possède un nombre pair d’électrons, deux de ses électrons se trouvent pourtant sur des orbitales séparées dans la forme la plus commune de la molécule (état fondamental).
La concentration en O2, qui varie dans de grandes proportions en fonction de l’organe, du tissu, du type cellulaire et même de la localisation intracellulaire, est un déterminant majeur de la concentration en NO à un temps donné. O2 participe en effet à la fois à la synthèse de NO comme cosubstrat des NO Synthases, mais aussi au métabolisme de NO. Ainsi, la demie-vie et la distance de diffusion de NO sont d’autant plus réduites que la concentration en O2 est élevée .
Le produit immédiat de la réaction de NO avec O2 est généralement le dioxyde d’azote (•NO2), qui est aussi un radical, mais qui contrairement à NO est oxydant (Réaction 1). •NO2 réagit rapidement avec NO ou des molécules riches en électrons (nucléophiles), générant d’autres dérivés ainsi que l’anion nitrite (NO2-).
2NO + O2 → 2•NO2 (Réaction 1)
NO réagit également avec la forme réduite de l’oxygène, l’anion superoxyde (O2•-), de façon extrêmement rapide, ce qui réduit son potentiel de diffusion. Le produit formé par cette réaction, le peroxynitrite (ONOO-), est un puissant agent oxydant et nitrant (Réaction 2). Cette réaction est limitée par l’activité superoxyde dismutase (SOD) des cellules et a lieu essentiellement lorsque les concentrations des deux substrats sont équivalentes.
NO + O2•- → ONOO- (Réaction 2)
Nitrosylation de complexes métalliques et de métalloprotéines
Les métaux de transition sont appelés ainsi car dans le tableau périodique des éléments, ils représentent les éléments qui font la transition entre les orbitales s et p, avec des électrons occupant les orbitales d. Ces orbitales peuvent accueillir 10 électrons et sont généralement assez espacées en énergie en fonction de l’arrangement des ligands autour du métal. Les métaux de transition constituent ainsi de bons foyers pour les électrons non appariés. La plupart du temps cependant, l’électron non apparié n’est pas totalement transféré au métal mais est partagé avec le radical. NO et O2 sont tous deux capables de former ce type de liaison avec un métal de transition, appelée liaison de coordination. En raison de la nature différente de la liaison qui n’est pas covalente, le groupement fonctionnel du ligand lié au métal est appelé nitrosyl.
La liaison de coordination entre NO et un métal de transition la plus étudiée est celle qui lie NO au fer, soit dans son état ferreux (Fe2+), soit dans son état ferrique (Fe3+). Une large proportion du fer existe sous forme liée à la protoporphyrine au sein de l’hème, qui est utilisé comme cofacteur d’une grande variété d’enzymes et permet notamment le transport du dioxygène par l’hémoglobine. La coordination de NO à l’hème ferreux de la Guanylate Cyclase soluble (sGC) est sans doute la mieux connue et représente la quintessence d’un exemple de nitrosylation en biologie. La formation du complexe ferreux-nitrosyl (FeII-NO) provoque des changements structuraux qui multiplient par un facteur 100 la conversion du GTP (Guanosine triphosphate) en GMPc (cyclic Guanosine monophosphate) par l’enzyme . Dans de nombreux cas cependant, la nitrosylation des métalloenzymes a un effet négatif sur leur activité : c’est par exemple le cas pour le cytochrome P450, la NO Synthase et pour l’aconitase . De cette façon, NO exerce un rétrocontrôle négatif sur sa propre synthèse.
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Table des matières
INTRODUCTION
1 Le monoxyde d’azote et les NO synthases
1.1 La chimie de NO
1.1.1 Description chimique de NO
1.1.2 Propriétés physiques de NO
1.1.3 Réactivité de NO avec O2 et des espèces radicalaires
1.1.4 Formation de S-nitrosothiols
1.1.5 Nitrosylation de complexes métalliques et de métalloprotéines
1.1.6 Formation de N-nitrosamines
1.1.7 Nitration par des dérivés de NO
1.2 Synthèse de NO par les NO synthases
1.2.1 Découverte de la synthèse de NO chez les mammifères
1.2.2 Les NO synthases
1.2.2.1 Généralités
1.2.2.2 Localisation tissulaire et subcellulaire des NO Synthases
1.2.2.3 Structure des NO Synthases
1.2.3 Mécanisme de synthèse de NO par les NO synthases
1.2.4 Disponibilité en substrats et activité NO Synthase
1.3 NO est une molécule de signalisation cellulaire
1.3.1 Sélectivité des cibles de NO : effets de seuils et diversité de réponses
1.3.2 Les S-nitrosylations : un nouveau paradigme en signalisation
1.3.2.1 La S-nitrosylation : un mécanisme sélectif et réversible ?
1.3.2.2 Rôles des S-nitrosylations en signalisation cellulaire
1.3.3 Quel est le destin des cellules exposées à de fortes concentrations en NO ?
1.3.4 Les défenses cellulaires en réponse aux dommages induits par NO
1.3.4.1 Aperçu général des mécanismes de défense antioxydante
1.3.4.2 L’activation de Nrf2 est une voie centrale de détoxification des xénobiotiques et des espèces oxydantes
1.4 Les fonctions physiologiques et les effets physio-pathologiques des NO synthases
1.4.1 NO dans le système cardiovasculaire
1.4.2 NO dans le système nerveux : un neurotransmetteur atypique
1.4.3 NO dans l’inflammation, l’immunité et le cancer
1.4.3.1 Les activités activités antimicrobienne, antivirale et antiparasitaire de la iNOS
1.4.3.2 NO comme médiateur de l’immunité adaptative
1.4.3.3 La iNOS dans les maladies inflammatoires chroniques et le cancer
1.5 Régulation de l’expression et de l’activité iNOS
1.5.1 Structures du gène et du promoteur NOS2
1.5.2 Les facteurs de transcription modulant l’expression de la iNOS
1.5.3 La régulation post-transcriptionnelle et post-traductionnelle de la iNOS
1.6 Contrôle de la synthèse de NO par le TGF-β
1.6.1 Composants de la voie de signalisation canonique du TGF-β
1.6.2 Régulation de gènes cibles par les protéines SMADs et leurs partenaires
1.6.3 Les voies de signalisation indépendantes des protéines SMADs
1.6.4 Régulation de la biodisponibilité du TGF-β
1.6.5 Régulation de l’expression de la iNOS par le TGF-β1
2 Le suppresseur de tumeur p73 et ses homologues
2.1 La famille p53 : Origine, structures et fonctions
2.1.1 Découverte d’un « Gardien du génome »
2.1.2 Origine évolutive et fonctions ancestrales de p53
2.1.3 Structure et complexité moléculaire de la famille p53
2.1.3.1 Diversité des isoformes au sein de la famille p53
2.1.3.2 Structure protéique de p73 et de ses homologues
2.1.3.3 La famille p53 forme un réseau d’interactions
2.1.4 Régulation génique par p53 et ses homologues
2.1.5 p73 est-il réellement un gène suppresseur de tumeur ?
2.2 Contrôle de l’activité et de l’expression de p73
2.2.1 Régulation des fonctions de p73
2.2.2 Expression différentielle des isoformes de p73
2.3 Fonctions exclusives de p63 et p73 dans le développement
2.3.1 p63 dans le développement des épithéliums et des tissus d’origine ectodermique
2.3.2 p73 dans le développement et la maintenance du système nerveux central
2.4 Rôles émergents de p53 et p73 dans l’immunité
2.4.1 p53 dans l’immunité antivirale et la réponse aux IFNs de type I
2.4.2 Contrôle des réponses inflammatoires par p53
2.4.3 p53 dans le contrôle de l’autoimmunité et de l’immunité antitumorale
2.4.4 Rôle émergent de p73 dans les fonctions immunes
2.5 Interactions entre NO et la famille p53
2.5.1 Activation de p53 et TAp73 par NO
2.5.2 Régulation de la synthèse de NO par p53
OBJECTIFS DES TRAVAUX
MATERIEL ET METHODES
CONCLUSION
